Метаболически ассоциированная жировая болезнь печени (МАЖБП) — хроническое неинфекционное, медленно прогрессирующее мультифакториальное заболевание, чрезвычайно распространенное в мире и в России в частности. По последним данным, распространенность МАЖБП в России и в мире составляет 29–35% среди взрослого населения [1, 2].

Согласно современным представлениям, сложный патогенез МАЖБП включает в себя формирование инсулинорезистентности, нарушение аутофагии, липотоксичность, воспаление, дисбаланс цитокинов и адипокинов, активацию иннантного иммунитета и микробиоты, воздействие экологических и генетических факторов [3, 4]. По стадиям выделяют ряд клиникоморфологических форм МАЖБП: стеатоз, метаболически ассоциированный стеатогепатит (МАСГ) (с фиброзом или без) и цирроз печени (ЦП) [3]. Стеатоз печени (СП) характеризуется доброкачественным клиническим течением, тогда как МАСГ отличается прогрессирующим течением с возможным развитием ЦП и гепатоцеллюлярной карциномы. Ранний МАСГ длительное время протекает бессимптомно, однако его многолетнее течение, несмотря на минимальные отклонения в рутинных лабораторных показателях состояния печени, приводит к развитию целого ряда коморбидных патологий (сахарный диабет 2-го типа, гипертоническая болезнь, хроническая болезнь почек и др.), которые ухудшают как трудовой прогноз пациентов, так и прогноз для жизни. Наряду с этим, механизмы прогрессирования МАЖБП остаются мало изученными [4]. Среди ключевых проблем современной гастроэнтерологии — проблема поиска альтернатив биопсии печени для дифференциации МАСГ от СП [5].

Известно, что при МАЖБП имеет место тесная взаимосвязь процессов воспаления, апоптоза и фиброза, и важную роль в интеграции этих процессов играют иммунные клетки и цитокины [6–8]. Многие авторы убедительно продемонстрировали взаимосвязь фрагментированного цитокератина-18 (ФЦК-18) с лабораторными и гистологическими признаками воспаления при МАСГ [9, 10].

Одним из перспективных направлений в ограничении воспаления в настоящее время является исследование баланса АТФ–аденозин. Внеклеточный АТФ высвобождается из клетки при некрозе, апоптозе или гипоксии, направляет фагоциты в места воспаления, приводит к активации инфламмасомы с последующим высвобождением провоспалительных цитокинов. Внеклеточный аденозин затем действует как ограничитель воспаления и тканевого повреждения, оказывая противовоспалительное действие [11]. Ключевыми ферментами в образовании внеклеточного аденозина являются эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза 1 (ENTPD1, или СD39), которая расщепляет ATФ и AДФ до AMФ, и экто-5'-нуклеотидаза (NT5E, или CD73), которая из АМФ образует аденозин.

Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что CD39 и CD73 играют важную роль в заболеваниях печени [12–14]. Показано, что делеция CD39 в экспериментальных моделях является причиной инсулинорезистентности и обострения воспаления в печени [15]. Кроме того, показана роль дефицита CD39 в повреждении желчных протоков и фиброзе посредством привлечения цитотоксических Т-клеток [16]. Недостаток аденозинового рецептора A2A, как в макрофагах, так и в гепатоцитах сопровождался усилением тяжести МАЖБП, вероятно, за счет усиления воспаления и липогенеза [17]. Дефосфорилируя ATФ до аденозина, эктонуклеотидазы CD39 и CD73 играют защитную роль, предотвращая местное и системное воспаление. Значение этого механизма при МАЖБП не исследовано. Целью работы было оценить уровни мРНК генов ENTPD1 и NT5E, кодирующих CD39 и CD73 соответственно, у больных разными формами МАЖБП (СП, МАСГ), а также оценить содержание CD39- и CD73экспрессирующих клеток при активации иммунных клеток in vitro.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 56 больных МАЖБП: 31 человек с простым стеатозом печени (группа СП) и 25 человек с МАСГ умеренной и высокой активности (группа МАСГ). Контрольную группу составили 29 здоровых человек.

Критерии включения в контрольную группу: нормальный ИМТ, нормальные функциональные печеночные тесты, нормальная структура печени при сонографии и нормальная жесткость печени.

Критерии исключения из контрольной группы: наличие кардиометаболических факторов риска, установленный диагноз НАЖБП, прием лекарственных препаратов.

Критерии исключения, общие для изучаемых групп: перенесенные в последний месяц инфекционновоспалительные заболевания, беременность и лактация, курение, употребление алкоголя.

Критерии включения пациентов в исследование: установленный диагноз НАЖБП (СП или НАСГ), наличие хотя бы одного кардиометаболического фактора риска.

Критерии исключения пациентов НАЖБП из исследования: вирусный генез поражения печени на основании отсутствия серологических маркеров HBV-, HCV-инфекции; аутоиммунный генез — на основании отсутствия аутоантител к структурам гепатоцитов; алкогольный генез — на основании анамнестических, клинических данных, данных шкал CAGE, AUDIT; лекарственный генез — на основании анамнестических данных; сахарный диабет 1-го и 2-го типов; цирроз печени; гепатотропная или иная терапия, проводимая на момент забора материала для исследования.

Здоровые доноры и пациенты МАЖБП были обследованы врачами терапевтического отделения ЧУЗ КБ «РЖД-медицина» (г. Петрозаводск). Диагноз МАЖБП с определением формы (СП, МАСГ) устанавливали на основании традиционных клинических, лабораторных, инструментальных и гистологических данных, согласно клиническим рекомендациям [3]. Все пациенты имели признаки метаболического синдрома. У всех пациентов имелся хотя бы один кардиометаболический фактор риска, чаще всего — дислипидемия (у 64% СП и 93% МАСГ) и висцеральное ожирение — у всех 100% пациентов (ИМТ (индекс массы тела) > 25  кг/м²). Пациентам выполняли ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости на аппарате Vivid Pro-7 (General Electric, США), которое выявляло усиление эхогенности ткани печени, превышающее эхогенность правой почки. Оценивали жесткость печени при эластометрии методом сдвиговой волны ARFI на аппарате Mindray DC-80 (Mindray, Китай). Ни у кого из пациентов не было признаков портальной гипертензии — отсутствовал асцит, при эзофагогастроскопии не выявлялись варикозные вены пищевода и кардиального отдела желудка. Больным выполняли слепую чрескожную биопсию печени с оценкой гистологической активности и фиброза по методу Brunt et al. [18], на основании которой верифицировали форму МАЖБП: стеатоз (≥ 5% гепатоцитов) без воспаления и баллонной дистрофии гепатоцитов или стеатогепатит с наличием активного повреждения в форме гепатоцеллюлярной баллонной дегенерации и долькового воспаления (в основном лимфоцитарного с некоторым количеством нейтрофилов), в дополнение к различной степени стеатоза. По результатам гистологического исследования, у всех пациентов фиброз не превышал стадию F2.

В качестве материала для исследования использовали образцы венозной крови, собранной из локтевой вены натощак в пробирки с антикоагулянтом К2ЭДТА. Клиниколабораторная оценка печеночных функциональных проб, выделение лейкоцитов периферической крови (ЛПК) и плазмы, а также анализ содержания клеток, экспрессирующих СD39, выполняли в течение часа после забора крови. Плазму крови, тотальную РНК, выделенную из ЛПК, и полученные осаждением на градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077 г/см³; Биолот) мононуклеарные клетки (МНК) помещали в биобанк на хранение (не более 3 месяцев) при температуре –80 °С. Взятие материала у пациентов проводили в период госпитализации до назначения терапии, за 2–3 дня до биопсии печени и эластометрии.

Оценка печеночных функциональных проб: уровня аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), общего билирубина, щелочной фосфатазы (ЩФ), глюкозы, общего холестерина (ОХС), ЛПВП, триглицеридов, C-реактивного белка (СРБ) — проведена на анализаторе Random Access F-15 (BioSystems, Испания) с использованием реактивов фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Уровень ЛПНП рассчитывали по формуле Фридвальда. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) определяли методом Вестергрена.

Методом ИФА в плазме крови определяли концентрацию тканевого полипептид-специфического антигена (показателя апоптоза гепатоцитов ФЦК-18), фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) и интерлейкина-6 (ИЛ-6) на планшетном мультимодальном ридере SuPerMax 3100 (Flash Spectrum, Китай). Использовали тест-системы «TPS ELISA» (Biotech, Швеция), «Human TNFα Platinum ELISA» (eBioscience, Австрия), «Интерлейкин-6 – ИФА – Бест» («Вектор-Бест», Россия).

Тотальную РНК из ЛПК выделяли с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия). Относительный уровень транскриптов генов ENTPD1 и NT5E в ЛПК оценивали с помощью ПЦР в режиме реального времени на приборе Light Cycler (Roshe, Германия) с использованием набора qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия). Праймеры для амплификации гена ENTPD1 — прямой 5'-AGCAGCTGAAATATGCTGGC-3', обратный 5'-GAGACAGTATCTGCCGAAGTCC-3'; для гена NT5E — прямой 5'- ATTGCAAAGTGGTTCAAAGTCA-3', обратный 5'-ACACTTGGCCAGTAAAATAGGG-3'. В качестве референсного использовали ген 18S rRNA праймеры к которому — прямой 5'-AGAAACGGCTACCACATCCA-3', обратный 5'-CACCAGACTTGCCCTCCA-3'. Условия проведения ПЦР были следующие: денатурация кДНК 5 мин 95 °С; 40 циклов: денатурация при 95 °С 30 с, отжиг при  температуре 64 °С 30 с, элонгация при 72 °С 30 с. Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР-фрагментов. Повторность при ПЦРанализе — трехкратная. Относительный уровень транскриптов оценивали по Livak and Schmittgen [19].

Оценку относительного содержания клеток исследуемых популяций проводили на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Образцы крови или клеточную суспензию окрашивали FITC-, PE-, РerCP-, PE-C7-меченными моноклональными антителами против CD39, CD4, CD25, CD161 и CD14 антигенов, а также соответствующими изотипическими контролями (Sony Biotechnology, США и eBioscience, США). Эритроциты были лизированы реагентом FACS Lysing Solution (BD Biosciences, США). Для определения CD39- и CD73-экспрессирующих клеток был использован контроль FMO (fluorochrome minus one). Абсолютное количество клеток определяли исходя из данных клинического анализа крови. 

Для оценки влияния активации на содержание CD39⁺- и CD73⁺-клеток выделенные МНК больных МАСГ (n = 6) и здоровых доноров (n = 6) высаживали в 48-луночные планшеты (3–5 × 10⁵ клеток на лунку) в среде RPMI-1640 (Servicebio), дополненной 10% термоинактивированной ЭТС, Биолот), L-глутамином (2 мМ), пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (100 мг/мл) (Servicebio) при 37 °C в 5% CO₂ в течение 24 ч. Клетки активировали классическими стимуляторами: для лимфоцитов использовали ФГА в конечной концентрации 10 мкг/мл (Биолот), для моноцитов — ЛПС (Пирогенал, МЕДГАМАЛ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) в концентрации 1 мкг/мл.

Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPad Prism v.8. (GraphPad Software Inc.; San Diego, CA, США). Данные на графиках представлены в виде Ме (Q₁–Q₃). Значения р < 0,05 рассматривали как статистически значимые. В связи с несоответствием распределений показателей в группах нормальному (согласно критерию W Шапиро–Уилка), использовали непараметрические критерии для анализа. При сравнении изучаемых показателей в группах использовали критерий H Краскела–Уоллиса с последующим парным сравнением групп с помощью критерия U Манна–Уитни. Парное сравнение связанных показателей выполнили с использованием Т-критерия Уилкоксона. Взаимосвязь показателей оценивали с помощью расчета рангового коэффициента корреляции Спирмена (r). Для оценки силы связи между двумя величинами использовали шкалу Чеддока.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-лабораторная характеристика пациентов СП, МАСГ и здоровых людей представлена в табл. 1. У пациентов МАСГ по сравнению с СП повышен уровень активности аминотрансфераз в крови, клинических маркеров воспаления (СРБ, СОЭ), ЛПНП, а также концентрация ФЦК-18 (табл. 1, табл. 2). Уровень основных провоспалительных цитокинов (ФНОα, IL-6) в плазме крови пациентов МАЖБП выше, чем у здоровых людей, при этом нет различий между формами заболевания (табл. 2).

Проведен сравнительный анализ уровней мРНК гена ENTPD1, кодирующего эктонуклеотидазу CD39, и гена NT5E, кодирующего фермент CD73, в ЛПК пациентов МАЖБП и здоровых доноров. По результатам дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса, группы исследования статистически значимо различаются по уровню мРНК гена ENTPD1 (H = 8,830, p = 0,012), но не по уровню мРНК гена NT5E (H = 0,618, p = 0,734) (рис. 1). Показано, что уровень экспрессии гена ENTPD1 у пациентов МАСГ ниже, чем у здоровых людей и пациентов с СП. При этом при СП уровень мРНК гена ENTPD1 не отличается от контроля (рис. 1А).

Поскольку достоверные различия между группами исследования выявлены в отношении экспрессии гена ENTPD1, далее мы провели корреляционный анализ уровня мРНК гена ENTPD1 у пациентов с МАЖБП и здоровых доноров с комплексом биохимических показателей крови (помимо рутинных клинических показателей, с концентрацией ФЦК-18 и провоспалительных цитокинов, ФНОα и IL-6 (табл. 1 и табл. 2)). Установлена умеренная положительная взаимосвязь относительного уровня мРНК гена ENTPD1 с уровнем ЛПНП в крови пациентов СП (r = 0,379, p = 0,039).

Обследованные нами группы МАЖБП не отличались по содержанию лимфоцитов и моноцитов в крови от контроля (табл. 1). Однако в связи с полученными данными (рис. 1) следующей задачей было оценить содержание эктонуклеотидазы CD39 на ЛПК при МАЖБП. Известно, что CD39 содержится на поверхности многих иммунных клеток [20]. В работе анализировали частоту встречаемости CD39⁺-клеток для гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов. Среди лимфоцитов исследовали количество CD39⁺Tклеток в целом в популяции CD4⁺-Т-хелперов и на их отдельных субпопуляциях — иммуносупрессорных Treg-клетках (CD4⁺CD25^hi) и провоспалительных Th17 (CD4⁺CD161⁺). Данные представлены в табл. 3 и на рис. 2.

Показано, что в группе МАСГ достоверно снижено относительное содержание CD39⁺-моноцитов по сравнению с контролем и с группой СП (табл. 3, рис. 2). Гранулоциты, как у больных, так и у здоровых доноров практически все были CD39-положительными (табл. 3). У больных МАСГ также наблюдали пониженное относительное и абсолютное содержание CD39⁺-лимфоцитов по сравнению с контролем (табл. 3). Отмечено, что содержание CD39⁺ Treg-клеток было выше в группе МАСГ по сравнению со здоровыми донорами (рис. 2). Примечательно, что количество самих Treg-клеток у больных СП (p = 0,007) и МАСГ (p = 0,013) было ниже, чем в контроле.

Чтобы выяснить, связана ли экспрессия эктонуклеотидаз CD39 и CD73 на моноцитах и лимфоцитах у больных МАСГ с активацией, клетки больных МАСГ и здоровых доноров (контроль) были стимулированы и проанализированы через 24 ч на проточном цитометре. Определяли содержание CD39- и CD73-положительных клеток в гейтах лимфоцитов, CD4⁺ Т-клеток и CD14⁺-моноцитах. Кроме того, определяли медиану интенсивности флюоресценции (MFI) для CD39 и CD73, которая отражает плотность экспрессии антигенов на клетках. Результаты представлены на рис. 3.

Известно, что в норме при активации лимфоцитов, в особенности Т-клеток, ферментативная активность CD39 и количество СD39⁺-клеток увеличивается [21]. В работе мы наблюдали повышение числа CD39⁺-клеток в культуре лимфоцитов, в частности среди CD4⁺-Т-клеток, с добавлением митогена в контроле и при МАСГ (рис. 3А). Изменения в CD39 MFI были отмечены только в гейте лимфоцитов, как в контроле, так и при МАСГ (рис. 3В). Отмечено, что на содержание CD14⁺CD39⁺-моноцитов присутствие ЛПС не оказывало влияния (рис. 3А).

При анализе числа CD73⁺-клеток при активации МНК пациентов с МАСГ и здоровых доноров (рис. 3Б) выявлены достоверные различия в содержании CD73⁺-клеток при активации лимфоцитов и CD14⁺-моноцитов пациентов с МАСГ: после добавления стимулятора количество несущих на своей поверхности CD73-клеток увеличивалось (рис. 3Б) в отличие от здоровых доноров, у которых достоверные изменения в числе CD73⁺-клеток были отмечены только для CD4⁺-Т-клеток. Повышение CD73 MFI наблюдали после активации в гейте лимфоцитов (рис. 3Г) у здоровых и у пациентов с МАСГ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В основе прогрессирования печеночно-клеточной недостаточности при МАЖБП лежат иммуновоспалительные процессы, важнейшая роль в реализации которых принадлежит лейкоцитам [6, 8]. Известно, что в периферической крови эктонуклеотидазы CD39 и СD73 содержатся на поверхности разных иммунных клеток. Кроме того, экспрессия фермента может быть индуцирована воздействием окислительного стресса и гипоксии, а также провоспалительными цитокинами [22]. Уровень эктонуклеотидаз, определенный в основном посредством экспериментальных моделей, описан при некоторых острых и хронических патологиях печени [22]. Однако экспрессия CD39 и CD73 в крови больных МАЖБП и на отдельных популяциях иммунных клеток не была исследована. В связи с этим, нами проведена сравнительная оценка экспрессии эктонуклеотидаз на уровне мРНК и на поверхности ЛПК пациентов с разными формами МАЖБП (СП, МАСГ).

Показано, что на стадии простого СП уровень мРНК гена ENTPD1 и содержание данного фермента на поверхности ЛПК находятся на уровне контроля. При МАСГ экспрессия CD39, как на уровне мРНК в ЛПК, так и на уровне белка на поверхности моноцитов, достоверно ниже, чем при СП и контроле (рис. 1, рис. 2, табл. 3). Кроме того, в работе установлено, что изменение числа CD39⁺клеток происходит среди моноцитов, а также Treg-клеток пациентов с МАСГ. Отмечено, что число CD39⁺-клеток среди Treg-клеток пациентов с МАСГ было выше, чем в контроле, однако содержание самих Treg-клеток у этих пациентов было снижено. Вероятно, усиление экспрессии CD39 на поверхности этих клеток связано с компенсацией их низкого количества, поскольку генерация внеклеточного аденозина, посредством продукции CD39, является одним из основных механизмов Treg-ассоциированной иммуносупрессии [20]. И их количества в крови больных МАСГ недостаточно, чтобы повлиять на функционирование провоспалительных клеток.

Кроме того, в работе показано, что уровень CD14⁺CD39⁺моноцитов у пациентов с МАСГ не восстанавливается до уровня CD14⁺CD39⁺-моноцитов здоровых доноров при активации клеток in vitro (рис. 3). В литературе отмечается, что низкая экспрессия CD39 на моноцитах может иметь неблагоприятное значение. Так, пониженное содержание CD39⁺-моноцитов описывается как потенциальный диагностический биомаркер и предиктор неблагоприятного прогноза у пациентов с сепсисом [23].

Снижение экспрессии CD39 при МАСГ может приводить к снижению внеклеточной деградации ATФ и AДФ и, как следствие, к снижению уровня противовоспалительного аденозина, что может способствовать прогрессированию воспаления и инсулинорезистентности. Это предположение подтверждается данными о патологическом влиянии дефицита ENTPD1/CD39 на данные процессы при повреждении печени  [15, 16].

При изучении активности CD39 в тромбоцитах пациентов с гиперхолестеринемией [21] было показано, что гиперхолестеринемия (в том числе повышение уровня ЛПНП) связана с усилением воспалительной реакции, окислительного стресса и гидролиза АТФ и АДФ. Увеличение активности CD39 авторы объяснили компенсаторным ответом на воспалительное и прооксидантное состояние, связанное с гиперхолестеринемией [24]. Интересно, что на ранней стадии МАЖБП — СП в условиях накопления липидов гепатоцитами и низкоуровнего субклинического воспаления нами не зарегистрировано снижение экспрессии CD39 в периферической крови по сравнению с контролем, при этом установлена умеренная положительная корреляция уровня мРНК гена ENTPD1 с уровнем ЛПНП. Ранее были получены доказательства связи холестеринового обмена и активности CD39. In vitro было показано, что снижение уровня холестерина в мембране клеток приводит к ингибированию ферментативной и антиагрегантной активности CD39, а обработка мембран холестерином полностью восстанавливает функцию фермента [25].

Однако, в отличие от пациентов с СП, у пациентов с МАСГ при выраженном воспалении и изменениях липидного статуса корреляция уровня мРНК гена ENTPD1 с концентрацией липидов крови не обнаружена, но выявлено снижение экспрессии CD39 в периферической крови относительно контроля и СП. Вероятно, при МАСГпрогрессирующее воспаление приводит к нарушению компенсаторных механизмов, поддерживающих дефосфорилирование АТФ до аденозина при повреждении печени. Изменения в экспрессии эктонуклеотидазы CD39 могут быть обнаружены и для других популяций иммунных клеток, так в данной работе не рассматривались B-клетки, которые преимущественно экспрессируют CD39 среди лимфоцитов, а также NK-клетки и CD8⁺-Т-клетки.

ВЫВОДЫ

Таким образом, у пациентов с МАСГ показатели воспаления (COЭ, СРБ, уровень IL-6 и ФНОα) выше по сравнению со здоровыми донорами. Наряду с этим в работе показано, что при МАСГ экспрессия эктонуклеотидазы CD39 снижена как на уровне мРНК в ЛПК, так и на уровне фермента на поверхности моноцитов и лимфоцитов. Недостаток фермента на поверхности иммунных клеток может приводить к накоплению внеклеточного АТФ и поддерживать тем самым процесс воспаления. В связи с полученными данными представляется перспективным дальнейшее изучение эктонуклеотидазы CD39 в качестве диагностического и прогностического маркера при МАЖБП.