Энтеровирусы представляют собой разнообразную группу небольших безоболочечных вирусов с несегментированным (+)-РНК-геномом, включающую патогенные и условнопатогенные для человека вирусы видов Enterovirus alphacoxsackie (EV-A), Enterovirus betacoxsackie (EV-B), Enterovirus coxsackiepol (EV-C), Enterovirus deconjuncti (EV-D). В то время как полиовирусы, способные вызывать тяжелые формы нейропатогенеза, находятся  на грани ликвидации, неполиомиелитные энтеровирусы различных видов, включающие вирусы Коксаки, эховирусы и нумерованные энтеровирусы, широко распространены и вызывают разнообразные клинические формы энтеровирусной инфекции (ЭВИ), в том числе  энтеровирусный везикулярный стоматит с экзантемой (HFMD), различные виды экзантем, герпетическую ангину (энтеровирусный везикулярный фарингит), заболевания верхних и нижних дыхательных путей, геморрагический конъюнктивит, инфекции желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), эпидемическую миалгию, миоперикардит, нейроинфекции (энцефалит, менингит, острый вялый миелит) и другие формы заболеваний.

Установлена определенная корреляция между видами энтеровирусов и характерными для них клиническими проявлениями. Энтеровирусы вида EV-A преимущественно вызывают HFMD и герпетическую ангину. Энтеровирусы вида EV-B (Коксаки В, ЕСНО) являются доминирующими возбудителями энтеровирусного менингита. Энтеровирус D68 (вид EV-D) в основном поражает верхние и нижние дыхательные пути. Однако следует учитывать, что клиническая картина при одном типе энтеровируса может варьироваться значительно в зависимости от состояния иммунитета и других индивидуальных особенностей пациента.  Около 85% случаев ЭВИ протекают бессимптомно, около 12–14% диагностируют как легкие формы и только 1–3% имеют тяжелое течение [1, 2].  Клинические проявления ассоциированы также с определенными возрастными группами. У взрослых пациентов заболевание часто протекает как легкая респираторная или кишечная инфекция, у детей развивается HFMD, герпетическая ангина, экзантемы. К тяжелым неврологическим формам, таким как энтеровирусный менингит, предрасположены дети 3–14 лет [2].

Наблюдения за ЭВИ показывают, что существуют различные модели циркуляции отдельных типов энтеровирусов, например, ECHO 9, ECHO 30, EV-D 68 имеют тенденцию к вспышкам, тогда как СV-B4 и некоторые другие типы имеют относительно стабильную циркуляцию [2, 3].

Смена многообразных эпидемически значимых типов энтеровирусов может быть обусловлена различными факторами, однако она сопровождается изменением уровня заболеваемости и характера клинической картины ЭВИ, что указывает на необходимость постоянного наблюдения за циркуляцией и активностью вируса. Мониторинг активности различных типов и их распространенности позволяет предсказать возникновение вспышек или увеличение случаев тяжелых форм заболеваний [1, 4].

Снижение активности циркуляции энтеровирусов в 2020 г. из-за противоэпидемических мероприятий, связанных с COVID-19, привело к росту доли населения, не имеющего иммунитета к энтеровирусной инфекции, что способствовало более активному распространению инфекции в последующие годы. Так, согласно данным официальной статистики в Российской Федерации (РФ), регистрируется рост заболеваемости ЭВИ, в 2024 г. зарегистрирован 21 491 случай (14,69 на 100 тыс. населения), что превышает средний многолетний показатель (СМП) в 1,5 раза [5].

До пандемии большую значимость в РФ имели энтеровирусы вида EV-B, включая ECHO 30, имеющие высокий риск развития менингитов, однако после снижения циркуляции энтеровирусов в 2020 г. доля EV-B значительно снизилась, отмечается рост заболеваемости, связанный с EV-A, прежде всего  серотипами Коксаки А6 и А10 [2, 6]. По данным молекулярно-генетического мониторинга в РФ доля CV-A6 в отдельные годы достигала 40% [2, 7]. В связи с этим изменилась и структура форм ЭВИ, участились случаи герпангин и экзантем, особенно у детей первых лет жизни [6]. Так в Иркутской области в 2023 г. основной клинической формой ЭВИ являлась герпангина (39,9%) и энтеровирусный везикулярный стоматит с экзантемой (28,9%) [8].

Цель работы — изучение случаев ЭВИ у детей, госпитализированных в стационары Московского региона в период восстановления эпидемического процесса (2021–2023 гг.) для оценки циркуляции различных типов энтеровирусов с учетом вызываемой ими клинической картины инфекции.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования

Для генотипирования энтеровирусов был собран клинический материал от 156 пациентов  различных возрастных групп Детской городской клинической больницы № 9 им. Г. Н. Сперанского (Москва, Россия). Критерий включения в исследование: наличие диагноза энтеровирусной инфекции. Возраст детей — 0–17 лет, 78% пациентов принадлежали возрастным группам 0–3 года и 4–6 лет. Большая часть образцов (n = 122) была собрана в 2022 г., дополнительно в 2021 и 2023 гг. были отобраны 31 и 3 образцов.

Образцы мазков из ротоглотки и носоглотки (n = 137) собирали от пациентов с симптомами ЭВИ или ОРВИ, кал (n = 18) собирали от пациентов с ОКИ. У одного пациента с диагнозом менингит был отобран образец ликвора (n = 1). От каждого пациента исследовали только один вид клинического материала.

Образцы клинического материала собирали и хранили при температуре –70 °С до начала испытания.

Информация о месте проведения исследования

Исследование образцов методом ПЦР на наличие РНК энтеровирусов и других инфекционных агентов проводили на базе лабораторно-диагностического отделения ГБУЗ «ДГКБ № 9 им. Г. Н. Сперанского ДЗМ». Генотипирование энтеровирусов проводили на базе центра постгеномных технологий ФГБУ «ЦСП» ФМБА России.

Пробоподготовка биологического материала

Образцы мазков и ликвора не требовали пробоподготовки перед экстракцией РНК. Для приготовления экстракта кала около 0,1 г (0,1 мл) кала ресуспендировали в 0,8 мл фосфатносолевого буфера (VWR International, LLC, США). Гомогенную суспензию центрифугировали при 10 000 g на центрифуге MiniSpin (Eppendorf, Германия) в течение 5 мин, супернатант над поверхностью осадка объемом 300–400 мкл собирали и хранили при –70 °C для дальнейшего использования.

Подтверждение наличия РНК энтеровирусов и других инфекционных агентов в клиническом материале

Наличие энтеровирусов подтверждали с использованием набора реагентов «АмплиТест® Нейровирусы» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Россия). Наличие сопутствующих инфекций определяли с использованием наборов реагентов АмплиСенс® EBV/CMV/HHV6A/B-cкрин-FL, АмплиСенс® HSV I, II-FL, АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL, АмплиСенс®ОРВИскрин-FL, АмплиСенс® MRSA-скрин-титр-FL, АмплиСенс® Streptococcus pyogenes-скрин/монитор-FL (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Экстракция РНК

Для выделения нуклеиновых кислот из клинического материала использовали набор реагентов для диагностики in vitro «АмплиТест® Магно-Сорб-Комбо» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Россия). Набор основан на методе экстракции нуклеиновых кислот в присутствии частиц магнетизированной силики и рекомендован для экстракции нуклеиновых кислот в автоматическом режиме. Выделение РНК проводили с использованием станции Auto-Pure 96 (Hangzhou Allsheng Instruments Co., Ltd., Китай). При экстракции во все исследуемые образцы добавляли по 10 мкл ВКО IC-R.

Получение кДНК

Обратную транскрипцию образцов РНК проводили с использованием набора реагентов «АмплиТест® Реверта» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Россия).

Амплификация 5’UTR-VP2 и VP1 участков генома энтеровирусов

Область VP1 амплифицировали с использованием универсальных праймеров, рекомендованных для генотипирования энтеровирусов человека EV-A, EV-B, EVC, EV-D. Применяли двухраундовое термоциклирование с парой праймеров SO222 5’-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3’ и SO224 5’-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3’ для первого раунда амплификации и парой праймеров AN88 (5’-TACTGGAC CACCTGGNGGNAYRWACAT-3’) и AN89 (5’-CCAGCACTG ACAGCAGYNGARAYNGG-3’) для второго раунда [9]. Для амплификации участка 5’UTR-VP2 генома энтеровирусов использовали олигонуклеотидные праймеры собственного дизайна — EV_S_for 5’-GTGTAGMTYRGGYYGATGAG-3’ и EV_S_rev 5’-RTCHGGRAAYTTCCAVYACCA-3’.

Электрофоретический анализ ПЦР продуктов и их очистка

Электрофорез ПЦР продуктов проводили в 2%-м агарозном геле. Очистку ПЦР продуктов ДНК осуществляли с использованием магнитных частиц KAPA Pure Beads (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, США). Измерение концентрации нуклеиновых кислот проводили спектрофотометрически на приборе NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, Waltham, MA, США).

Секвенирование участков генома энтеровирусов

Реакцию секвенирования по Сэнгеру осуществляли с использованием реагентов BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) в полном соответствии с протоколом производителя на приборе SimpliAmp Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific). Для секвенирования ПЦР продуктов VP1 и 5’UTR-VP2 использовали внутренние праймеры AN232 5’ CCAGCACTGACAGCA 3’ [9] и EV_S_in 5’ CATGGTGYGAAGAGYCTATTGAGC 3’ соответственно. Анализ полученных флуоресцентно меченых фрагментов проводили на приборе Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific).

Наличие РНК энтеровирусов было подтверждено для 156 образцов клинического материала от детей с диагнозом энтеровирусной инфекции. Генотипирование по двум участкам генома удалось провести для 96 образцов энтеровирусов, результаты типирования VP1 и 5’UTR-VP2 совпали для всех образцов. Для 40 образцов генотипирование проводили только по 5’UTR-VP2-участку, а для 20 образцов по VP1 участку генома.

В базе данных NCBI GenBank были размещены нуклеотидные последовательности фрагмента VP1 (PX468781– PX468895) и региона 5'UTR-VP2 (PX491339–PX491474).

Определение типов энтеровирусов

Использовали ресурсы Enterovirus Genotyping Tool Version 0.1, National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands) [10] и NCBI BLAST [11].

Статистическая обработка данных

Использовали ресурс Medcalс [12] и стандартные функции программы Microsoft Excel (корпорации Microsoft). Для сравнения частоты симптомов между группами рассчитывали точный двусторонний критерий Фишера, различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Для выборок с малым числом наблюдений (n < 10) статистическое сравнение не проводили.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При генотипировании энтеровирусов, полученных из биологического материала от детей выявлено 16 различных типов энтеровирусов, для одного образца удалось установить только вид энтеровируса EV-C. Большинство исследуемых энтеровирусов принадлежали типу EV-A CV-A6, среди образцов 2021 г. их доля составила 80,6%, в 2022 г. — 36,1%. Вторым по распространенности у пациентов с ЭВИ энтеровирусом был CV-A10, количество случаев среди образцов 2021 г. составило 6,5%, а среди образцов 2022 г. 27,0%. Другие EV-A энтеровирусы в нашем исследовании выявлялись значительно реже. Вирус CV-A16 был обнаружен только у одного пациента в 2022 г.

Вирусы EV-B типов CV-A9, CV-B2, CV-B3, CV-B5, ЕСНО 6, ЕСНО 9, ЕСНО 11 были выявлены у 16,0% пациентов в 2021– 2022 гг. Среди них доминировал ECHO 6, его доля в 2022 г. составила 9,0%.

Кроме того, выявлены три образца энтеровируса вида EV-C (два случая CV-A19 и один случай EV-C неустановленного типа) и четыре образца энтеровируса EVD68 вида EV-D. Полученные результаты генотипирования энтеровирусов приведены в табл. 1.

Был проведен анализ взаимосвязи симптомов у пациентов с ЭВИ при инфицировании энтеровирусами различных типов. При инфицировании энтеровирусами вида EV-A (CV-A2, CV-A3, CV-A4, CV-A5, CV-A6, CV-A10, CV-A16) у пациентов наблюдались сходные симптомы — HFMD, экзантемы, заболевания верхних и нижних дыхательных путей, герпетическая ангина, желудочно-кишечные инфекции, острый геморрагический конъюнктивит. При инфицировании энтеровирусами вида EV-B (CV-A9, CV-B2, CV-B3, CV-B5, ЕСНО 6, ЕСНО 9, ЕСНО 11) у пациентов в основном проявлялись неврологические симптомы (менингизм, интенсивная головная боль, рвота) на фоне лихорадки, респираторных и/или кишечных симптомов. У четверых из 11 пациентов с ЕСНО6 инфекцией был диагностирован менингит (рис. 1).

Для достаточно представленных случаев инфекции, вызванных энтеровирусами типов CV-A6 (n = 69) и CV-A10 (n = 35), проведено сравнение частоты различных клинических проявлений (табл. 2). Достоверно показано, что в данном исследовании экзантемы развивались чаще у пациентов с СV-A6-инфекцией, чем при CV-A10 (65,2% vs 25,7%), а герпангина наоборот чаще отмечалась при CV-A10-инфекции (62,9% vs 23,2%).

Была изучена частота выявляемости у пациентов с ЭВИ других инфекционных агентов, в том числе вызывающих клиническую картину, схожую с ЭВИ (экзантемы, респираторные, кишечные или нейроинфекции). Исследование проводили на наличие РНК/ДНК вирусов герпеса 1-го, 2-го, 6-го типов (HSV 1/2, HHV-6), Эпштейна– Барр (EBV), цитомегаловируса (HCMV), риновирусов (HRV), респираторно-синцитиального вируса (RSV), метапневмовируса (HMPV), вирусов парагриппа 1–4-го типов (HPIVs), бокавируса (HBoV), аденовирусов HAdV B, HAdV C, HAdV E и HAdV F (HAdV), коронавирусов ОС43, Е229, NL63, HKUI (HCoVs), ротавируса A, норовируса II геногруппы, астровирусов, ДНК Shigella spp./EIEC, Salmonella spp., Campylobacter spp., Streptococcus pyogenes, Staphylococcus spp, Candida albicans.

Общее количество случаев ЭВИ, сопровождающихся присутствием других инфекционных агентов в различных сочетаниях, составило 29,5%, однако в большинстве случаев не замечено их влияния на тяжесть течения ЭВИ. Наиболее часто выявляли вирус герпеса 6-го типа (HHV-6) — до 17% всех исследованных случаев ЭВИ. В 7% случаев наблюдалась инфекция несколькими возбудителями — смешанная вирусная инфекция, например, CV-A10 /HHV-6/EBV/HCMV, или бактериальновирусная инфекция, например, CV-A6/Astrovirus/ Shigella spp. (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При генотипировании выявленных в 2021–2022 гг. в Московском регионе у детей энтеровирусов было показано, что CV-А6 тип занимает доминирующее положение. Известно, что CV-A6 получил широкое распространение в европейских странах с 2008 г., а затем распространился в Азии и Северной Америке. Отмечаются атипичные формы CV-A6-инфекции, протекающие с необычными кожными проявлениями

(экзантемы, сыпь, экзема, волдыри, онихомадезис) [13, 14]. В 2017 г. уровень распространенности CV-A6 в отдельных странах достигал 71,1% [15], масштабные вспышки зарегистрированы в Бразилии, Вьетнаме, Франции, Китае [16–20]. Доминирующее положение энтеровируса CV-A6 на территории нашей страны подтверждается данными Референс-центра, распространенность CV-A6 среди пациентов с ЭВИ составила — 13% в 2018 г., 29% в 2019 г., 40% в 2021 г., 19% в 2022 г., 34% в 2023, 17% в 2024 г  [2]. По сравнению с классическим вирусом Коксаки CV-A16, бывшим ранее частой причиной HFMD [2, 21], CV-A6инфекция характеризуется большей продолжительностью, атипичными кожными проявлениями, а также неврологическими симптомами [15, 18]. 

В данном исследовании CV-А6 преимущественно вызывал экзантемы и заболевания верхних и нижних дыхательных путей, реже HFMD, герпетическую ангину, желудочно-кишечные инфекции и острый геморрагический конъюнктивит. В четырех случаях у пациентов возрастом до 3 лет (около 6% пациентов с CV-A6) инфекция протекала тяжело, сопровождалась судорогами и потерей сознания на фоне пиретической лихорадки. Из них только в одном случае выявлен сопутствующий инфекционный агент (вирус HHV-6), поэтому осложненное течение, вероятно, не связано с коинфекцией.

Показано, что по сравнению с 2021 г. в 2022 г. доля доминирующего типа CV-A6 снизилась с 80,6 до 36,1% с одновременным увеличением доли случаев CV-A10 с 6,5 до 27,0%. Полученные данные коррелируют с данными о росте числа случаев CV-A10 инфекции в регионах РФ и других странах [2, 22, 23].  В основном симптомы CV-A10 совпадали с симптомами CV-A6-инфекции, однако показана предрасположенность к развитию герпетической ангины при снижении случаев различных экзантем. У шести пациентов возрастом 0–6 лет (17% пациентов с CV-A10) наблюдались судороги и/или потеря сознания на фоне пиретической лихорадки, только у двух из них выявлены сопутствующие инфекционные агенты (HHV-6, HAdV). Случаев развития менингита в данном исследовании при CV-A10 не отмечено, хотя такие случаи были описаны ранее, по опубликованным данным CV-A10 инфекция протекает тяжелее, чем CV-A6 или CV-A16 [22].

Отдельно стоит отметить, что у двух пациентов с CV-A10 и CV-A3 энтеровирусной инфекцией наблюдалось достаточно редкое осложнение — развитие инфекций мочевыводящих путей (ИМП). Цитопатогенное действие энтеровирусов на клетки почечной ткани было описано ранее, что указывает на возможность вовлечения в патологический процесс органов мочевой системы [24].

Среди энтеровирусов вида EV-B наибольшая доля принадлежит ЕСНО 6, все они были обнаружены у пациентов в 2022 г., что коррелирует с эпидемическим подъемом ECHO 6, который наблюдался в 2022 г. на всей территории РФ [2]. Отмечена симптоматика нейроинфекции, часть пациентов перенесла менингит, у остальных наблюдались неврологические симптомы (менингизм, интенсивная головная боль, рвота) на фоне лихорадки, респираторных и/или кишечных симптомов. Один из случаев ЕСНО 6-инфекции проявился у ребенка как энтеровирусный везикулярный фарингит, однако по эпидемиологическому анамнезу известно, что у матери данная инфекция протекала в форме энтеровирусного менингита. Приведенный пример не согласуется с типичной клинической моделью ЭВИ, согласно которой взрослые переносят инфекцию в более легкой или бессимптомной форме, тогда как в описанной ситуации более тяжелое течение заболевания наблюдалось у родителя.

Для других энтеровирусов вида EV-B ЭВИ протекали с симптомами кишечных (гастроэнтериты, энтероколиты) и респираторных (ринит, бронхит) инфекций без нарушений работы центральной нервной системы; в отдельных случаях наблюдалось развитие герпетической ангины (CV-B3, ЕСНО 6) и HFMD (ЕСНО 6, ЕСНО 9). ЕСНО 11, который связывают с развитием неонатального сепсиса у младенцев, был выявлен только у трехлетнего пациента с симптомами респираторной инфекции. Вирус ЕСНО 30, являвшийся на протяжении многих лет доминирующим возбудителем энтеровирусного менингита в РФ, не был выявлен в данном исследовании, эти данные коррелируют с результатами исследований Референс-центра по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, так как после начала пандемии COVID-19 в период 2021–2022 гг. ЕСНО 30 практически не выявлялся на территории РФ. Однако стоит отметить, что в следующем периоде наблюдается рост случаев ЕСНО 30, так в 2024 г. они составили до 8% от всех случаев ЭВИ [2].

Были также выявлены два случая инфекции вирусом CV-A19 вида EV-C. По литературным данным CV-A19 является достаточно редким возбудителем ЭВИ и может вызывать различные респираторные и кишечные инфекционные формы, герпангину, а также менингиты и острый вялый миелит [25–26]. В первом случае у пациента развилась герпетическая ангина с инфекционным энтероколитом. Во втором случае на фоне норовирусной и астровирусной коинфекции у ребенка наблюдались острый инфекционный гастроэнтерит, токсикоз, эксикоз и ацидоз, отмечены расстройство речи и логоневроз, по результатам электроэнцефалографии выявлена эпилептиформная активность. Затрагивающие ЦНС последствия, вероятно, связаны с тяжелой кишечной ко-инфекцией.

К эпидемиологически значимым энтеровирусам относится EV-D68, тоже выявленный в настоящем исследовании. Для EV-D68 наиболее характерны респираторные симптомы, однако начиная с 2014 г. его связывают с развитием острого вялого миелита, имеющего симптомы с поражением нижних двигательных нейронов в сером веществе спинного мозга, нарушением рефлексов, дыхательной недостаточности, внезапным появлением мышечной слабости [27]. Вспышки EV-D68-инфекции, сопровождающейся развитием острого вялого паралича, миелита, миокардита, перикардита, неонатального сепсиса, пневмонии, были зафиксированы в США и Европе. В РФ единичные случаи EV-D68 регистрируются с 2018 г. Выявленные в данном исследовании случаи EV-D68 инфекции у детей 5–12 лет были сопряжены с заболеваниями респираторного тракта, включая ринофарингит, обструктивный бронхит и пневмонию. 

Наши данные показывают высокую долю случаев ЭВИ, сопровождающихся присутствием других инфекционных агентов (до 30% всех случаев), что подтвержает ранее опубликованные данные о случаях коинфекций при различных формах ЭВИ. В литературе описаны случаи коинфекций при неонатальном менингите EV / HSV-1 [28], при острой энцефалопатии CV-A6 / EV-D68 / парэховирус HPeV / HHV-6 [29], при менингите и сепсисе EV / Pasteurella multocida [30], при HFMD синдроме EV / HSV-1, CV-A6 / HHV7, CV-A6 / CMV [31, 32], при ИМП EV / Escherichia coli [33]. 

По нашим данным в большинстве случаев коинфекция при ЭВИ была связана с возбудителями, которые могут находиться в организме в латентной форме и проявляются на фоне ослабления иммунитета — вирусы простого герпеса 1-го и 2-го типов, цитомегаловирус, вирус Эпштейна–Барр, вирус герпеса 6-го типа, до 74% всех случаев обнаружения дополнительных инфекционных агентов.

ВЫВОДЫ

Определено, что доминирующее положение среди обнаруженных энтеровирусов у детей с ЭВИ в 2021 и в 2022 гг. в Московском регионе занимал Коксаки CV-А6, вызывающий преимущественно кожные поражения у пациентов. В 2022 г. наблюдался рост количества случаев CV-A10, для которого отмечена большая доля случаев с тяжелым течением заболевания по сравнению с CV-A6. Среди EV-B вирусов наибольшая доля принадлежала ЕСНО 6, у ряда пациентов диагностирован менингит. Отмечено большое количество случаев ЭВИ, сопровождающихся присутствием в биоматериале пациентов других вирусных и бактериальных инфекционных агентов, что может быть связано с ослаблением иммунитета при развитии ЭВИ. Нуклеотидные последовательности всех охарактеризованных энтеровирусов размещены в открытом доступе в NCBI, что делает возможным их использование в дальнейшем для эпидемиологического анализа циркуляции энтеровирусов на территории РФ.