Болезнь Альцгеймера (БА) является самым распространенным нейродегенеративным заболеванием и самой частой причиной деменции у пожилых людей во всем мире [1]. Согласно статистическим данным, число пациентов с БА в России составляет 1,5–2 млн человек [2].

Одним из основных патоморфологических признаков БА является наличие в головном мозге внеклеточных фибриллярных агрегатов, или амилоидных бляшек, которые при окрашивании красителем Конго красным дают характерный сигнал [3]. Главными компонентами амилоидных бляшек являются агрегированные формы бета-амилоида (Aβ) [4]. Бета-амилоид представляет собой короткий полипептид (длиной 37–43 аминокислотных остатков), который в виде мономеров присутствует в крови и спинномозговой жидкости человека в низких наномолярных концентрациях [5]. Однако при патогенезе БА в головном мозге начинает по неизвестным причинам развиваться церебральный амилоидоз, т. е. инициируется патологический процесс, при котором мономерные молекулы Aβ превращаются сначала в растворимые олигомеры, а затем накапливаются в виде амилоидных бляшек в различных разделах мозга, но особенно — в гиппокампе [6]. Образование первых амилоидных бляшек в тканях мозга происходит за 10–20 лет до начала клинических проявлений БА, но именно агрегация Aβ инициирует дальнейшие патологические процессы БА, включая гиперфосфорилирование белка тау и нейродегенерацию [4]. Соответственно, поиск лекарственных кандидатов, нацеленных на разрушение амилоидных бляшек и/или предотвращение их образования, является ведущей стратегией при разработке болезньмодифицирующей терапии БА [7].

В настоящее время в США официально зарегистрированы три моноклональных антитела к Aβ — адуканумаб, леканемаб и донанемаб [8–10] — для начала лечения на ранней стадии БА, включающей пациентов с легкими когнитивными нарушениями и легкой деменцией вследствие болезни Альцгеймера с диагностическим подтверждением на основе Aβ с помощью позитронноэмиссионной томографии амилоида или биомаркеров спинномозговой жидкости. Эти новые методы лечения, изменяющие течение заболевания, действуют путем снижения уровня амилоидных бляшек в головном мозге и демонстрируют клинические преимущества антиамилоидной терапии [11].

Тем не менее, вследствие опасных побочных эффектов антител [12] продолжаются разработки лекарственных кандидатов из класса низкомолекулярных соединений, а также пептидов и пептидомиметиков в качестве молекулярных агентов, которые нацелены на специфическое связывание с различными участками аминокислотной последовательности Aβ [13].

В качестве потенциального антиамилоидного средства для болезнь-модифицирующей терапии БА был разработан синтетический пептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 (HAEE) (PubChem CID: 56971578) [14], который эффективно проходит из крови сквозь гематоэнцефалический барьер в ткани головного мозга [15]. Лекарственной мишенью для HAEE является участок 11-Glu-Val-His-His-14 (EVHH) Aβ, с которым HAEE образует межмолекулярный комплекс, стабилизированный ион-комплементарными взаимодействиями (обзор в [16]). Фрагмент EVHH был выбран в качестве лекарственной мишени потому, что представляет собой молекулярную детерминанту Aβ, которая обладает жесткой конформацией основной полипептидной цепи и контролирует связывание Aβ с никотиновым ацетилхолиновым рецептором подтипа α4β2, а также все цинк-зависимые взаимодействия Aβ [17, 18]. С учетом критической роли вышеупомянутых взаимодействий в патогенезе БА, ожидалось, что блокирование участка EVHH пептидом HAEE должно подавлять образование амилоидных бляшек in vivo. Действительно, в пилотных экспериментах с использованием в моделях БА трансгенных животных (мыши линии APP/PS1 и нематоды линии CL2120) была установлена высокая анти-амилоидная эффективность применения HAEE (обзор в [18]).

Таким образом, механизм анти-амилоидного действия HAEE основан на разрушении цинк-зависимых межмолекулярных интерфейсов в олигомерах и агрегатах бета-амилоида, а также в комплексах бета-амилоида с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами подтипа α4β2 за счет избирательного связывания HAEE c аминокислотным участком 11-Glu-Val-His-His-14 бетаамилоида, что приводит к уменьшению количества агрегатов бета-амилоида в организме модельных животных.

В рамках проведения доклинических испытаний препарата HAEE в качестве потенциального антиамилоидного средства для лечения БА целью настоящей работы было определить оптимальную терапевтическую дозу HAEE для эффективного ингибирования образования амилоидных бляшек в гиппокампе трансгенных мышей линии APP/PS1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные

Для проведения экспериментов использовали трансгенных мышей сублинии APPswe/PS1dE9/Blg [19]. Данная сублиния получена путем скрещивания трансгенных мышей линии B6;C3- Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (#034829-JAX, JAX, Maine, USA), также известной под названием APP/PS1, с линейными мышами дикого типа C57Bl6J сублинии C57Bl6J/ChG (Институт физиологически активных веществ, Черноголовка, Россия). Трансгенные мыши линии APP/PS1 являются признанными модельными животными БА [18]. У таких животных, начиная с 4–6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной БА, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс [20]. Экспериментальных животных содержали в беспатогенном виварии (Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта, Москва, Россия) в условиях, включающих стандартный рацион питания, свободный доступ к корму и воде, 12-часовой световой день, температуру окружающей среды от +22 до +24 °С и относительную влажность воздуха 50–65%. Процедуры разведения и контрольного генотипирования племенных животных проводили, как описано ранее [19]. Экспериментальные группы животных

Всего для экспериментов в настоящем исследовании было использовано 40 самцов и 40 самок мышей трансгенной линии APP/PS1. Животные были распределены случайным образом по пяти группам, каждая из которых включала 8 самцов и 8 самок (таблица). Возраст каждого животного на момент первой инъекции и эвтаназии составлял 5 и 7 месяцев соответственно. Мышам из группы 1 (контроль) вводили подкожно изотонический 0,9%-й раствор хлорида натрия (физиологический раствор). Мышам из групп 2–5 вводили раствор синтетического пептида HAEE в дозах 0,18 мг/кг, 0,30 мг/кг, 1,50 мг/кг и 3,00 мг/кг соответственно. Процедура эвтаназии была применена к семимесячным мышам.

Реагенты

Все химические вещества и растворители, использованные в данном исследовании, имели класс чистоты для ВЭЖХ или выше и были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США), если не указано иное.

Лекарственный препарат «Тетрапептид Ac-His-Ala-GluGlu-NH2, раствор для подкожного введения», 3,5 мг/мл (ПАО «Фармсинтез», Россия). Структура пептида HAEE была подтверждена с помощью спектроскопии ЯМР и тандемной масс-спектрометрии.

Приготовление препаратов синтетического HAEE для проведения инъекций

Препарат НАЕЕ из исходной концентрации 3,5 мг/мл разбавляли стерильным изотоническим 0,9%-м раствором хлорида натрия до получения рабочей концентрации пептида, которая обеспечивала желаемую дозу препарата HAEE (например, 0,30 мг/кг) в 125 мкл объема разбавленного раствора. Для всех исследованных в настоящей работе дозировок HAEE общий объем одного инъекционного образца составлял 150 мкл, при этом каждому животному вводили 125 мкл этого образца.

Введение исследуемых препаратов экспериментальным животным

Трансгенным мышам из пяти экспериментальных групп исследуемые препараты (физиологический раствор или образцы с различными дозами пептида HAEE) вводили дважды в неделю в течение 9 недель путем подкожных инъекций соответствующих препаратов согласно существующим требованиям и подходам к дозированию лекарственных средств лабораторным животным [21]. Периодичность и общее количество инъекций, проведенных в течение всего срока исследования мышам из экспериментальных групп, а также сведения о дозировках HAEE в инъекционных образцах для каждой такой группы представлены в таблица.

Приготовление гистологических препаратов срезов головного мозга

Транскардиальную перфузию 4%-м раствором параформальдегида в фосфатно-солевом буфере проводили животным после терминальной анестезии наркозом Avertin (Sigma Aldrich, Германия). Диссектированный мозг фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида в фосфатно-солевом буфере 12–16 ч. Дегидратацию тканей проводили в растворах этилового спирта с увеличивающейся концентрацией: 75%  — 1 ч, три смены 95%  по 5 мин, 100% — 15 мин, 100% — 45 мин , этанолхлороформ (1 : 1) — 30 мин, хлороформ — 1 ч, хлороформ — 12–16 ч. Пропитку препаратов мозга парафином проводили при 60 °С в трех последовательных сменах парафина по 1 ч инкубации в каждом. Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG1160 (Leica Microsystems, Германия). Серийные срезы головного мозга толщиной 8 мкм получали на микротоме Leica RM2265 (Leica Microsystems, Германия) и монтировали на предметные стекла с полилизиновым покрытием. Депарафинизацию срезов проводили в ксилоле —  две смены по 10 мин, регидратировали в этиловых спиртах: 100% — 5 мин, 90%  — 5 мин, 75% — 5 мин, вода — 10 мин, окрашивали спиртовым 0,5%-м раствором красителя Конго красного — 5 мин, дифференцировали в 0,2%-м растворе KOH в 80%-м этиловом спирте, промывали препараты в деионизованной воде 10 мин. Для монтирования покровных стекол использовали среду Immu-Mount (Thermo Scientific).

Гистохимическое выявление конгофильных амилоидных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа

Для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе были использованы полученные срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах [22]. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Благодаря способности красителя Конго красный формировать флуоресцирующий комплекс с амилоидными фибриллами в составе амилоидных бляшек, детекцию конгофильных амилоидных бляшек проводили на конфокальном микроскопе LSM880 (Carl Zeiss, Германия) методом мозаичного сканирования отдельных областей гиппокампа при увеличении 10× в диапазоне спектра с пиком возбуждения 596 нм и эмиссией при 620 нм (рисунокА). Для идентификации анатомических структур мозга полученное флуоресцентное изображение комбинировали с изображением в проходящем свете (рисунокБ). Подсчитывали вручную все видимые конгофильные амилоидные бляшки любых размеров. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества конгофильных амилоидных бляшек на один срез (таблица).

Статистические методы анализа данных

Данные были представлены как средние значения не менее трех независимых подсчетов числа амилоидных бляшек ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна– Уитни. Уровень значимости составил 99,9% (р < 0,001). Статистический анализ проводили с использованием программы STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рисунке представлено типичное изображение окрашенного красителем Конго красным среза мозга интактных пятимесячных трансгенных мышей линии APP/PS1. Конгофильные амилоидные бляшки (КАБ), визуализированные в мозге подопытных семимесячных животных из всех пяти экспериментальных групп после проведения инъекций, были схожи по локализации и распределению размеров в паренхиме мозга. Однако количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами.

Данные о числе КАБ в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа семимесячных трансгенных мышей линии APP/PS1 из экспериментальных групп 1–5 представлены в таблица. У контрольных животных из группы 1, которых не подвергали действию пептида HAEE, число КАБ составляет 15,7 ± 4,6, что соответствует литературным данным для интактных трансгенных мышей линии APP/PS1 в семимесячном возрасте [23, 24].

У мышей из группы 2, которым многократно вводили начальную дозу HAEE (0,18 мг/кг), число КАБ было равно 7,5 ± 2,1, т. е. по сравнению с контрольными мышами оно уменьшилось примерно в 2 раза. У мышей из группы 3, которые получали HAEE в дозе 0,30 мг/кг, количество амилоидных бляшек существенно (более чем в 2 раза) уменьшилось по сравнению с мышами из группы 2 и было почти в 5 раз меньше, чем у контрольных животных. Дальнейшее увеличение дозы HAEE в 5 и в 10 раз относительно дозы 0,30 мг/кг не приводило к изменению числа КАБ у животных из групп 4 и 5 по сравнению с мышами из группы 3.

Таким образом, в настоящем исследовании впервые определено, что доза 0,30 мг/кг является оптимальной для подавления образования КАБ у трансгенных мышей обоих полов линии APP/PS1 при многократном подкожном введении синтетического пептида HAEE.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании приведены и анализируются экспериментальные результаты о количествах конгофильных амилоидных бляшек на срезах выделенных областей мозга трансгенных мышей, т. е. амилоидных бляшек, выявленных только окрашиванием красителем Конго красным. Это классический метод визуализации именно фибриллярных амилоидных бляшек, которые являются главным нейроморфологическим признаком амилоидоза при патогенезе болезни Альцгеймера, он не учитывает возможное наличие в тканях мозга растворимых агрегатов и олигомеров бета-амилоида.

Способность пептида HAEE подавлять образование амилоидных бляшек в трансгенных мышах линии APP/PS1, которые широко используют в качестве «животной» модели БА (обзор в [18]), уже была показана в ряде публикаций. Впервые такая способность была продемонстрирована в 2015 г. [24] на примере ограниченной выборки животных обоих полов (n = 6 и n = 7 в контрольной группе и в экспериментальной группе соответственно). Подопытным животным проводили внутривенные инъекции пептида HAEE в дозе 1,13 мг/кг дважды в месяц в течение пяти месяцев, начиная с двухмесячного возраста (всего было сделано девять инъекций каждому животному).

Как следствие, у семимесячных трансгенных мышей под действием пептида HAEE наблюдалось снижение числа конгофильных амилоидных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа на 60% по сравнению с контрольными животными. Далее, самцам трансгенных мышей линии APP/PS1 проводили внутривенные инъекции в дозе 0,05 мг/кг ежемесячно в течение пяти месяцев, начиная с двухмесячного возраста (всего было сделано шесть инъекций каждому животному) [25]. В гиппокампе восьмимесячных мышей, которым вводили препараты HAEE, число конгофильных амилоидных бляшек (24,7 ± 3,4 на одном срезе) оказалось на 22% меньше по сравнению с контрольными животными (31,7 ± 4,9 на одном срезе). Наконец, недавно было показано, что как внутрибрюшинные, так и интраназальные инъекции синтетического HAEE в дозе 50 мг/кг самцам трансгенных мышей линии APP/PS1 каждые 48 ч на протяжении полутора месяцев, начиная с шестимесячного возраста, приводили к уменьшению амилоидной нагрузки в тканях мозга у инъецированных животных по сравнению с контрольными мышами. Эту нагрузку оценивали по площади видимой поверхности амилоидных бляшек в гиппокампе, и она уменьшалась в 4,7 и в 3,5 раза для внутрибрюшинного и интраназального путей введения соответственно [26].

Таким образом, эффективность применения синтетического HAEE для подавления образования амилоидных бляшек в гиппокампе трансгенных мышей линии APP/PS1 ранее была показана как на самцах, так и на самках при внутривенном, внутрибрюшинном и интраназальном способах введения. Воздействие на мышей посредством HAEE начинали как с возраста двух месяцев, когда у данных животных еще нет амилоидных включений в мозге, так и с шестимесячного возраста, когда в гиппокампе присутствует не менее пяти конгофильных амилоидных бляшек [23], а период введения изменялся от полутора до пяти месяцев, и интервалы между инъекциями составляли от двух до 30 суток.

В вышеупомянутых исследованиях дозы также варьировались в широком диапазоне от 0,05 до 50 мг/кг при различной частоте введения. Все эти различия в экспериментальных процедурах не позволяли сделать вывод о том, какая из использованных доз — 0,05 мг/кг, 1,13 мг/кг или 50,00 мг/кг — наиболее подходит в качестве терапевтической дозы для клинических испытаний. Очевидно, что доза 50,00 мг/кг является безопасной, но избыточна. В то же время доза 0,05 мг/кг кажется не такой эффективной, как 1,13 мг/кг.

Несмотря на вариативность вышеприведенных экспериментальных протоколов, представляется полностью обоснованным использование данных об изменении количества конгофильных амилоидных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа трансгенных мышей линии APP/PS1, подсчитанных по методике, описанной ранее [24], в качестве надежного критерия оценки антиамилоидной эффективности пептида HAEE.

Известно, что в возрасте до семи месяцев нет существенных половых различий в развитии церебрального амилоидоза у трансгенных мышей линии APP/PS1 [27], поэтому в настоящей работе подкожные инъекции начинали делать пятимесячным животным обоих полов, а изъятие мозга для гистохимического анализа проводилось у семимесячных мышей. Инъекции делали дважды в неделю на протяжении девяти недель. Для тестирования были выбраны следующие четыре дозы синтетического HAEE: 0,18 мг/кг;  0,30 мг/кг; 1,50 мг/кг; 3,00 мг/кг. В результате тестирования было установлено, что под действием HAEE число КАБ у инъецированных мышей по сравнению с контрольными животными существенно снижалось при всех исследованных дозах. Однако число КАБ было примерно одинаковым при использовании доз 0,30 мг/кг, 1,50 мг/кг и 3,00 мг/кг. Факт, что повышение дозы 0,30 мг/кг и в пять, и в десять раз не вызывало усиления терапевтического эффекта (т. е. не вызывало уменьшения числа КАБ), свидетельствует о том, что при прочих равных экспериментальных условиях (период и частота инъекций, а также возраст мышей на момент начала инъекций) доза 0,30 мг/кг является необходимой и достаточной для оптимального подавления образования амилоидных бляшек в исследованной на животных модели БА. Доза 0,30 мг/кг приблизительно соответствует дозе 1,75 мг в пересчете на одного взрослого человека. 

Известно, что у пятимесячных трансгенных мышей линии APP/PS1 амилоидные бляшки образуются в течение 24 ч [28], после чего эти бляшки находятся в динамическом равновесии с растворимыми олигомерами Aβ, и некоторые из таких олигомеров вследствие своих структурно-функциональных особенностей инициируют возникновение новых амилоидных бляшек [29]. Недавно на модельных животных было установлено, что механизм антиамилоидного действия HAEE основан на способности этого пептида эффективно проходить из крови сквозь гематоэнцефалический барьер в ткани мозга и связываться с молекулами Aβ, которые присутствуют как в виде растворимых мономеров и олигомеров, так и в составе нерастворимых амилоидных бляшек, что обеспечивает быстрый вывод избыточных молекул Aβ из головного мозга [18, 30].

Полученные в настоящей работе данные о том, что повышение дозы свыше 0,30 мг/кг не приводит к усилению антиамилоидных эффектов пептида HAEE, указывают на ограниченное количество лекарственных мишеней для HAEE, т. е. данной дозы достаточно, чтобы молекулы HAEE эффективно «счищали» с поверхности нейронов уже образовавшиеся амилоидные бляшки и препятствовали образованию растворимых олигомеров Aβ.

ВЫВОДЫ

Настоящее исследование позволило установить значение 0,30 мг/кг в качестве оптимальной терапевтической дозы синтетического пептида Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 (HAEE) для эффективного подавления церебрального амилоидоза у мышей обоих полов трансгенной линии APP/PS1. Мышей данной линии широко применяют во всем мире как модельных животных при изучении патогенеза болезни Альцгеймера, поэтому научные результаты, полученные с использованием этой модели, рассматривают в качестве высоконадежных для трансляции в медицинскую практику. Таким образом, результаты исследования предоставляют научное обоснование применения многократных подкожных инъекций синтетического пептида HAEE, приготовленного в 0,5 мл физиологического раствора в дозе 1,75 мг, для проведения клинических испытаний первой фазы. Безусловно, эффективность пептида HAEE в качестве антиамилоидного средства для болезньмодифицирующей терапии БА может быть доказана только в дальнейших клинических испытаниях, и полученные результаты — необходимый элемент для их успешного проведения.