Как известно, ожоговая травма — тяжелое повреждение тканей, которое наиболее часто вызвано термическим воздействием и может привести к снижению основных функций организма, инвалидизации и смерти [1–3]. Возросшее за последние годы количество чрезвычайных ситуаций, вооруженных конфликтов, а также бытовой травматизм обусловливают повышенный риск получения термических ожогов у достаточно широкой группы людей [4]. Несмотря на интенсивное развитие регенеративной медицины, успешное лечение ожоговых ран до сих пор остается непростой задачей. Ее решению препятствует замедление процесса заживления вследствие серьезных метаболических нарушений, заболеваний сердечнососудистой системы, раневой инфекции и др., а также недостаточной эффективности применяемых лекарственных средств [2, 4]. В связи с этим разработка и изучение новых эффективных и безопасных препаратов с противоожоговым действием в настоящее время продолжают оставаться актуальными.

Для создания нового средства фармакотерапии термических ожогов наше внимание привлекли полипренолы — группа длинноцепочечных изопреноидных спиртов, которые содержатся в клетках бактерий, растений и млекопитающих. Уникальность химического строения и наличие полимеров-гомологов определяют многообразие фармакологических свойств данного класса химических соединений. Являясь природными биорегуляторами, они участвуют в синтезе гликопротеинов клеточных мембран, оказывают выраженное гепато-, нейро- и кардиопротекторное действие, улучшают когнитивные функции, обладают антиоксидантной, гиполипидемической, противовоспалительной, иммуномодулирующей, антибактериальной, противовирусной и противоопухолевой активностью, стимулируют синтез белка, проявляя регенераторные свойства и др. [5–9].

Основными источниками получения субстанции полипренолов являются хвойные деревья — различные виды ели (Picea spp.), пихты (Abies spp.), сосны (Pinus spp.), а также гинкго двулопастный (Ginkgo biloba L.). При этом показано преобладание в субстанции Picea abies L. более коротких полипренолов по сравнению с образцом Ginkgo biloba L. [10].

На основе полипренолов был разработан новый крем следующего состава: действующее вещество — субстанция полипренолов Ginkgo biloba L., высокоочищенная с их содержанием не менее 95%; вспомогательные вещества из группы липидов (фосфатидилхолин, фосфатидилсерин) и антиоксиданты из группы токоферолов.    

В связи с этим цель настоящей работы — изучение противоожогового действия нового крема на основе полипренолов, выделенных из Ginkgo biloba L., на модели термического ожога у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 32 крысах-самцах линии Вистар массой 280–320 г (филиал «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская область, Россия). Животных содержали в контролируемых условиях вивария (температура 20–22 °С, относительная влажность воздуха 40–50%, 12-часовой цикл освещения), с доступом к стандартному гранулированному корму и фильтрованной водопроводной воде ad libitum. Перед постановкой эксперимента все особи проходили карантин в течение 14 дней.

Животным под общей анестезией смесью золетила и ксилазина (внутримышечно) наносили на кожу в области холки термический ожог III Б степени в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2012) [11]. Для получения ожога на предварительно депилированную кожу крыс устанавливали на 15 с разогретую до 120 °С металлическую гирю (из нержавеющей стали) массой 100 г (диаметр контактной поверхности — 2,3 см). В дальнейшем после индукции ожога и в течение периода наблюдения обезболивание не проводили.

Животные были разделены на четыре группы по восемь особей в каждой: К — контроль (ожог без лечения); М — метилурацил; Д — декспантенол; ПП — новый крем с полипренолами. На область ожога ежедневно в течение 21 суток в дозе 0,15 г наносили исследуемый крем с полипренолами, а также препараты сравнения — диоксометилтетрагидропиримидин (метилурацил, мазь для местного и наружного применения 10%; «Нижфарм», Россия) и декспантенол (пантенол 3Д, мазь для наружного применения 5%; «Зеленая дубрава», Россия). Выбор препаратов сравнения был обусловлен тем, что они имеют различные механизмы ранозаживляющего действия (диоксометилтетрагидропиримидин обладает анаболической активностью и нормализует нуклеиновый обмен, декспантенол восполняет дефицит пантотеновой кислоты, являющейся субстратным стимулятором синтеза кофермента A) и широко применяются в клинической практике. Наблюдение за процессом заживления ожоговых ран проводили ежедневно, величину ожоговых дефектов измеряли раз в 7 суток, подсчитывая площадь поражения кожи с помощью программы ImageJ (Национальные институты здравоохранения и лаборатория оптической и вычислительной аппаратуры Университета Висконсина; США).

На 21-е сутки животных подвергали эвтаназии (CO₂-камера), препарировали участок кожи в области ожога и фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, после чего образцы биоматериала по стандартной методике заливали в парафин. Морфологическое исследование выполняли на светооптическом уровне. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Accu-Cut SRM (Sakura, Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Просмотр микропрепаратов проводили на исследовательском универсальном микроскопе (Olympus, Япония), используя малое (10 × 4) и большое увеличение (10 × 40); для фотофиксации использовали камеру UC30 (Olympus, Япония).

Кроме описания микропрепаратов, для объективной оценки динамики морфологических изменений кожи на 21-е сутки после ожога проводили их количественный анализ в баллах по шкале, учитывая следующие показатели:

― степень присутствия мононуклеарных лейкоцитов / новообразованных сосудов / клеток жировой ткани в дерме: 0 — отсутствие; 0,5 — единичные клетки; 1 — умеренное присутствие; 2 — сильно выраженное присутствие;

― степень образования корочек / рыхлой соединительной ткани / волокнистой соединительной ткани в области повреждения: 0 — отсутствует; 0,5 — присутствует;

― степень образования слоев кожи в месте повреждения: 0 — отсутствие разделения на слои в раневой области; 0,5 — присутствует, дерма и эпидермис не сформированы; 1 — присутствует дерма и эпидермис;

― степень сформированности эпителия в раневой области: 0 — отсутствует; 0,5 — частично присутствует; 1 — полностью сформирован.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы BioStat Pro 7. Данные проверяли на нормальность распределения по критерию Шапиро– Уилка. Так как выборки имели нормальное или близкое к нормальному распределение, значимость различий между экспериментальными группами определяли, используя параметрический t-критерий Стьюдента. Результаты представляли в виде M ± m. Различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У крыс при моделировании термического ожога кожи III Б степени в течение первых суток образовывалась небольшая сухая корка (струп) темно-красного цвета с ровными краями. Площадь поражения кожи составила в контрольной группе 381,6 ± 19,9 мм², в группах М, Д и ПП — 464,4 ± 34,6, 441,8 ± 22,3 и 426,2 ± 11,1 мм² соответственно. Цвет и форма струпа оставались неизменными в течение всего эксперимента. 

Через 7 суток после нанесения ожога площадь поражения кожи во всех исследованных группах животных статистически достоверно не отличалась от данного показателя на первые сутки, принятого за 100% (рис. 1).

Через 14 суток после ожога площадь поражения кожи во всех группах по сравнению с исходными значениями существенно сократилась, однако статистически значимой разницы между действием нового крема с полипренолами, препаратов сравнения метилурацила и декспантенола и контрольными животными обнаружено не было (рис. 1).

Наиболее выраженный ранозаживляющий эффект изучаемого крема наблюдался через 21 сутки от начала эксперимента. Он значимо (p < 0,05) уменьшал площадь поражения кожи по сравнению с контролем в 2,3 раза (рис. 1). У некоторых животных происходили полное отслоение струпа и заживление раны.

Несколько менее эффективными оказались метилурацил и декспантенол, причем действие первого из них не носило достоверного отличия от контроля, а второй уменьшал площадь поражения в 1,7 раза (p < 0,05) в сравнении с крысами контрольной группы. Необходимо отметить, что у животных указанных групп отслоения струпа не происходило.

Результаты приведенного выше изменения площади поражения кожи подтверждаются данными морфологических исследований. Так, у животных контрольной группы на 21-е сутки после ожога раневая поверхность была покрыта струпом, который обильно инфильтрирован полиморфноядерными лейкоцитами. Эпителизация раны характеризовалась наличием всех слоев на ее краю, доходила до одно- и двуслойного эпидермиса в центре и занимала незначительную (до 20%) часть раневой поверхности. Было также отмечено начало формирования дермы. Под струпом располагалась соединительная ткань, содержащая от умеренного до большого количества новообразованных сосудов и инфильтрированная лейкоцитами (в основном — мононуклеарами и макрофагами). Схожие изменения наблюдались и у крыс в группах метилурацила и декспантенола, но соединительная ткань под струпом содержала большее количество новообразованных сосудов (рис. 2).

В группе с применением нового крема с полипренолами у части животных раневая поверхность была полностью покрыта сформированным эпителием, под которым определялась сформировавшаяся соединительная ткань, содержащая единичные новообразованные сосуды и слабо инфильтрированная лейкоцитами (мононуклеары и макрофаги). У остальных животных раневая поверхность была покрыта струпом, обильно инфильтрированным полиморфноядерными лейкоцитами. Эпителизация занимала от 30% раневой поверхности: со всеми слоями по краям раны до одно- и двуслойного эпидермиса в центре. Под струпом определялась соединительная ткань, инфильтрированная лейкоцитами, с большим количеством новообразованных сосудов.

При оценке выраженности морфологических изменений по шкале в баллах на 21-е сутки после ожога показатель в контрольной группе составил 4,1 ± 0,5 балла. Эффект метилурацила и декспантенола статистически достоверно не отличался от контрольных значений (рис. 3). Новый крем с полипренолами вызывал более выраженное заживление раны, значимо (p < 0,05) превосходя по количеству баллов группы контроля и метилурацила в 1,4 и 1,3 раза соответственно (рис. 3). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами результаты подтверждаются данными литературы. Так, ранее продемонстрировано, что полипренолы, выделенные из Alceae nudiflora (штокроза голоцветковая), обладают противоожоговыми и ранозаживляющими свойствами у крыс с термическими ожогами III A и Б степени, а также резаными плоскостными полнослойными и линейными ранами. Их применение способствовало более раннему закрытию раневого дефекта кожи животных и значительному уменьшению плотности рубца, усиливало процессы эпителизации, развития грануляционной ткани и коллагеногенеза. По выраженности действия изученные полипренолы превосходили облепиховое масло, а их эффект выражался в более быстром, чем у контрольных животных, отхождении струпа и значительной активации пролиферативных и биосинтетических процессов в клетках эпидермиса и дермы. В свою очередь у крыс с аллоксановым сахарным диабетом показано, что местное применение полипренолов способствует восстановлению основных показателей белкового, углеводного и липидного обмена в клетках эпидермиса и развитию более прочного рубца [12, 13]. Установлено, что индивидуальные полипренолы, полученные из листьев Vitis vinifera subsp. Silvestris (виноград дикий), и цельная полипренольная фракция, содержащая токоферолы и фитостерины, обладают у мышей с чистыми плоскостными полнослойными кожными ранами выраженным ранозаживляющим действием, превосходя эффект облепихового масла [14].

В исследовании с участием пациентов с ожогами, гнойными ранами и другими гнойно-воспалительными заболеваниями кожи и мягких тканей различных локализаций установлено, что лекарственный препарат абисил (раствор для местного и наружного применения масляный 20%), содержащий в своем составе природный набор терпеноидов пихты сибирской (Abies sibirica L.) и обладающий ранозаживляющим действием в эксперименте, давал положительный клинический эффект у 86,5–96,3% больных [15].

Что касается возможных механизмов ранозаживляющего действия полипренолов, то, по мнению ряда исследователей, они связаны с активацией пластических процессов в клеточных структурах практически всех видов тканей, подавлением окислительного стресса вследствие способности данного класса веществ к окислению, повышением активности ферментов естественной антиоксидантной защиты клеток, а также восполнением уровня долихолфосфата и его участия в долихолфосфатном цикле — важном метаболическом звене регенерации, дифференциации и пролиферации клеток [16, 17]. Кроме того, полипренолы повышают текучесть и проницаемость биологических мембран, изменяя структуру жирных кислот, что приводит к стимуляции обменных процессов и повышению жизнеспособности клеток [18].

Наши данные об эффектах препаратов сравнения согласуются с результатами исследований других авторов. Ранее было выявлено, что на модели плоскостной кожной раны у крыс метилурацил вызывает полное заживление лишь у части животных на 24–29 сутки эксперимента [19]. В образцах кожи при этом отмечалось большое количество растянутых сосудов (неполная репарация), истонченный эпителий (или он и дерма были вовсе не восстановлены), под дермой — лимфоидная инфильтрация, гемосидероз, отсутствие лейкоцитов и некротического детрита. Как и в нашем исследовании декспантенол у крыс с ожогами III A степени не приводил к отшелушеванию образовавшегося струпа на протяжении всего эксперимента, а заживление раны происходило только к 25-м суткам [20]. Аналогичные результаты были получены и в другой работе в близких экспериментальных условиях: на 21-е сутки после термического ожога у всех животных после применения указанного препарата сохранялись раны со струпом [21].

Необходимо отметить, что выбранная нами экспериментальная модель термического ожога является официально рекомендованной для изучения действия лекарственных средств [11], но использование полученных с ее помощью результатов для прямой экстраполяции на человека требует тщательного анализа и учета множества факторов, включая методологические, патофизиологические и биохимические.

Таким образом, можно заключить, что у крыс с термическим ожогом III Б степени новый крем на основе полипренолов, выделенных из Ginkgo biloba L., обладает противоожоговыми свойствами, на 21-е сутки после ожога уменьшая площадь поражения кожи по сравнению с контролем в 2,3 раза и превосходя по данным морфологической оценки препарат сравнения метилурацил в 1,3 раза. Данный крем является перспективным для дальнейшего доклинического изучения в качестве потенциального противоожогового и ранозаживляющего средства.

ВЫВОДЫ

У крыс с термическим ожогом III Б степени новый крем на основе полипренолов, выделенных из Ginkgo biloba L., оказывает противоожоговое действие, на 21-е сутки после ожога уменьшая площадь поражения кожи по сравнению с контролем в 2,3 раза. По выраженности противоожогового действия новый крем на основе полипренолов превосходит препарат сравнения метилурацил в 1,3 раза по данным морфологической оценки.