Болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее распространенная в мире нейродегенеративная патология, которая обычно приводит к гибели нейронов и атрофии головного мозга, сопровождается накоплением патологических отложений: сенильных бляшек, состоящих из агрегированного β-амилоида (Aβ) и нейрофибриллярных клубков, образованных гиперфосфорилированным тау-белком [1, 2]. Несмотря на многолетние исследования, амилоидная гипотеза остается одной из центральных в объяснении патогенеза БА. Накопление олигомерных форм Aβ и их последующая агрегация в зрелые, стабильные фибриллы считаются ключевым событием, запускающим каскад нейротоксичности и нейровоспаления [3–5], поскольку агрегаты Aβ являются основным структурным компонентом сенильных бляшек, что делает их приоритетной мишенью для разработки методов диагностики и терапии. Одним из перспективных подходов является поиск соединений, способных ингибировать агрегацию Aβ. В настоящее время разрабатывают различные классы таких соединений, включая малые молекулы [6, 7], моноклональные антитела (адуканумаб, леканемаб) [8, 9], пептиды [10], природные лиганды [11], многофунгкциональные гибридные молекулы [12], однако многие из них сталкиваются с проблемами низкой биодоступности, ограниченной эффективности на поздних стадиях БА или серьезными побочными эффектами, такими как ARIA (аномалии визуализации, связанные с амилоидом) в случае антительной терапии [13, 14]. В этом контексте особый интерес представляют короткие пептиды, сочетающие целенаправленное действие с потенциально лучшей проникающей способностью. Таким соединениемкандидатом является тетрапептид НАЕЕ. По некоторым данным [15], HAEE действует как специфический молекулярный инструмент, избирательно связывающийся с металлсвязывающим доменом пептида Aβ (11EVHH14), формируя в присутствии Zn²⁺ стабильный комплекс. Это взаимодействие, подтвержденное методами поверхностного плазмонного резонанса, ядерного магнитного резонанса и молекулярного моделирования, значительно нарушает Zn²⁺-зависимую димеризацию мономеров Aβ, тем самым препятствуя образованию токсичных олигомеров. Важным подтверждением эффективности HAEE стали эксперименты in vivo на гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ): пептид не только подавлял Zn²⁺-индуцированное накопление амилоида, но и полностью предотвращал связанные с ним патологические фенотипы, включая паралич и сокращение продолжительности жизни трансгенных нематод [15]. В данных экспериментах не было зафиксировано признаков токсичности пептида, что указывает на его благоприятный профиль безопасности на этой модельной системе. Кроме того, для HAEE было показано еще одно ключевое свойство: фармакокинетические исследования и молекулярное моделирование указывают на его способность преодолевать ГЭБ [15]. Следует отметить, что НАЕЕ представляет собой пептид, происходящий из последовательности α4-субъединицы никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChRα4) [16]. Таким образом, НАЕЕ обладает свойствами уникального кандидата для терапии БА: он имеет установленный механизм действия, направленный на ключевое звено патогенеза, и демонстрирует эффективность на уровне целого организма. Для дальнейшего подтверждения этого механизма простым и наглядным методом может служить прямое обнаружение связывания НАЕЕ с агрегатами Aβ в условиях клеточных культур. Для решения этой задачи одним из наиболее популярных и доступных методов является флуоресцентная микроскопия, в частности, с применением иммуноцитохимического анализа.

Таким образом, цель данной работы — провести прямую визуализацию и подтверждение связывания флуоресцентного конъюгата НАЕЕ-Су5 с агрегатами Aβ на клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y с помощью флуоресцентной микроскопии для оценки его специфичности и перспектив использования пептида НАЕЕ в качестве целевого лиганда для диагностики и терапии БА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все эксперименты были выполнены в лаборатории отдела медицинских нанобиотехнологий Научно-исследовательского института трансляционной медицины РНИМУ имени Н. И. Пирогова. Конфокальную микроскопию проводили в лаборатории «Биомедицинские наноматериалы» Института биоинженерии Университета науки и технологий МИСИС.

В эксперименте исследовали соединения: HAEE-Cy5 (Ac-His-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(ε-Cy5)-NH₂, ЕЕАНCy5 (Ac-Glu-Glu-Ala-His-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(ε-Cy5)-NH₂, Су5-NH₂. Исследуемые пептиды HAEE-Cy5 и EEAH-Cy5 (чистота > 95% по данным ВЭЖХ) были синтезированы и предоставлены лабораторией отдела медицинских нанобиотехнологий НИИ трансляционной медицины РНИМУ имени Н. И. Пирогова. Пептиды состоят из тетрапептидной «головки» (HAEE или EEAH), соединенной через линкер из четырех остатков глицина (GGGG) с флуоресцентным красителем Cy5.

Остаток L-лизина (K) в линкере обеспечивает точку конъюгации для красителя. Структурные формулы исследуемых соединений представлены на рис. 1.

Лиофилизованные пептиды растворяли в стерильной деионизованной воде в концентрации 5–10 мМ и хранили аликвоты растворов при –20 °C не более 3 месяцев. Перед внесением пептидов на клетки растворы разводили в среде для культивирования клеток DMEM/F12, не содержащей эмбриональную телячью сыворотку (ФБС), до концентрации 5 мкМ.

Культивирование клеток линии SH-SY5Y

Клеточную линию нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC, США) выращивали во флаконах для культивирования в среде, состоящей из DMEM/F12 (ServiceBio, Китай) с добавлением 10%-й ФБС («Cytiva (GE Healthcare Life Sciences HyClone)», США), смеси антибиотиков (пенициллин — 100 мкг/мл, стрептомицин — 100 мкг/мл) (ServiceBio, Китай) и L-глутамина (100мМ) (ServiceBio, Китай), при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

Препараты бета-амилоида

Лиофилизованный Аβ (Amyloid β-Protein (1–42) (E-PP-0428), Elabscience, Китай) растворяли в 1% NH₄OH до концентрации 1 мг/мл на ультразвуковой бане без нагрева в течение 10 мин. Далее раствор аликвотировали по 10 мкл и хранили при –80 °C. Перед нанесением на клетки раствор вновь подвергали обработке ульразвуком в течение 30 мин при 37 °C в конечной концентрации (20 мкг/мл).

Иммунофлуоресцентный анализ

Для исследования локализации соединений SH-SY5Y высаживали в лунки 24-луночного планшета по 200 × 10³ клеток на лунку. Через 24 ч клетки были обработаны препаратами Aβ (20 мкг/мл) в среде, не содержащей ФБС, и инкубировались 4 ч. После этого клетки дважды отмывали раствором Хенкса и добавляли исследуемые соединения (HAEE-Cy5, EEAH-Cy5, NH₂-Cy5) в концентрации 5 мкМ и инкубировали 2 ч. Затем клетки подвергали фиксации в течение 15 мин в 4%-м параформальдегиде при +4 °C. Пермеабилизацию проводили в блокирующем буфере 0,2%-го Твин-20, 0,2%-м Тритон Х-100 и 2%-й козьей сыворотке в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее проводили инкубацию в течение 60 мин с первичными антителами (антитела мыши IgG1 против человеческого белка бета-амилоида, abI, clone 6E10 BioLegend) в разведении 1:100 000 (0,01 мкг/мл) в буфере (0,2% Твин-20, 0,2% Тритон Х-100, 0,2% козья сыворотка, ФБС). После этого клетки трижды отмывали раствором 0,2%-го Твин-20, 0,2%-го Тритона Х-100 по 5 мин. Далее клетки инкубировали со вторичными атителами (abII, Антитела козы против IgG(H+L), конъюгированные с alexa 488, E-AB-1056, Elabscience, Китай). Инкубация со вторичными антителами также составляла 60 мин, после клетки трижды промывали раствором 0,2%-го Твин-20, 0,2%-го Тритона Х-100 по 5 мин и окрашивали ядерным красителем DAPI.

Конфокальная микроскопия

Визуализацию клеток проводили с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti2 (Nikon, Токио, Япония), оснащенного лазерной сканирующей системой (ThorLabs, Ньютон, Нью-Джерси, США) и объективом Apo 60×/0.5-1.25 с масляной иммерсией. Сканирование проводили с помощью программного обеспечения ThorImageLS (версия 2.4) (Thorlabs, Ньютон, Нью-Джерси, США); для обработки изображений использовали программное обеспечение Fiji 2.9.0.

Статистический анализ

Колокализацию изображений в каналах alexa488 и Cy5 рассчитывали, используя программное обеспечение Fiji и коэффициент Мандерса; для анализа использовали n = 6 изображений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для подтверждения специфичности иммунофлуоресцентного окрашивания на клетках линии SH-SY5Y был проведен ряд контрольных экспериментов (рис. 2). При использовании только вторичных антител, конъюгированных флуоресцентной меткой alexa 488 (abII), значимый флуоресцентный сигнал не детектировался. Аналогично инкубация клеток с Aβ в отсутствие первичных антител (abI) не приводила к появлению специфического окрашивания. Обработка клеток только abI или abII без Aβ не вызывала значимого флуоресцентного сигнала. Интенсивное флуоресцентное окрашивание наблюдали исключительно при одновременном присутствии Aβ, abI и abII и соответствовало ожидаемой локализации целевых антигенов. Полученные результаты подтверждают, что специфическое окрашивание требует наличия всех компонентов системы и доказывают специфичность использованных антител.

Далее была исследована локализация НАЕЕCy5 и ЕЕАН-Сy5 на клетках. В ходе контрольного эксперимента с использованием свободного красителя Cy5-NH₂ выявлена его неспецифическая интернализация, проявляющаяся в виде диффузного сигнала на мембране и в цитоплазме клеток. Частичную локализацию столь гидрофобного соединения в цитоплазме можно объяснить пермеабилизцией клеток при проведении анализа. Напротив, для соединений ЕЕАН-Сy5 и НАЕЕ-Cy5 наблюдали интенсивный и структурно организованный сигнал, качественно отличающийся от контроля: он характеризовался выраженным мембраносвязанным компонентом и формированием дискретных скоплений в цитоплазме (рис. 3). Это свидетельствует о специфическом взаимодействии исследуемых соединений с клеточными структурами, которое не сводится к неспецифическому накоплению красителя.

В связи с обнаруженной специфической локализацией ЕЕАН-Cy5 и НАЕЕ-Cy5 была непосредственно проверена их способность к связыванию с агрегатами Aβ. Анализ конфокальных микрофотографий продемонстрировал четкую и интенсивную колокализацию сигнала НАЕЕ-Cy5 (красный) с сигналом от отложений Aβ (alexa 488, зеленый), визуализируемую в виде обширных желтых областей на совмещенном изображении (рис. 4), что однозначно указывает на высокоаффинное связывание тетрапептида НАЕЕ-Cy5 с амилоидными агрегатами. В отличие от НАЕЕCy5, для пептида ЕЕАН-Cy5 не было зафиксировано значимого сигнала в канале Cy5, что свидетельствует о его неспособности к специфическому взаимодействию с изучаемой мишенью. Исходный краситель Cy5 хоть и проявлял некоторую возможность связывания с амилоидными отложениями, в большей степени был локализован неспецифически, что также подтверждает высокое сродство HAEE-Cy5 к белковым агрегатам Aβ. Для дополнительного подтверждения колокализации каналов был расчитан коэффициент Мандерса между каналами изображений агрегатов Aβ и исследуемыми соединениями для полученных изображений: наиболее высоким значение коэффициента оказалось для соединения HAEE-Сy5 и агрегатов Aβ (0.58 ± 0.03), в то время как между каналами Aβ и Cy5 и каналами Aβ и ЕЕАН-Cy5 значения составляли 0.22 ± 0.05 и 0.19 ± 0.02 соотвественно, что говорит об отсутствии колокализации Cy5 и ЕЕАН-Cy5 и гораздо более высокой степени связывания HAEE-Cy5 с Aβ. Крайне невысокий сигнал флуоресценции от ЕЕАН-Cy5 может быть связан с его низкой способностью удерживаться на агрегатах Aβ и на других компартментах клетки. В то же время сигнал от Cy5 является значительным и усиливается в областях агрегатов Aβ, однако значительная часть флуоресценции распределена в области мембраны и цитоплазмы, что говорит о низкой специфичности связывания Cy5 с Aβ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное исследование позволило выявить фундаментальные различия в способности НАЕЕ-Cy5 и ЕЕАН-Cy5 к связыванию с агрегатами Aβ на клеточной линии SH-SY5Y, что, по-видимому, обусловлено их структурными особенностями. Несмотря на идентичный аминокислотный состав, обращенная последовательность ЕЕАН-Cy5 привела к полной потере функциональной активности, в то время как НАЕЕ-Cy5 продемонстрировал высокую специфичность к исследуемой мишени. Полученные данные позволяют предположить, что N-концевое положение гистидина в последовательности HAEE-Cy5 является критическим для формирования специфических взаимодействий с Aβ. Наши данные однозначно демонстрируют, что перенос гистидина (His, H) с первой на четвертую позицию в тетрапептидной «головке» лиганда приводит к резкому снижению способности к связыванию с Aβ. Известно, что N-концевой домен пептида Aβ содержит основные центры для связывания, а именно остатки His6, His13, His14, которые являются хорошими σ-донорами и участвуют в координации с металлами [17], а также ароматические остатки Phe4 и Tyr10, ответственные за π-π взаимодействия [17, 18]. Можно предположить, что гистидин в составе НАЕЕ участвует в аналогичных взаимодействиях с этими сайтами. В случае неактивного пептида ЕЕАН присутствие двух отрицательно заряженных остатков глутаминовой кислоты (Glu, E) в N-концевой позиции, а также присутствие флуоресцентного красителя Су5 на ε-конце лизина (Lys, K) могут вызывать сворачивание пептидной цепи или создавать стерические препятствия, нарушающие пространственную ориентацию и доступность ключевого остатка гистидина. В такой конфигурации гистидин может быть стерически недоступен для взаимодействия с сайтами связывания на Aβ.

Количественным подтверждением высокой специфичности связывания НАЕЕ-Cy5 с амилоидными агрегатами служит расчет коэффициента колокализации Мандерса. Значение коэффициента 0.58 ± 0.03 для пары НАЕЕ-Cy5 / Aβ существенно превышает значения для контрольных соединений (Cy5-NH₂ / Aβ и ЕЕАН-Cy5 / Aβ), которые были близки к нулю. Этот количественный анализ убедительно свидетельствует, что интенсивный сигнал колокализации не является случайным и подтверждает высокое сродство пептида НАЕЕ именно к целевым Aβ-агрегатам, что полностью согласуется с визуальными наблюдениями и демонстрирует критическую важность правильной последовательности аминокислот для эффективного взаимодействия.

Отсутствие флуоресцентного сигнала от ЕЕАН-Cy5 при четкой детекции связывания HAEE-Cy5 с внеклеточными агрегатами Aβ указывает на его неспособность к специфическому взаимодействию с мишенью. Это различие, обусловленное неоптимальной первичной структурой контрольного пептида, может быть следствием нескольких факторов: нарушения связывания с Aβ, повышенной чувствительности к протеолитической деградации, ухудшенной клеточной проницаемости или ускоренного выведения из клетки. Таким образом, в отличие от HAEECy5, пептид ЕЕАН-Cy5 не выполняет целевую функцию, что подтверждает критическую важность конкретной аминокислотной последовательности для эффективного связывания. Стоит отметить, что в отсутствие Aβ оба пептида демонстрировали схожую внутриклеточную локализацию, что указывает на их стабильность и способность к проникновению в клетку. Однако интенсивный и структурно организованный сигнал от пептида НАЕЕ-Cy5, проявляющийся в виде дискретных цитоплазматических скоплений, указывает на его способность к проникновению в клетку и взаимодействию с внутриклеточными структурами. При этом, согласно литературным данным [19], наблюдаемая колокализация с Aβ (рис. 4) происходит во внеклеточном пространстве, что и подтверждает специфичность связывания. Важно отметить, что наблюдаемое распределение НАЕЕ-Cy5 качественно отличалось от диффузного сигнала свободного красителя Cy5-NH₂, что исключает объяснение простым накоплением красителя и подчеркивает роль пептидной последовательности в направленном связывании.

Полученные результаты имеют важное практическое значение. Выявленная специфичность НАЕЕ-Cy5 к агрегатам Aβ позволяет рассматривать его в качестве перспективного лиганда для создания диагностических средств. В частности, его можно использовать как основу для разработки: МРТ-контрастных препаратов для прижизненной визуализации амилоидных бляшек, флуоресцентных зондов для интраоперационной детекции амилоидных отложений, тераностических платформ для направленной доставки лекарственных средств. В отличие от НАЕЕ-Cy5, пептид ЕЕАН-Cy5 демонстрирует полное отсутствие связывающей активности, и это наглядно показывает, что биологическая функция определяется не только аминокислотным составом, но и строго определенным порядком аминокислот. Для дальнейшего развития данного направления исследований требуется: 1) детальное изучение молекулярных взаимодействий НАЕЕ с Aβ-методами молекулярного докинга и спектроскопии; 2) оценка способности НАЕЕ ингибировать агрегацию Aβ in vitro; 3) исследование in vivo распределения и биодоступности НАЕЕ на трансгенных моделях БА. Таким образом, результаты работы не только идентифицировали высокоспецифичный лиганд для Aβ, но и продемонстрировали, что минимальные изменения в структуре пептида могут кардинально влиять на его функциональные свойства, что имеет фундаментальное значение для дизайна пептидных препаратов.

ВЫВОДЫ

В ходе исследования была успешно валидирована методика детекции агрегатов Aβ и визуализировано специфическое связывание тетрапептида НАЕЕ, конъюгированного с Cy5, с амилоидными агрегатами на клеточной линии SH-SY5Y, что было количественно подтверждено высоким коэффициентом колокализации Мандерса (0.58 ± 0.03). Критическая важность аминокислотной последовательности для этого взаимодействия была установлена на основании того, что пептид ЕЕАН-Cy5 с инвертированной последовательностью продемонстрировал полное отсутствие связывающей активности. Таким образом, установлено, что именно N-концевое положение гистидина является критическим для формирования специфических взаимодействий с агрегатами Aβ. Полученные результаты подтверждают перспективность применения НАЕЕ в качестве целевого лиганда для разработки диагностических и тераностических средств против БА, а также подчеркивают важность стереохимических факторов при конструировании пептидных препаратов. Для дальнейшего развития направления требуются исследования молекулярных механизмов взаимодействия и изучение in vivo распределения пептида.