Сахарный диабет (СД) — одна из ведущих неинфекционных патологий, распространенность которой продолжает увеличиваться во всем мире [1, 2]. СД ассоциирован с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, включая нарушения мозгового кровообращения, а также с повышенной вероятностью развития когнитивных нарушений и нейродегенеративных заболеваний [3, 4]. Одними из факторов, связывающих СД с развитием коморбидных патологий, являются системное воспаление и нейровоспаление, сопровождающие это заболевание [5, 6].

Одним из механизмов, связывающих хроническую гипергликемию с воспалительным ответом, является неферментативное гликирование белков и других молекул. При избытке глюкозы ее карбонильная группа вступает в реакцию со свободными аминогруппами, что приводит к образованию конечных продуктов гликирования (AGE) [7]. Взаимодействие AGE с рецепторами конечных продуктов гликирования (RAGE, receptor for advanced glycation end products) активирует сигнальные пути MAPK/ERK (митоген-активируемая протеинкиназа / киназа, регулируемая внеклеточным сигналом), TGFβ (трансформирующий фактор роста β), JNK (c-Jun N-концевая киназа) и NF-κB (ядерный фактор κB), что сопровождается высвобождением провоспалительных медиаторов, включая интерлейкин-1 (IL1), интерлейкин-6 (IL6) и фактор некроза опухоли-α (TNFα) [8]. Кроме того, AGE/RAGE-взаимодействие и аутоокисление глюкозы усиливают образование активных форм кислорода (АФК), что дополнительно поддерживает воспалительный ответ при СД [9, 10]. Метаболические нарушения при СД также способствуют эндотелиальной дисфункции. В частности, инсулинорезистентность сопровождается снижением активности PI3K/Akt-сигнального пути (фосфоинозитид-3- киназа / протеинкиназа B) и компенсаторным усилением MAPK/ERK-зависимой сигнализации, что приводит к снижению продукции оксида азота (NO) и повышению образования эндотелина-1 в эндотелиальных клетках [11, 12]. На фоне эндотелиальной дисфункции, активации астроцитов и микроглии может нарушаться целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), что способствует развитию нейровоспаления и нейродегенеративных изменений [13, 14].

Понимание молекулярных механизмов, связывающих диабет и воспаление, способствует поиску новых терапевтических стратегий, направленных на коррекцию воспалительных процессов при СД и профилактику неврологических осложнений. Одним из перспективных направлений является изучение роли β-аррестинов — многофункциональных белков, участвующих в регуляции сигнальных путей, связанных с метаболизмом глюкозы и воспалительными процессами [15].

β-Аррестин 2 впервые был описан из-за его ключевой роли в десенсибилизации рецепторов, связанных с G-белками (GPCR) [16]. Однако, помимо регуляции GPCR, β-аррестин 2 выполняет важную адаптерную функцию, участвуя в передаче сигналов с помощью каскадов как связанных (активация ERK, JNK и p38-киназ) [17], так и не связанных с G-белками (Wnt, Notch, TGFβ, Hedgehog) [18]. β-Аррестин 2 необходим для нормальной секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы [19]. Кроме того, он ингибирует проведение сигнала рецепторов глюкагона и способствует поддержанию эугликемии [15]. Однако, по литературным данным, β-аррестин 2 оказывает разнонаправленное влияние на воспалительный процесс, выступая как про-, так и противовоспалительным фактором. При воспалении у мышей с глобальным нокаутом гена β-аррестина 2 (Arrb2, arrestin beta 2) была усилена экспрессия провоспалительных маркеров IL6, IL1 β, TNFα и ингибитора киназы β NF-κB (IKKβ) [20]. Однако в фибробластах мыши экспрессия β-аррестина 2 необходима для активации NF-κB через рецептор лизофосфатидной кислоты (LPA) [21]. β-Аррестин 2 стимулирует пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток (ГМК) из медии в интиму, увеличивая размер атеросклеротического поражения [22].

Таким образом, цель данной работы — оценить провоспалительный статус мышей нокаутных по гену β-аррестина 2 на фоне длительного стрептозотоцин- вызванного диабета.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Эксперименты проводили на самцах мышей линии C57BL/6J и мышей с глобальным нокаутом гена Arrb2 (Arrb2-/-), полученных на генетическом фоне C57BL/6J, массой 15–25 г в возрасте 8 недель. Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 22 °С, 12-часовом световом режиме и свободном доступе к пище и воде. Использованная линия Arrb2-/- ранее была верифицирована методами ПЦР и вестерн-блот анализа [23].

Моделирование СД

Животные были случайным образом разделены на четыре группы. Контрольные группы без диабета: животные дикого типа (WT) и с нокаутом по гену Arrb2 (KO), и опытные группы с диабетом: также дикого типа (WTd) и с нокаутом Arrb2 (KOd). Для моделирования СД животным внутрибрюшинно (в/б) вводили стрептозотоцин (STZ) в течение 5 дней подряд. За 4 ч до инъекции доступ животных к корму прекращали. Затем опытным группам WTd и KOd в/б вводили STZ (Sigma Aldrich Co., США), растворенный в свежеприготовленном 50 мМ натрий-цитратном буфере (pH 4,5), в дозе 55 мг/кг. Контрольным группам WT и KO в/б вводили эквивалентный объем цитратного буфера.
Животным измеряли уровень глюкозы с помощью глюкометра Diacont Classic 2598 (Тайвань) на 1, 5, 10, 18, 25, 32 и 39 дне от начала введения STZ. В те же дни проводили мониторинг веса животных. Каплю крови для анализа отбирали пункцией боковой хвостовой вены. Перед измерением уровня глюкозы прекращали доступ к корму на 4 ч.

Оценка уровня системного воспаления

Для оценки уровня системного воспаления у животных определяли соотношение нейтрофилов в мазках крови из боковой хвостовой вены. Взятие мазка проводили в те же дни, что и измерение уровня глюкозы. Мазки фиксировали метанолом (FisherChemical, Германия), окрашивали красителем Гимзы («ПанЭко», Россия) в течение 10‒15 мин и анализировали при увеличении 400×. Перед микроскопическим анализом препараты кодировали; исследователь, проводивший подсчет лейкоцитарной формулы, не имел информации о принадлежности образца к экспериментальной группе. Подсчет клеток проводили вручную с использованием программы WBC Counter (Kazuyoshi Sasaoka, Япония) до достижения общего числа лейкоцитов, равного 100, после чего рассчитывали процент нейтрофилов. Референсными значениями для взрослых мышей линии C57BL/6J считали следующие: сегментоядерные нейтрофилы — 8–20%, лимфоциты — 76–91% [24]. Для анализа динамики нейтрофильного звена долю нейтрофилов дополнительно нормировали на индивидуальное значение, полученное у того же животного на 1-й день эксперимента.

Измерение уровня экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов и рецепторов PAR

Уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов (Il6, Il1b, Tnf) и рецепторов, активируемых протеазами 1 и 4 (Par1, Par4) оценивали с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР).
Образцы гиппокампа и коры правого полушария гомогенизировали в реагенте ExtractRNA («Евроген», Россия), тотальную РНК выделяли согласно протоколу производителя. Концентрацию и чистоту РНК оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, США); для дальнейшего анализа использовали образцы с A260/280 = 1,8–2,0 и A260/230 = 1,8–2,2. Для получения достаточного количества РНК часть образцов коры и гиппокампа объединяли в пулы.

После обработки ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США) проводили синтез кДНК с использованием набора MMLV RT («Евроген», Россия). В реакции обратной транскрипции использовали смесь праймеров Random(dN)10 и Oligo(dT)15.
ПЦР в реальном времени проводили в амплификаторе CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием SYBR Green I (смесь 5х qPCRmix-HS SYBR; «Евроген», Россия). Специфичность амплификации контролировали по кривым плавления; в качестве отрицательного контроля использовали реакцию без матрицы. Последовательности праймеров представлены в .
Эффективность всех пар праймеров составляла 95– 105%. Уровень экспрессии рассчитывали методом ΔΔCq с нормализацией на референсный ген β-актина (Actb). Все образцы анализировали в трех параллельных повторах.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили в программе GraphPad Prism версии 8.0.1 (GraphPad Software Inc., США). Нормальность распределения полученных данных определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка, выбросы — с помощью теста ROUT при Q = 1%. Для оценки статистической значимости использовали непарный t-тест или двухфакторный дисперсионный анализ (two-way ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки; при неравных размерах групп применяли поправку Тьюки–Крамера, автоматически реализованную в GraphPad Prism. В рамках post-hoc-анализа оценивали влияние как диабета внутри каждого генотипа (WT/WTd и KO/KOd), так и генотипа в соответствующих условиях: WT/KO в контроле и WTd/ KOd на фоне диабета. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. На рисунках отмечены только статистически значимые различия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние нокаута гена Arrb2 на формирование признаков диабета

Ключевым повреждающим фактором, определяющим развитие диабетических осложнений у экспериментальных животных, является хроническая гипергликемия. Используемый нами протокол введения STZ приводил к стойкому повышению уровня глюкозы у животных дикого типа на 10-й день эксперимента — концентрация глюкозы в крови составляла 17,06 ± 4,41 ммоль/л, что соответствует значениям тяжелой гипергликемии. Концентрация глюкозы в крови мышей из группы KOd статистически не отличалась от таковой у группы KO вплоть до 25 дня эксперимента. На 25-й день концентрация глюкозы в крови у мышей KOd достигала значения 12,93 ± 5,93 ммоль/л, что соответствует легкой форме гипергликемии, а тяжелая гипергликемия (17,28 ± 5,75 ммоль/л) развивалась только на 32-й день. К концу эксперимента на 39-й день после первой инъекции STZ уровень глюкозы у животных WTd (22,3 ± 8,09 ммоль/л) был значимо выше, чем у животных KOd (14,37 ± 7,65 ммоль/л) ().

Наряду с гипергликемией, другим симптомом, характерным для СД1, является снижение массы тела, поэтому данный параметр оценивали регулярно наряду с изменением концентрации глюкозы. В нашем исследовании во всех группах животных наблюдалось увеличение массы тела при сравнении 1 и 39 дней эксперимента. У животных WT и WTd увеличение составило 3,23 ± 0,83 г и 0,84 ± 1,54 г, у KO и KOd — 7,00 ± 0,79 г и 1,72 ± 1,46 г соответственно. Таким образом, диабет статистически значимо снижает прирост веса у мышей как дикого типа, так и с нокаутом гена Arrb2. У нокаутных мышей при этом прирост веса на протяжении всего эксперимента как в отсутствие диабета, так и на его фоне был более чем в 2 раза выше в сравнении с диким типом (). Также следует отметить наличие статистически значимых различий между животными дикого типа и нокаутными уже в начале эксперимента. На 1-й день наблюдения масса тела мышей дикого типа составляла 21,88 ± 1,37 г, тогда как у Arrb2-/- животных — 18,81 ± 3,37 г.

Влияние нокаута гена Arrb2 на уровень системного воспаления на фоне диабета

В качестве показателя системного воспаления мы подсчитывали долю нейтрофилов в мазках периферической крови с использованием окрашивания по Романовскому– Гимзе. Не было выявлено статистически значимых различий в уровне нейтрофилов между группами WT и WTd как на протяжении всего эксперимента, так и при сравнении начальных и конечных значений. В то же время у животных из группы KOd наблюдалось значимое повышение доли нейтрофилов на 18-й день эксперимента при сравнении со значениями первого дня в той же группе. Кроме того, у животных KOd уровень нейтрофилов был значимо выше по сравнению с животными KO (А). Однако стоит отметить, что в начале эксперимента фоновое значение доли нейтрофилов в крови у мышей с нокаутом было в 2,6 раза выше, чем у животных дикого типа: 40,8 ± 10,3% против 15,6 ± 5,3% соответственно (Б).

Влияние нокаута гена Arrb2 на экспрессию мРНК генов Il6, Il1b и Tnf в коре и гиппокампе на фоне диабета

Для оценки уровня экспрессии генов провоспалительных цитокинов IL6, IL1β и TNFα мы использовали метод ПЦР в реальном времени. Между группами WT и WTd статистически значимых различий в уровне экспрессии мРНК исследуемых генов в мозге не наблюдалось. В то же время у мышей KOd на фоне диабета была значимо повышена экспрессия мРНК генов Il6 и Il1b в коре мозга по сравнению с группой KO. Кроме того, уровень экспрессии мРНК генов Il6, Il1b и Tnf в гиппокампе и Tnf в коре был значимо выше как у KO мышей, по сравнению с группой WT, так и у KOd по сравнению с WTd ().

Влияние нокаута Arrb2 на экспрессию мРНК генов PAR1 и PAR4 в коре и гиппокампе на фоне диабета

Рецепторы, активируемые протеазами (PAR), играют важную роль в регуляции воспаления. Уровень экспрессии мРНК генов Par1 и Par4 в коре и гиппокампе был значимо повышен у мышей с нокаутом Arrb2 по сравнению с диким типом как в норме, так и на фоне диабета. Кроме того, у группы KOd было отмечено статистически значимое увеличение экспрессии мРНК Par4 в гиппокампе по сравнению с группой KO ().

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Динамика повышения уровня глюкозы в крови у животных дикого типа на фоне введения STZ в нашем исследовании соответствовала описанной в литературе при использовании стандартного протокола [25]. Неожиданным наблюдением стало замедленное развитие гипергликемии у мышей с нокаутом гена Arrb2, у которых тяжелая форма диабета развивалась лишь к 32-му дню, а конечный уровень глюкозы был значимо ниже, чем у мышей дикого типа ().

Этот результат, казалось бы, противоречит известной роли β-аррестина 2 как позитивного регулятора глюкозо- зависимой секреции инсулина: в физиологических условиях данный белок участвует в активации кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CаMKII) в β-клетках и поддержании их нормальной функции [19, 26]. Однако в модели STZ-индуцированного диабета ключевым фактором прогрессирования гипергликемии является не столько функциональная недостаточность секреции инсулина, сколько повреждение и гибель β-клеток. STZ селективно захватывается β-клетками через низкоаффинный транспортер глюкозы GLUT2 и вызывает нитрозативный и окислительный стресс, активацию MAPK- зависимых сигнальных каскадов и повреждение ДНК [27]. Поэтому мы предполагаем, что протективный эффект нокаута Arrb2 связан не с улучшением функционального состояния β-клеток, а с повышением их устойчивости к цитотоксическому действию STZ.

Важную роль в замедленном развитии гипергликемии у нокаутных животных может играть модуляция окислительного стресса. Показано, что у Arrb2-/- мышей развитие фиброза печени, вызванного CCl₄, сопровождалось менее выраженным воспалением и повреждением клеток, что авторы связывали со снижением уровня NADPH-оксидазы 4 (NOX4) [28]. NOX4 является одним из источников АФК в β-клетках, а ее ингибирование способствует их выживанию при диабете [29, 30]. Таким образом, отсутствие β-аррестина 2 могло снижать выраженность NOX4-зависимого окислительного повреждения, индуцированного STZ.

Другим возможным механизмом замедленного развития гипергликемии у нокаутных мышей является ослабление провоспалительной сигнализации в островках поджелудочной железы. Известно, что β-аррестин 2

образует комплекс с p38 MAPK и потенциирует ее активацию [31]. Этот сигнальный каскад также активируется под воздействием провоспалительных цитокинов и стимулирует разрушение β-клеток и развитие гипергликемии [32]. У мышей с нокаутом гена Mkk3 (киназы MKK3, активирующей p38 MAPK) наблюдалось уменьшение цитотоксических эффектов STZ за счет снижения инфильтрации β-клеток лейкоцитами и выработки провоспалительных цитокинов [33]. Следовательно, у мышей Arrb2-/- может быть нарушена активация каскада p38 MAPK в ответ на повреждение, что способствует сохранению функционально активных β-клеток.

Несмотря на то что в нашем исследовании у нокаутных мышей наблюдался повышенный уровень системного воспаления в плазме крови, локальные эффекты в микроокружении островков Лангерганса могут отличаться. Возможно, снижение способности иммунных клеток к инфильтрации и активации (опосредованное механизмами p38 MAPK и NOX4) перевешивает системный провоспалительный фон. Кроме того, β-аррестин 2 участвует в хемотаксисе нейтрофилов через интернализацию рецепторов хемокинов [34], и его отсутствие могло нарушить рекрутирование иммунных клеток в островки.

Таким образом, замедленное развитие гипергликемии у мышей с Arrb2-/- на модели STZ-диабета, вероятно, является следствием комбинации факторов: снижения окислительного стресса (через NOX4), ослабления p38 MAPK-зависимого воспаления и нарушения рекрутирования иммунных клеток к островкам. Это позволяет предположить, что β-аррестин 2 в условиях токсического стресса способствует гибели β-клеток, а его отсутствие оказывает защитное действие, несмотря на возможные нарушения в базальной секреции инсулина, описанные в физиологических условиях.

В нашем исследовании наблюдалось увеличение массы тела мышей во всех группах, что, вероятно, связано с продолжающимся ростом животных в период с 2-го по 3-й месяц жизни. Диабет статистически значимо снижал прирост массы у мышей обоих генотипов по сравнению с соответствующими контрольными группами (), что согласуется с классическими представлениями о метаболических нарушениях при СД1. Следует отметить, что после введения STZ в литературе описаны различные варианты динамики массы тела — от отсутствия изменений до увеличения или снижения [25].

Более выраженный прирост массы тела у нокаутных мышей следует интерпретировать с учетом исходных различий между группами — на начало эксперимента Arrb2-/- животные имели статистически значимо меньшую массу тела по сравнению с мышами дикого типа. Кроме того, β-аррестин 2 является негативным регулятором сигнального пути β3-адренорецепторов (β3-AR) в адипоцитах, основные функции которого — стимуляция липолиза, термогенеза и усиление потребления кислорода митохондриями. Нокаут β-аррестина 2 приводит к пролонгированию β3-AR сигналинга и стимуляции образования бурой жировой ткани, что предположительно способствует снижению массы жировой ткани [35].

Более выраженный прирост массы тела у Arrb2-/- мышей, вероятно, обусловлен совокупностью факторов. Во-первых, нокаутные животные исходно имели меньшую массу, что могло способствовать более высокому относительному приросту в фазе активного возрастного роста, характерной для мышей линии C57BL/6J в возрасте 5–12 недель [36, 37]. Во-вторых, развитие тяжелой гипергликемии у Arrb2-/- животных было замедленным, что, вероятно, сопровождалось менее выраженными катаболическими эффектами диабета и способствовало лучшему сохранению массы тела. Таким образом, различия в динамике массы могут отражать не прямое влияние отсутствия β-аррестина 2 на процессы роста, а опосредованное влияние на метаболические процессы.

В нашем исследовании STZ-вызванный диабет не оказал значимого влияния на уровень нейтрофилов у мышей дикого типа (А). Отсутствие выраженного нейтрофильного ответа у мышей WTd может быть связано с тем, что используемая модель, несмотря на развитие тяжелой гипергликемии, не сопровождается столь выраженным системным воспалительным ответом, как модели с высокожировой диетой или аутоиммунные модели СД1. Кроме того, сроки наблюдения (39 дней) могут быть недостаточными для развития хронического системного воспаления, регистрируемого по изменению лейкоцитарной формулы.

В отличие от эффекта диабета, фактор генотипа оказал существенное влияние на уровень нейтрофилов. Уже на первый день эксперимента мыши Arrb2-/- имели значимо более высокую базальную долю нейтрофилов по сравнению с диким типом (Б), а на фоне диабета у группы KOd наблюдалось дополнительное повышение этого показателя по сравнению с KO (А). Полученные данные согласуются с известной ролью β-аррестина 2 как негативного регулятора системных воспалительных реакций. Показано, что β-аррестин 2 необходим для интернализации рецепторов хемокинов CXCR1 и CXCR2. У мышей Arrb2-/- нарушение этого механизма приводит к усилению хемотаксиса нейтрофилов в очаги воспаления и повышению продукции IL8, IL6 и TNFα [38, 39]. Таким образом, отсутствие β-аррестина 2 создает провоспалительный фон, который в условиях диабета может дополнительно усиливаться.

Для понимания наших результатов важно отметить, что в литературе описаны разнонаправленные изменения нейтрофилов при диабете. При СД может повышаться продукция провоспалительных цитокинов нейтрофилами [40] и усиливаться рекрутирование лейкоцитов в очаг воспаления [41], однако в других условиях, включая ранние стадии СД1 [42] или при снижении HbA1c ≥ 1,5% на фоне терапии с помощью сахароснижающих препаратов, количество циркулирующих лейкоцитов и нейтрофилов может снижаться [43]. Эти данные подчеркивают сложность регуляции нейтрофильного звена при диабете и важность учета как модели заболевания, так и генетических факторов при интерпретации результатов.

Анализ экспрессии генов провоспалительных маркеров в тканях мозга выявил значимое повышение уровней мРНК генов Il6, Il1b и Tnf в коре и гиппокампе у мышей с нокаутом гена Arrb2 как в контроле, так и на фоне диабета (). У животных дикого типа индукция диабета не приводила к статистически значимым изменениям экспрессии мРНК исследуемых цитокинов. Полученные данные свидетельствуют о том, что ключевым фактором, определяющим провоспалительный статус в исследованных отделах мозга, является генотип, а отсутствие β-аррестина 2 создает базальный провоспалительный фон. Сходная закономерность наблюдалась и для рецепторов, активируемых протеазами (PAR). Экспрессия мРНК генов Par1 и Par4 была значимо повышена в коре и гиппокампе у мышей Arrb2-/- по сравнению с диким типом как в контроле, так и на фоне диабета, с дополнительным увеличением экспрессии Par4 в гиппокампе в группе KOd по сравнению с KO ().

Полученные результаты согласуются с известной ролью β-аррестина 2 как негативного регулятора воспалительных реакций в ЦНС. Согласно литературным данным, β-аррестин 2 является важным негативным регулятором TLR4 (toll-подобный рецептор 4)-опосредованной продукции NLRP3 (белок семейства NOD-подобных рецепторов с пириновым доменом 3) [44]. Кроме того, β-аррестин 2 может напрямую связываться с TRAF6 и снижать фосфорилирование NF-κB посредством ингибирования олигомеризации и убиквитинирования TRAF6 (фактор, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли 6), что дополнительно ингибирует активацию пути NF-κB [45]. β-Аррестин 2 подавляет также активацию астроцитов через G-белок независимый сигналинг дофаминовых рецепторов D2 и нарушает сборку NLRP3-инфламмасомы [46]. Показано, что у мышей Arrb2-/- по сравнению с диким типом стимуляция LPS (липополисахариды) вызывает более выраженную гибель нейронов и активацию микроглии, сопровождающуюся повышением провоспалительных маркеров IL6, IL1β, TNFα и Nos2 и снижением противовоспалительных маркеров Arg1, Ym-1 и Mrc1 [20].

PAR1 и PAR4 — рецепторы, сопряженные с G-белками и активируемые протеолитическим расщеплением. Тромбин является одним из основных физиологических активаторов данных рецепторов, при этом PAR1 имеет более высокую аффиность к тромбину, чем PAR4 [47]. PAR обнаружены как в нейронах, так и в глиальных клетках. В патофизиологических условиях активация PAR1 в астроцитах стимулирует выброс глутамата и выработку провоспалительных цитокинов TNFα, IL6, IL1β и iNOS. PAR4 стимулирует секрецию TNFα, способствует активации транскрипционного фактора NF-κB, вызывает длительное повышение внутриклеточного кальция, а также увеличивает продукцию АФК [48].

В совокупности полученные данные указывают на противовоспалительную функцию β-аррестина 2 в центральной нервной системе (ЦНС). Его отсутствие сопровождается повышением базальной экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов и рецепторов PAR в коре и гиппокампе, что свидетельствует о формировании устойчивого провоспалительного фенотипа. На фоне STZ-индуцированного диабета этот эффект в целом сохраняется, однако в гиппокампе нокаутных животных дополнительно увеличивается экспрессия Par4, что указывает на возможное вовлечение этого рецептора в ответ на диабетическую гипергликемию.

Совокупность полученных данных позволяет сформулировать единую гипотезу, объясняющую на первый взгляд противоречивые эффекты нокаута Arrb2. β-Аррестин 2 выступает двойственным регулятором с тканеспецифичными эффектами: в поджелудочной железе в условиях цитотоксического стресса он способствует гибели β-клеток через усиление NOX4-зависимого окислительного стресса и потенцирование p38 MAPK-сигнализации, тогда как в иммунных клетках и ЦНС выступает негативным регулятором воспалительных реакций. Отсутствие β-аррестина 2 одновременно повышает устойчивость β-клеток к STZ и снимает тормозной контроль над воспалительными каскадами, что проявляется как на системном уровне (в виде повышения доли нейтрофилов), так и локально в ЦНС (в виде усиления экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов и рецепторов PAR). Мы предполагаем, что системный провоспалительный фон, формирующийся вследствие нарушения β-аррестина 2-зависимой интернализации хемокиновых рецепторов [39, 49], создает условия для усиленной активации глиальных клеток и повышенной экспрессии Par1 и Par4 в коре и гиппокампе. Таким образом, дефицит β-аррестина 2 смещает тканеспецифичный баланс его про- и противовоспалительных функций в зависимости от преобладающего патологического стимула, что определяет как протективный метаболический фенотип, так и усиленный провоспалительный статус в ЦНС.

Ограничения исследования

При интерпретации результатов следует учитывать ряд ограничений. Во-первых, использована модель глобального нокаута гена Arrb2, что не позволяет разделить вклад β-аррестина 2 в отдельных типах клеток, включая β-клетки поджелудочной железы, иммунные клетки, нейроны и клетки глии. Во-вторых, предполагаемое участие NOX4-зависимого окислительного стресса, p38 MAPK-сигнализации и рекрутирования иммунных клеток не было оценено напрямую; также мы не проводили гистологический анализ поджелудочной железы с оценкой массы β-клеток, их апоптоза и инфильтрации островков Лангерганса. В-третьих, экспрессию провоспалительных цитокинов и рецепторов PAR оценивали на уровне мРНК без определения содержания соответствующих белков. Кроме того, диабетический фенотип характеризовали по уровню глюкозы крови и динамике массы тела без дополнительных метаболических тестов. Наконец, исследование выполнено только на самцах мышей, что не позволяет оценить возможные половые различия.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе на модели стрептозотоцин- индуцированного диабета показано, что глобальный нокаут гена β-аррестина 2 приводит к замедлению развития гипергликемии. В то же время отсутствие β-аррестина 2 ассоциировано с повышением базального уровня системного воспаления и формированием провоспалительного фенотипа в ЦНС, характеризующегося усилением экспрессии мРНК генов Il6, Il1b, Tnf и рецепторов Par1 и Par4 в коре и гиппокампе. В условиях диабета у нокаутных животных выявлено дополнительное увеличение экспрессии Par4 в гиппокампе, что указывает на возможную роль β-аррестина 2-PAR4- зависимых механизмов в развитии нейровоспаления при гипергликемии. Полученные данные открывают перспективы для дальнейшего изучения роли β-аррестина 2 в патогенезе диабетических осложнений.