Актуальность проблемы описторхоза, вызываемого трематодами Opisthorchis felineus и Opisthorchis viverrini, остается чрезвычайно высокой в современной медицине, паразитологии и эпидемиологии [1]. Обширные эндемичные регионы расположены на территории Российской Федерации (Западная и Восточная Сибирь, Приуралье), Восточной Европы и Казахстана, стран Юго-Восточной Азии (Таиланд, Лаос, Вьетнам) [2]. По данным ВОЗ, более 80 млн человек в мире находятся в группе риска, а число инвазированных оценивается в несколько десятков миллионов [3]. Единственным препаратом для этиотропной терапии является празиквантел (PZQ), широкое применение которого создает потенциальный риск селекции резистентных штаммов паразита, что в перспективе может привести к полной утрате эффективности лечения [4]. Кроме того, в последнее время появляется ряд сообщений о возможности повышения риска развития холангиокарциномы при повторных курсах терапии PZQ вследствие массированного высвобождения паразитарных антигенов после приема препарата [4, 5]. В связи с этими обстоятельствами поиск альтернативных лечебных средств с низкой токсичностью и высокой эффективностью приобретает особую актуальность.

Экстракты видов Populus, особенно из почек и коры, традиционно применяют благодаря их выраженным противовоспалительным, антиоксидантным и гепатопротекторным свойствам, подтвержденным исследованиями [6, 7]. Так как окислительный стресс и хроническое воспаление играют ключевую роль в развитии осложнений описторхоза, а растительные экстракты с похожей структурой, такие как артесунат, уже зарекомендовали себя при лечении других трематодозов [8], экстракт коры осины Populus tremula L. (P. tremula) представляется перспективным объектом для изучения. Фармакологическая активность экстрактов коры осины (Populus tremula L.) преимущественно обусловлена высоким содержанием фенолгликозидов класса салициноидов [9]. Научные исследования показали выраженную противопаразитарную активность данных фитохимических компонентов в отношении широкого спектра возбудителей печеночных трематодозов (например, Opisthorchis spp., Psilostomum) и гельминтозов (включая нематодозы и протозойные инфекции типа лямблиоза) [10, 11].

Целью исследования было изучить богатый фенолгликозидами экстракт коры P. tremula.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования — экстракт коры P. tremula с высоким содержанием фенолгликозидов.

На научно-производственном предприятии Биолит из коры P. tremula, заготовленной в осенне-зимний период и высушенной в естественных условиях до остаточной влажности 8–10%, методом реперколяции на промышленном экстракторе 2000 L (Hubei weihua machinery co., ltd, Китай) получали жидкий экстракт с соотношением исходного сырья и готового продукта 1 : 1. В качестве экстрагента использовали воду. Полученный жидкий экстракт сгущали в вакуумной системе испарения SX-250 (Hubei weihua machinery co., ltd, Китай) до остаточного содержания влаги 25–40%.

Для получения богатой фенолгликозидами фракции (PGF-PT) в лаборатории контроля качества центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России густой экстракт восстанавливали водой очищенной в соотношении 1 : 15, перемешивали в течение 30 мин и к полученному раствору добавляли трехкратный (об./об.) избыток 96%-го этилового спирта. После отстаивания осадка при температуре 4 °С в течение 12 ч и декантации надосадочную жидкость центрифугировали при 4000 об./мин в течение 3 мин (Eppendorf 5702, Eppendorf, США). Декантированный раствор объединяли с супернатантом и упаривали на роторном испарителе Rotavapor V-3 (Buchi, Швейцария) с вакуумной насосной станцией PC 500 (Vacuubrand, Германия) при температуре водяной бани 40 °С до 1/10 первоначального объема, после чего высушивали конвекционно. Выход PGF-PT составил 71,65 ± 13,4%. PGF-PT стандартизовали по содержанию фенолгликозида салицина методом ВЭЖХ на хроматографе Ultimate 3000 (Dionex, Thermo, Германия), оснащенном диодно-матричным детектором DAD3000 на колонке Zorbax Eclipse plus C18 3,0 × 150 мм, 3,5 мкм, подвижная фаза А — 0,1% трифторуксусная кислота в воде, подвижная фаза В — ацетонитрил. Режим элюирования — градиентный, объем вводимой пробы составлял 20 мкл, температура термостата колонки — 30 °С. Пик салицина идентифицировали по спектральным признакам: характерные максимумы поглощения при длинах волн 194 и 269 нм, плечо на длине волны 215 нм. Содержание салицина определяли методом внешнего стандарта. Время удерживания пика, соответствовавшего салицину, составляло 7,544 мин. Определение содержания полифенольных соединений (в пересчете на танин) проводили перманганатометрически в соответствии с нормативными документами. По результатам анализа, содержание полифенольных соединений (в пересчете на танин) составило 8,16 ± 0,41 %, салицина — 4,7 ± 0,6 %.

Оценку противоописторхозной активности PGF-PT проводили в ЦДИ ЦНИЛ на взрослых формах печеночного сосальщика O. felineus — маритах. В качестве препарата сравнения использовали празиквантел (PZQ, TCI, Япония) в дозе 600 мкг/мл [11]. Заражение экспериментальных животных выполняли по описанной методике [12]. Всего в эксперименте было задействовано 40 самок золотистого хомяка Mesocricetus auratus массой 130–150 г SPFкатегории, полученных из Федерального государственного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук». Через 3 месяца после заражения животных подвергали эвтаназии в атмосфере СО₂, из гепатобилиарного тракта извлекали мариты, промывали 0,9%-м раствором NaCl, инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 ч в промывочной культуральной среде RPMI 1640, содержащей

2×пенициллин-стрептомицин [13]. Затем мариты помещали в шестилуночный культуральный планшет по 10 особей на лунку со средой для культивирования RPMI 1640, содержащей 1×пенициллин-стрептомицин, 10 г/л глюкозы, 2 г/л бикарбоната натрия.

Растворы фракции PGF-PT и PZQ готовили в диметилсульфоксиде (ДМСО) с последующим разведением в инкубационной среде. Исследуемую фракцию PGF-PT тестировали в конечных концентрациях 250, 500, 1000 и 2000 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали образцы, инкубированные в среде, содержащей равный объем ДМСО (до 0,5%), что исключало возможное неспецифическое воздействие самого растворителя на метаболизм и поведение марит. Инкубацию марит с веществами проводили в течение 24 ч.

Стандартом изучения эффективности перспективных антигельминтных препаратов является тестирование in vitro, проводимое с помощью оценки подвижности и морфологии паразитов [10, 11]. Противопаразитарную активность оценивали путем анализа изменения двигательной активности и морфологических изменений тегумента марит под микроскопом NE910 (Ningbo Yongxin Optics Co Ltd, Китай), оснащенным камерой (Digital Sigth 1000, Nikon, Китай). Подвижность определяли визуально по четырехбалльной шкале [14]: 4 — движения очень активны (аналогичны движениям контрольных сосальщиков); 3 — активны (сниженная подвижность по сравнению с контролем, однако все тело еще движется); 2 — сниженная активность (видны только движения присоски); 1 — неподвижные черви. Показатели подвижности в лунках нормализовали относительно показателей контрольной группы.

Относительный индекс подвижности (RM) рассчитывали по формулам [14]:

формула

где MI — индекс подвижности группы червей, n — балл подвижности, Nn — количество трематод с баллом n.

Для определения влияния экстракта на функциональное состояние клеток тегумента печеночного сосальщика выполняли исследование с флуоресцентным интеркалирующим красителем пропидий иодидом (PI), который связывается с ДНК и применяется для окрашивания ядер мертвых клеток. Мариты инкубировали с PI (2 мкг/мл) в течение 20 мин, затем промывали физиологическим раствором. Изображения получали под флюоресцентным микроскопом Leica DM6 (Leica Microsystems GmbH, Германия) [15].

Гепатопротекторную активность PGF-PT оценивали in vitro в модели липотоксичности, индуцированной смесью олеата и пальмитата натрия, на клетках линии гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 по уровням внутриклеточных липидов и активных форм кислорода (АФК). Содержание липидов оценивали с помощью флуоресцентного красителя нильского красного [16]. В качестве положительного контроля использовали гиполипидемическое соединение гемфиброзил (100 мкМ, Sigma-Aldrich, США). Визуализацию липидных капель проводили на флуоресцентном микроскопе Leica DM6 (Leica Microsystems GmBH, Германия). Уровень АФК в клетках измеряли с 2,7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетатом (ДХФДА) [17]. Безопасные концентрации PGF-PT для использования в данной модели (31,25; 62,5 и 125 мкг/мл) выбрали с помощью теста с витальным красителем нейтральным красным [18].

Для определения вклада прямой антирадикальной активности в способность фракции влиять на уровень АФК в клетках проводили эксперимент в модельной системе с использованием стабильного радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ), как описано ранее [19]. Активность выражали показателем IC₅₀, означающим эффективную концентрацию PGF-PT, при которой восстанавливается 50% свободных радикалов ДФПГ.

Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США). Для анализа порядковых данных использовали критерий хи-квадрат Пирсона (χ²). Для попарного сравнения групп применяли поправку на множественные сравнения Бонферрони. Количественные данные проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. Сравнение средних значений между несколькими независимыми группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Статистически значимым считали p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фракция PGF-PT оказывала дозозависимый эффект на подвижность марит O. felineus (рис. 1).

В контрольной группе наблюдали полную сохранность двигательной активности и целостности покровов марит. Обработка фракцией PGF-PT в концентрации 1000 мкг/мл снижала подвижность 40% взрослых особей до минимального значения (2 балла по шкале подвижности); при этом у 17% паразитов полностью отсутствовала двигательная активность (1 балл по шкале подвижности). При дальнейшем увеличении концентрации PGF-PT до 2000 мкг/мл число полностью неподвижных особей возросло до 30%. Препарат сравнения PZQ в концентрации 600 мкг/мл обеспечивал полную иммобилизацию 73% взрослых особей.

Индекс подвижности паразитов в контрольной группе составил 3,8. По мере повышения концентрации PGF-PT от 250 до 2000 мкг/мл индекс снизился с 3,7 до 2,1. Одновременно относительная подвижность падала с 98,2 до 54,5%. В свою очередь, PZQ подавлял активность паразитов до уровня 28,5%, что провоцировало развитие спастического паралича (таблица).

При оценке целостности тегумента установили, что флуоресцентный краситель PI не проникал в клетки жизнеспособных марит контрольной группы. Флуоресцентное свечение после обработки PZQ локализовалось в областях тегументального синцития. Данные результаты совпадают с литературными источниками, согласно которым у O. viverrini PZQ аналогично индуцирует деструкцию и слущивание тегумента [15]. При воздействии PGF-PT в концентрациях 500, 1000 и 2000 мкг/мл наблюдали частичное проникновение PI вглубь тегументального синцития червя на отдельных участках поверхности тела, свидетельствующее о локальных нарушениях клеточной мембраны и потере тканевой целостности (рис. 2). 

Таким образом, воздействие PGF-PT вызвало частичную деградацию клеток тегумента, однако не обеспечивало полного функционального разрушения организма паразита и потери подвижности во всех рассмотренных случаях.

Применение световой микроскопии подтвердило наличие значительных повреждений поверхностных структур тел марит после инкубации с высокими концентрациями PGF-PT (1000 и 2000 мкг/мл), проявляющихся в виде массивного слущивания эпителия и отечности тегумента (см. приложение).

Инкубация клеток HepG2 в среде с олеиновой и пальмитиновой жирными кислотами (ЖК) приводила к развитию гепатотоксичности. Регистрировали увеличение содержания внутриклеточных липидов на 55% (p < 0,05) по результатам оценки изменения интенсивности флуоресценции липофильного красителя (рис. 3А), что согласовывалось с данными микроскопии (рис. 3В).

Интенсивность флуоресценции ДХФДА также возрастала на 57% (p < 0,05), что отражало рост уровня АФК в клетках (рис. 3Б).

Фракция PGF-PT в концентрациях 62,5 и 125 мкг/мл вызывала дозозависимое снижение уровня липидов на 32,9% (p < 0,05) и 48,9% (p < 0,05), и этот эффект был сравним с действием гиполипидемического соединения гемфиброзила (p > 0,05) (рис. 3А). Вместе с тем исследуемая фракция PGF-PT подавляла окислительный стресс в клетках HepG2, обработанных средой с повышенным уровнем ЖК (рис. 3Б). Внесение фракции PGF-PT в концентрациях 31,25, 62,50 и 125,00 мкг/мл снижало интенсивность флуоресценции внутриклеточного зонда на АФК ДХФДА на 12,6% (p < 0,05), 28,2% (p < 0,05) и 36,2% (p < 0,05) соответственно.

Снижение уровня внутриклеточных АФК может быть обусловлено и прямыми антирадикальными свойствами PGF-PT, результаты оценки которых в модельной системе представлены на рис. 4А.

На основании полученных данных проведены расчеты концентрации фракции PGF-PT, обеспечивающей ингибирование 50% свободных радикалов ДФПГ (IC₅₀). Эта величина составила 79,3 ± 1,0 мкг/мл (рис. 4Б). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженных антирадикальных и гепатопротекторных свойствах фракции PGF-PT.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты демонстрируют выраженные противоописторхозный и гепатопротекторный потенциалы экстракта коры осины Populus tremula, богатого фенолгликозидами (фракция PGF-PT).

Мы обнаружили, что данная фракция вызывает дозозависимое снижение подвижности марит O. felineus, причем при максимальной исследуемой концентрации (2000 мкг/мл) полностью утрачивают подвижность 30% особей. Несмотря на то что этот показатель ниже, чем у стандартного препарата празиквантела (73% неподвижных особей), установленное нами снижение подвижности указывает на перспективность дальнейшей разработки препарата на основе PGF-PT.

Микроскопическое исследование подтвердило, что воздействие PGF-PT вызывает частичную деградацию клеток тегумента, что ограничивает функциональные возможности паразита. Однако полного разрушения тегумента и полной остановки подвижности не происходило, что подчеркивает необходимость продолжения исследований для усиления антигельминтного эффекта. Антигены тегумента — многоядерного синцития толщиной около 4 мкм, выполняющего несколько важных функций, включая защиту от иммунных клеток хозяина, являются перспективными кандидатами для разработки антигельминтных препаратов. Интересно, что антигельминтные препараты, обладающие различными механизмами действия, вызывают повреждение тегумента паразитов [11]. Это указывает на то, что препараты, наряду с непосредственным влиянием на молекулярные мишени, вызывают нарушение поверхности паразита, что приводит к активации антителозависимой клеточной цитотоксичности и является отправной точкой для эффективного иммунного ответа организма хозяина.

Данные о дозозависимом сокращении подвижности марит O. felineus и индуцированных очаговых повреждениях тегумента хорошо согласуются с ранее опубликованными исследованиями, в которых сообщалось о выраженной противопаразитарной активности фенолгликозидов растений Populus spp. Недавно было описано противоописторхозное действие неочищенных экстрактов Allium sativum L. [11] и Thunbergia laurifolia Lindl. [20]. В других работах приводятся результаты изучения антигельминтных свойств флавоноида кверцетина, относящегося к классу полифенольных соединений, и выражающиеся в снижении подвижности и повреждении тегумента взрослых форм паразитов [21, 22]. Более мягкий механизм действия может способствовать снижению риска тяжелых иммунопатологических реакций, связанных с массовой гибелью и разрушением паразитов.

Гепатопротекторное действие PGF-PT, проявляющееся в снижении липотоксичности и окислительного стресса в клеточной модели HepG2, подтверждается современными данными о свойствах фенолгликозидов и других биофлавоноидов. Показано, что гепатопротекторный эффект полифенолов не сводится к единому механизму, а является результатом комплексного воздействия, включающего усиление антиоксидантного, метаболического и иммуномодулирующего действия [23]. Это позволяет предполагать, что терапия данным экстрактом не только снижает паразитарную нагрузку, но и защищает печень от повреждений, что особенно важно при хронических формах описторхоза и риске развития холангиокарциномы.

ВЫВОДЫ

Фракция PGF-PT из коры осины Populus tremula в экспериментах in vitro обладает выраженной антигельминтной активностью против Opisthorchis felineus, вызывая дозозависимое снижение подвижности и повреждения тегумента паразита. Кроме того, PGF-PT оказывает гепатопротекторное действие, снижая липотоксичность и окислительный стресс в гепатоцитах. Мягкий режим действия отличает ее от празиквантела, снижая риск иммунопатологических осложнений. Эти данные подчеркивают потенциал PGF-PT как перспективного компонента для создания новых антиописторхозных препаратов с дополнительным гепатопротекторным эффектом. Несмотря на то что системы in vitro обладают значительными ограничениями в адекватном воспроизведении реальной многокомпонентной системы «паразит–хозяин», они предоставляют важную информацию о базовых механизмах фармакологического действия. Представленные нами результаты служат основанием для дальнейших исследований in vivo, направленных на оценку эффективности и безопасности фракции PGF-PT в реальных биологических условиях.