Т-клеточное звено адаптивного иммунитета характеризуется способностью специфически распознавать антигены посредством высокоспециализированного Т-клеточного рецептора (ТКР), представляющего собой αβ-гетеродимер в доминирующем типе Т-клеток и имеющего уникальную структуру у каждого индивидуального клонотипа. В результате внутритимусного развития и селекции формируется периферический репертуар ТКР, способный эффективно взаимодействовать с собственными молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), презентирующими чужеродный пептид или пептид эндогенного мутантного белка [1]. При этом значительная часть, если не все клоны периферических Т-клеток, аллореактивны [2], т. е. могут реагировать на аллогенные молекулы МНС и ассоциированные с ними пептиды [3–5]. В ответ Т-клеточного репертуара реципиента на индивидуальный аллогенный трансплантат может быть вовлечено до 10% Т-клеток [6].

Аллореактивные Т-клетки — ключевые медиаторы трансплантационного иммунитета, которые опосредуют острое отторжение аллотрансплантата [7]. На сегодняшний день имеются противоречивые данные о том, определяет ли разнообразие репертуара ТКР интенсивность аллогенного ответа [8]. Так, в ряде работ показано, что исходное высокое разнообразие репертуара ТКР реципиента создает повышенный риск острого отторжения аллогенного трансплантата [9, 10]. Между тем было установлено, что в отторжение трансплантата вовлекается узкий олигоклональный репертуар [11–13].

Экспериментальные модели, предполагающие трансплантацию реципиенту опухоли с отличиями по одному трансплантационному антигену [14, 15], позволяют исследовать динамику и особенности развития аллогенного иммунного ответа in vivo. В результате прямого распознавания аллогенных молекул MHC I класса индуцируется интенсивный цитотоксический CD8⁺-иммунный ответ и происходит быстрое отторжение аллогенной опухоли с формированием иммунологической памяти [14–16]. Для подтверждения ранее полученных нами данных о зависимости эффективности аллогенного иммунного ответа от широты разнообразия репертуара ТКР [14] в настоящей работе использовали мышей с трансгенной экспрессией β-цепи ТКР (ТКРβ) гибридомы 7, описанной ранее [17]. Трансгенез ТКРβ дает возможность экспериментально сокращать разнообразие рецепторов Т-лимфоцитов [14, 18]: в силу правила аллельного исключения экспрессия трансгенной ТКРβ блокирует перестройку генов и, как следствие, экспрессию собственных β-цепей в Т-клетках. В результате доминирующая часть репертуара представлена клонотипами с инвариантной β-цепью, и разнообразие обеспечивается только за счет эндогенных α-цепей в структуре рецептора.

Цель работы — используя ТКРβ-трансгенную модель, проанализировать развитие иммунного ответа на опухолевые аллоантигены in vivo в условиях сокращенного клонального разнообразия Т-клеток.   

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самок мышей инбредных линий CBA/Lac (H-2^k) и C57BL/6 (H-2^b) (6–8 недель, 18–20 г) и трансгенных мышей 7В из разведения «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России. Трансгенные мыши 7B были получены, как описано ранее [18]. Исходно трансген был переведен на генетическую основу мышей линии C57BL/6. В связи с ограниченным временем жизни полученных животных, создающим препятствия для их разведения, трансген был переведен на генетическую основу линии CBA/Lac и сохраняется в собственной коллекции лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина». Трансгенные мыши 7В характеризуются экспрессией β-цепи ТКР, специфичного к мутантной молекуле MHC I класса K^bm3 и молекуле МНС II класса I-A^b [17]. Животных содержали при температуре 20–24 °С при 40% относительной влажности, 12-часовом световом режиме и свободном доступе к корму и воде. Трансгенным мышам 7B и контрольным животным (нетрансгенным сибсам, дикий тип) трансплантировали внутрибрюшинно клетки лимфомы EL-4 (H-2K^b)  в дозе 1 × 10⁶ клеток/мышь в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и оценивали продолжительность жизни мышей со сроком наблюдения более 30 дней. Кривые выживаемости Каплана–Мейера строили при помощи SRplot [19]. Часть животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации на 12-й день после трансплантации клеток EL-4 и извлекали клетки брюшной полости. Полученные образцы клеток лаважа анализировали методом проточной цитофлуориметрии.

В работе использовали флуоресцентно меченые антитела (BioLegend, США; BD Bioscience, США; BD Horizon, США): CD3 — APC-Cy7, CD8 — Percp-Cy5.5, CD44 — Pacific blue, CD62L — APC, Vb8.3 — PE, Kb — FITC. Пробы клеток (0,5–1 × 10⁶) инкубировали с блокирующими антителами Fc block (клон 2.4G2, BD Pharmingen, США) (10 мин при 4 °C) для предотвращения неспецифического связывания антител, затем окрашивали мечеными антителами (40 мин, 4 °C). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD Bioscience) в программе FACSDiva 6.0 (BD Bioscience). Лейкоциты выделяли по показателям прямого (FSC-A) и бокового (SSC-A) светорассеяния с последующим выделением одиночных клеток по показателям FSC-H против FSC-A. Для окрашивания мертвых клеток использовали набор LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain (Invitrogen, США). Мертвые клетки исключали из анализа по окрашиванию Yellow Dead Cell Stain и по показателям светорассеяния. Экспрессию поверхностных маркеров оценивали в популяции живых одиночных лейкоцитов. Относительное количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную β-цепь ТКР, оценивали по окрашиванию анти-Vb8.3 антителами (семейство Vβ, к которому принадлежит трансгенная β-цепь 7В). Относительное количество опухолевых клеток EL-4 в брюшной полости экспериментальных животных определяли по экспрессии молекулы MHC I класса H-2K^b (Kb). Анализ популяций Т-лимфоцитов проводили после исключения Kb-позитивных клеток. Данные обрабатывали в программе Flow Jo 7.6 (TreeStar Inc., США). Стратегия цитофлуориметрического анализа представлена на рис. 1.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента, дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного теста Тьюки (post-hoc Tukey test). Предварительно осуществляли проверку нормальности распределения выборок с использованием теста Колмогорова–Смирнова для подтверждения корректности использования указанных статистических методов. Статистический анализ проводили с использованием онлайн-ресурса SRplot [19]. Различия признавали значимыми при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как было отмечено выше, трансгенез β-цепи ТКР существенно сокращает разнообразие репертуара рецепторов периферических Т-клеток. Для выяснения особенностей функционирования Т-клеточного иммунитета в условиях сниженного разнообразия клонотипов исследовали развитие иммунного ответа трансгенных мышей 7B (H-2^k) на клетки аллогенной лимфомы EL-4 (H-2K^b) in vivo. Т-лимфоциты по месту локализации опухолевых клеток (в брюшной полости) анализировали на 12-й день после трансплантации EL-4. В норме к этому дню наблюдается пик иммунного ответа цитотоксических Т-клеток на аллоантигены лимфомы EL-4 [14, 16].

В брюшной полости иммунизированных мышей 7В (TG⁺EL-4) было отмечено увеличение абсолютного количества клеток на два порядка по сравнению с интактными (неиммунизированными) трансгенными мышами (TG) и в 20 раз по сравнению с иммунизированными животными дикого типа (WT⁺EL-4) (рис. 2А). Лаваж иммунизированных 7В содержал более 90% клеток EL-4 (Kb+), тогда как у контрольных мышей (WT⁺EL-4) на данном сроке аллогенная опухоль была практически полностью элиминирована, и доля Kb⁺-клеток составила всего 5% (рис. 2Б).

Мыши 7B оказались не способны отторгнуть аллогенную лимфому EL-4, и в среднем через 19 дней наступала гибель 100% трансгенных животных (рис. 3). Стоит при этом отметить, что у 7B наблюдалась более пролонгированная динамика гибели по сравнению с мышами C57BL/6, для которых EL-4 является сингенной и убивает животных за 10–12 дней (рис. 3). Это указывает на то, что у трансгенных мышей 7В ответ на аллогенную лимфому EL-4 проходит через, хоть и недостаточно эффективные, стадии элиминации и равновесия, предшествующие избеганию опухолевыми клетками иммунологического надзора.

Активный иммунный ответ мышей дикого типа на клетки EL-4 (WT⁺EL-4) сопровождался накоплением Т-клеток, относительное количество которых возросло в среднем в 4 раза (рис. 4А, Б), и увеличением доли цитотоксических CD8⁺-клеток в 5 раз по сравнению с интактным контролем (WT) (рис. 4В, Г). Данный эффект не наблюдался у иммунизированных трансгенных мышей (TG⁺EL-4), и относительное количество Т-лимфоцитов (рис. 4А, Б) и CD8⁺-Т-клеток (рис. 4В, Г) не было увеличено по сравнению с контрольной группой без иммунизации (TG). Однако стоит отметить, что соотношение CD8⁺Тклеток, экспрессирующих трансгенную β-цепь ТКР (Vb8.3⁺) или эндогенные β-цепи ТКР (Vb8.3^–), в брюшной полости иммунизированных 7B (TG⁺EL-4) составило примерно 1:1 по сравнению с 2:1 в группе контроля (TG) (рис. 4Д, Е), что указывает на вовлечение обеих субпопуляций цитотоксических Т-клеток в ответ на клетки EL-4.

В соответствии с этим у иммунизированных мышей 7В было выявлено увеличение доли эффекторных (CD44⁺CD62L^–) CD8⁺ Т-клеток с трансгенной ТКРβ в 1,8 раза (рис. 5А, Б) и эффекторных CD8⁺Т-клеток с эндогенными ТКРβ в 1,5 раза (рис. 5В, Г) по сравнению с соответствующими субпопуляциями CD44⁺CD62L^– Т-клеток интактных трансгенных мышей (TG). Между тем, относительное количество Vb8.3⁺ и Vb8.3^– CD8⁺эффекторов в брюшной полости иммунизированных трансгенных мышей (TG⁺EL-4) было в 1,5–1,7 раза ниже по сравнению с иммунизированными животными дикого типа (WT⁺EL-4) (50–56% против 84–86%) (рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты настоящего исследования указывают на развитие слабого иммунного ответа in vivo на аллоантигены у трансгенных мышей 7В с формированием небольшого пула эффекторных цитотоксических Т-клеток, что согласуется с данными нашей ранней работы с использованием другой ТКРβ-трансгенной модели [14].

В ряде работ было показано, что ТКРβ-трансгенные животные сохраняют способность отвечать на различные антигены, в том числе аллогенные молекулы МНС [20, 21]. Это указывает на высокую пластичность репертуара ТКP, позволяющую компенсировать значительное сокращение разнообразия клонотипов, обусловленное экспрессией трансгенной β-цепи [20, 21]. Однако интенсивность иммунного ответа у ТКРβ-трансгенных мышей снижена по сравнению с животными дикого типа [14, 20, 21] из-за небольшой частоты отвечающих клонов Т-клеток [20, 22], и, как следствие, у таких животных отмечается замедленная динамика развития Т-клеточных ответов in vivo [21]. Важно при этом, что формирующийся цитотоксический CD8⁺-иммунный ответ ТКРβ-трансгенных мышей на аллогенную молекулу MHC I класса (H-2K^b) оказывается недостаточным для отторжения аллогенной опухоли (рис. 4, рис. 5) [14]. Таким образом, ответ даже на сильный трансплантационный антиген становится малоэффективным вследствие сужения разнообразия репертуара ТКР. 

В этом отношении распознавание антигенов аллогенной опухоли подчиняется тем же законам, что и распознавание опухолевых антигенов в комплексе с собственными молекулами МНС. Известно, что эффективность противоопухолевого ответа и, как следствие, устранения трансформированных клеток во многом определяется мутационной нагрузкой опухоли, т. е. ее иммуногенностью [23, 24], и клональным разнообразием Т-клеток, способных распознать опухолевые неоантигены или опухольассоциированные антигены [24, 25]. Было показано, что высокое разнообразие репертуара ТКР рециркулирующих Т-клеток периферической крови служит благоприятным прогностическим фактором, например, при меланоме [26], немелкоклеточном раке легкого [27, 28], раке молочной железы [29], а низкое разнообразие ТКР опухольинфильтрирующих Т-клеток ассоциировано с плохим прогнозом при раке желудка и некоторых других типах рака [30–32].

Естественные процессы старения иммунной системы, особенно инволюция тимуса и клональная экспансия клеток памяти на периферии, вызывают сокращение разнообразия репертуара ТКР Т-лимфоцитов [33–35], что обусловливает большую предрасположенность пожилых людей к инфекциям и онкологии [33, 36]. Кроме того в экспериментальной модели было показано, что у мышей в возрасте 12 месяцев снижены ответы на аллоантигены также вследствие возраст-ассоциированного сужения репертуара клонотипов Т-клеток [34,  37].

Полученные в данном исследовании результаты подтверждают установленную ранее [14] прямую зависимость эффективности иммунного ответа на опухолевые аллоантигены от широты репертуара зрелых Т-лимфоцитов.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе показано, что у трансгенных мышей 7В развивается иммунный ответ in vivo, недостаточно эффективный, чтобы элиминировать клетки аллогенной опухоли. Из-за экспрессии трансгенной β-цепи ТКР снижаются количество и частота клонотипов цитотоксических Т-клеток, способных распознавать аллогенные молекулы МНС. При этом опухолевый процесс у трансгенных мышей 7В проходит через все стадии иммуноредактирования — от малоэффективных стадий элиминации и равновесия до избегания опухолевыми клетками иммунного ответа. Полученные данные согласуются с результатами наших ранних работ и подтверждают, что вследствие ограничения разнообразия репертуара ТКР не происходит отторжения аллогенной опухоли, а наблюдается ее прогрессирование. В этом случае развивающийся у аллогенного реципиента слабый иммунный ответ способствует селекции наименее иммуногенных злокачественных клонов, являясь, таким образом, движущим фактором иммуноредактирования опухоли.