В 2015 г. с помощью культурального метода и количественной ПЦР обнаружили микробиоту в полости матки после гистерэктомии [1]. Использование материала после гистерэктомии позволило исключить риск контаминации образцов из полости матки вагинальной и цервикальной микробиотой. Последующее исследование, также проведенное на гистерэктомическом материале, но со строгими отрицательными контролями, убедительно ответило на фундаментальный вопрос, обладает ли полость матки собственной микробиотой, обнаруживаемой молекулярно-генетическими методами [2]. Результатом стало изменение парадигмы о стерильности полости матки: сегодня считается, что в эндометрии существует собственное низкокопийное микробное сообщество. Это сделало изучение микробиоты эндометрия одним из приоритетных направлений в исследованиях микробиома человека [3, 4].

Однако клинические исследования не могут опираться на гистерэктомический материал. Практически все работы, посвященные микробиоте эндометрия и ее связи с репродуктивными исходами, основаны на трансцервикальном заборе проб — часто с использованием зондов типа Пайпель C1 (Пайпель-биопсия) или Пайпель C2 (Эндобраш) [5–13], которые проходят через колонизированный микроорганизмами цервикальный канал. В исследованиях на трансцервикально собранных образцах сообщалось о связи микробиоты эндометрия с невынашиванием беременности [14], хроническим эндометритом [15], полипами эндометрия [5, 16, 17], гиперплазией эндометрия [12], эндометриозом [18]. Однако вопрос о том, действительно ли эти ассоциации отражают изменения именно эндометриальной, а не цервикальной микробиоты, остается открытым. Данная неопределенность вызвана тем, что любой инструмент, проходящий через цервикальный канал, неизбежно несет риск контаминации эндометриального образца цервикальными микроорганизмами.

Это опасение особенно актуально ввиду того, что бактериальная нагрузка в полости матки может быть существенно ниже, чем в цервикальном канале [19]. В этом случае даже незначительная контаминация может замаскировать любой истинный эндометриальный сигнал или, наоборот, контаминация цервикальными микроорганизмами может быть интерпретирована как наличие данных микроорганизмов в полости матки. В большинстве опубликованных исследований авторы пытаются снизить этот риск с помощью предварительной обработки влагалища и цервикса физиологическим раствором или антисептиками, а также используют сравнение микробиоты эндометрия с микробиотой влагалища или цервикального канала в качестве контроля [5–10, 12, 13, 15–17, 20, 21]. Однако это не позволяет полностью исключить риск контаминации и достоверно оценить ее наличие.

В недавнем исследовании с помощью in vitro модели цервикального канала мы провели экспериментальную количественную оценку уровня контаминации образцов цервикальной микробиотой при использовании зондов Пайпель С1 и C2 [22]. Было продемонстрировано, что и зонды Пайпель C1, и зонды Пайпель C2 переносят значительное количество микробиоты из цервикальной слизи в модельные эндометриальные образцы — медианный перенос составил 81,6% для C1 и 29,8% для C2. Эти результаты поставили под сомнение происхождение микробиоты, обнаруживаемой в трансцервикально собранных образцах эндометрия. Однако in vitro модели не могут полностью воспроизвести сложность клинических условий, и истинная степень контаминации в реальных образцах пациенток остается неизвестной.

Это подводит нас к вопросу: можно ли обнаружить аутохтонную микробиоту эндометрия в трансцервикально собранных образцах? Иными словами, сохраняется ли истинный эндометриальный микробный сигнал — продемонстрированный на гистерэктомическом материале [1, 2] — при прохождении через неизбежную «контаминационную завесу» цервикальной микробиоты во время реального клинического забора? В настоящем исследовании мы определяем эндометриальный сигнал как «аутохтонный» (истинный) только в том случае, если концентрация бактериальной ДНК в эндометриальном образце превышает уровень, который может быть объяснен цервикальным переносом.

Цель исследования — определить, можно ли обнаружить аутохтонную микробиоту эндометрия в трансцервикально собранных образцах методом количественной ПЦР с учетом цервикальной контаминации.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

В исследовании приняли участие 185 женщин репродуктивного возраста (медиана — 32,9, Q₁–Q₃ [29,9–37] лет). Все пациентки проходили обследование в связи с нарушением репродуктивной функции в анамнезе либо с подозрением на патологию эндометрия в медицинском центре «Гармония» (г. Екатеринбург) в период с января 2020 по август 2023 г.

Критерии включения в исследование: репродуктивный возраст (18–45 лет); интервальный период (вне беременности); сохраненный менструальный цикл; наличие клинических или ультразвуковых признаков патологии эндометрия либо бесплодие; возможность одномоментного получения парных клинических образцов (цервикального содержимого и образца эндометрия); согласие пациенток на участие в исследовании.

Критерии невключения: гормональная и внутриматочная контрацепция на момент обследования и в течение предшествующих 6 месяцев; онкологические заболевания любой локализации; острые воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивного тракта и органов малого таза на момент обследования; антибактериальная терапия в течение четырех недель до обследования; отказ от участия в исследовании.

Критерии исключения: наличие инфекций, передаваемых половым путем, вызванных облигатными патогенами — Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasmoides genitalium (ранее Mycoplasma genitalium), Trichomonas vaginalis — по результатам теста Андрофлор («ДНКтехнология», Россия).

Для оценки микробиоты в цервикальном и эндометриальном образцах проводили ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на 27 групп микроорганизмов.

Сбор образцов

Исследование проводили на 8–12-й день менструального цикла. Для минимизации риска контаминации образцы брали в восходящем порядке (влагалище → цервикальный канал → полость матки).

Вагинальный образец

Вагинальный образец брали из задне-бокового свода влагалища до обработки антисептиком с помощью стерильного одноразового урогенитального зонда типа А-2. Биоматериал переносили в пробирку типа Эппендорф, содержащую стерильный физиологический раствор (0,9% NaCl). В настоящем исследовании вагинальные образцы не анализировали.

Обработка влагалища

После взятия вагинального образца проводили обработку влагалища кавитированным низкочастотным ультразвуком 0,05%-м раствором хлоргексидина биглюконата с помощью аппарата АУЗХ-100 («Фотек», Россия) в соответствии с руководством [23]: время воздействия — 1–2 мин, мощность — 6–8 единиц, объем используемого раствора — 150–200 мл. Данная процедура служила мерой профилактики инфекционно-воспалительных осложнений перед последующим взятием материала из полости матки [24].

Цервикальный образец

После обработки влагалища брали образец цервикальной слизи новым стерильным зондом типа А-2, вводя его в цервикальный канал на глубину 1–1,5 см. Биоматериал переносили в пробирку типа Эппендорф, содержащую стерильный физиологический раствор.

Эндометриальный образец

Для взятия образца из полости матки использовали устройство Endobrush Standard for Endometrial Cytology (Laboratoire C.C.D., Франция) — зонд типа C «Пайпель», модель 2 (Пайпель С2). Устройство снабжено защитным проводником, который предохраняет расположенную внутри щетку от контакта со слизистой цервикального канала: щетка раскрывается только после введения в полость матки, а перед извлечением задвигается внутрь проводника. Предварительно шейку матки выводили в зеркалах, повторно очищали тампоном, смоченным 0,05%-м раствором хлоргексидина, затем вводили устройство в полость матки трансцервикально, не касаясь стенок влагалища. После достижения полости матки защитный проводник отодвигали, обнажая щетку, и выполняли 3–5 вращательных движений для сбора биоматериала. Затем щетку втягивали обратно в защитный проводник и извлекали устройство. Наружную поверхность проводника тщательно протирали стерильным тампоном, смоченным 96%-м этиловым спиртом, для удаления остатков цервикальной слизи и предотвращения контаминации пробы. После этого щетку выдвигали и переносили биоматериал в пробирку, содержащую стерильный физиологический раствор.

Выделение ДНК

Для выделения ДНК использовали набор «Проба-НКПЛЮС» («ДНК-технология», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Образцы эндометрия подвергали предварительной депротеинизации: пробирки с образцом эндометрия центрифугировали 10 мин при 13 000 об./мин на центрифуге MiniSpin (Eppendorf, Германия), удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 100 мкл лизирующего раствора из набора «Проба-НК-ПЛЮС» и тщательно перемешивали на вортексе до гомогенного состояния. Затем 50 мкл полученного гомогенизата переносили в чистую пробирку, содержащую смесь из 25 мкл лизирующего раствора, 5 мкл протеиназы К (20 мг/мл; VWR Life Science, США) и 120 мкл стерильного физиологического раствора. После перемешивания образцы инкубировали при 60 °С в течение 30 мин, затем при 95 °С в течение 10 мин. По окончании инкубации пробирки центрифугировали 60 с при 13 000 об./мин. Надосадочную жидкость в объеме 100 мкл использовали для выделения ДНК согласно инструкции набора «Проба-НК-ПЛЮС». Необходимость предварительной депротеинизации эндометриальных образцов была обусловлена их высокой вязкостью, связанной с присутствием большого количества белка и слизи, что могло снижать эффективность экстракции ДНК. Цервикальные образцы не требовали данной стадии ввиду иной консистенции материала. Отрицательные контроли (стерильный физиологический раствор) включали в каждую постановку выделения ДНК и ПЦР для исключения реагентной контаминации.

Исследование микробиоты

В каждом образце методом ПЦР-РВ оценивали количества 27 групп микроорганизмов: Lactobacillus spp., Lactobacillus crispatus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus iners, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus vaginalis, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Gardnerella vaginalis, Megasphaera spp. / Veillonella spp. / Dialister spp. (группа MVD), Sneathia spp. / Leptotrichia spp. / Fusobacterium spp. (группа SLF), Atopobium cluster, Bacteroides spp. / Porphyromonas spp. / Prevotella spp. (группа BPP), Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp. / Parvimonas spp. (группа PP), Eubacterium spp., Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa / Ralstonia spp. / Burkholderia spp. (группа PRB), Enterobacteriaceae / Enterococcus spp., Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Metamycoplasma hominis, Candida spp.

ПЦР-РВ проводили с помощью набора «Андрофлор» и набора для видовой оценки вагинальных лактобацилл (оба производства «ДНК-технология», Россия) на амплификаторах «ДТ-Прайм» и «ДТ-96» с использованием штатного программного обеспечения и программ амплификации к наборам («ДНК-технология», Россия). В соответствии с инструкциями к используемым наборам, пробы по группам Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Metamycoplasma hominis считали положительными при любом отличном от нуля количестве, для остальных групп микроорганизмов минимальным порогом обнаружения было количество в 10³ геном-эквивалентов на образец (ГЭ/образец).

Статистический анализ

Статистическую обработку и визуализацию данных проводили в среде R версия 4.6.0 (R Foundation for Statistical Computing; Вена, Австрия). В качестве меры центральной тенденции при описании переменных указывали медиану со значениями 1-го и 3-го квартилей (Q₁ и Q₃). Статистическую значимость различий между частотными показателями оценивали двусторонним точным тестом Фишера, между количественными показателями — тестом Манна–Уитни. Все различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клиническая характеристика пациенток

На момент исследования пациентки предъявляли жалобы на изменение характера менструаций, имели ультразвуковые признаки патологии эндометрия либо проходили обследование по поводу бесплодия. Данные состояния служили показанием для обследования, в том числе взятия материала из полости матки для исследования микробиоты. Большинство пациенток в анамнезе имели акушерско-гинекологическую патологию; у 17 (9,2%) женщин анамнез был не отягощен (табл. 1).

Сравнение микробиоты в цервикальных и эндометриальных образцах

Микробные сигналы из образцов эндометрия обнаруживали у 144 (77,8%) пациенток. Для большинства групп микроорганизмов частота обнаружения в цервикальных образцах в 1,3–3 раза превышала таковую для образцов эндометрия (рис. 1). В том числе статистически значимо чаще в цервикальных образцах выявляли группы: Lactobacillus spp. (88,6 против 68,1%), L. crispatus (39,5 против 15,7%), L. iners (41,6 против 28,1%), L. jensenii (31,9 против 10,8%), L. gasseri (16,8 против 8,1%), L. johnsonii (3,2 против 0%), L. vaginalis (23,8 против 2,7%), Anaerococcus spp. (10,8 против 2,2%), Eubacterium spp. (31,9 против 20%), Enterobacteriaceae/Enterococcus spp. (13 против 5,9%), U. parvum (6,5 против 0%).

Статистически значимые различия в количествах микроорганизмов между цервикальными и эндометриальными образцами обнаружили для 13 групп микроорганизмов: Lactobacillus spp., L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis, G. vaginalis, Anaerococcus spp., группа PP, Eubacterium spp., Enterobacteriaceae/ Enterococcus spp., U. parvum (рис. 1). Наибольшие количества в обоих биотопах были характерны для Lactobacillus spp.: 10^4,9 (10^3,8–10^6,1) ГЭ/образец в цервикальных пробах против 10^3,5 (0–10^4,2) ГЭ/образец в пробах эндометрия (p < 0,001). Медианные количества остальных групп микроорганизмов в обоих биотопах равнялись нулю; статистически значимые различия при этом были обусловлены более высокими концентрациями в верхних квартилях распределения цервикальных образцов.

Эндометриальные сигналы после поправки на возможную контаминацию

Для каждого положительного сигнала в образце эндометрия рассчитывали отношение количества микроорганизма в эндометрии к его количеству в цервикальном образце той же пациентки. Сигнал считали истинно эндометриальным, если это отношение превышало допущенный уровень цервикального переноса. В качестве допустимого цервикального переноса принимали 30% (ожидаемый порог — по результатам предыдущего in vitro эксперимента [22]) и 100% (консервативный порог — количество микроорганизма в эндометрии превышает таковое в цервиксе). При отсутствии целевого микроорганизма в цервикальном образце любой положительный сигнал в эндометрии считали превышающим порог переноса, поскольку он не может быть объяснен цервикальной контаминацией.

После применения указанных порогов микроорганизмы обнаруживали в 82 (44,3%) пробах (порог — 30%) и в 69 (37,3%) пробах (порог — 100%) (рис. 2). В большинстве положительных проб обнаруживали не более трех групп микроорганизмов. При пороге в 30% выявляли одну группу — в 31 (16,8%), две группы — в 13 (7%), три группы — в 15 (8,1%) случаях; при пороге в 100% выявляли одну группу — в 28 (15,1%), две группы — в 12 (6,5%), три группы — в 12 (6,5%) случаях. В единичных образцах присутствовали до 11 групп микроорганизмов при пороге 30% и до 10 групп при пороге 100%.

Далее оценивали частоту обнаружения каждой группы микроорганизмов в образцах эндометрия после применения поправки на возможную контаминацию цервикальной микробиотой. В зависимости от результата каждую пробу относили к одной из трех категорий: отрицательный результат (сигнал отсутствует), «серая зона» (сигнал обнаружен, но не превышает установленного порога переноса), истинный эндометриальный сигнал (превышает порог и не может быть объяснен только контаминацией) (рис. 3):

формула

где x > 1 — истинный сигнал, x ≤ 1 — «серая зона». В качестве порога переноса принимали 0,3 (30% переноса) и 1 (100% переноса).

При пороге переноса 30% в «серую зону» попадали 88 (47,6% от всех анализируемых пациенток) проб на Lactobacillus spp., 18 (9,7%) — на L. crispatus, 38 (20,5%) — на L. iners, 12 (6,5%) — на L. jensenii и 1 (0,5%) — на L. vaginalis. Для условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) наибольшее количество проб в «серой зоне» отмечали для G. vaginalis и Eubacterium spp. — 16 (8,6%) и 7 (3,8%) соответственно. Для остальных УПМ в «серую зону» попадали 0–1,6% проб.

При пороге переноса 100% в «серую зону» попадали 102 (55,1% от всех анализируемых пациенток) проб на Lactobacillus spp., 19 (10,3%) — на L. crispatus, 42 (22,7%) — на L. iners, 17 (9,2%) — на L. jensenii и 1 (0,5%) — на L. vaginalis. Для УПМ наибольшее количество проб в «серой зоне» отмечали для G. vaginalis и Eubacterium spp. — 18 (9,7%) и 13 (7%) соответственно. Для остальных УПМ в «серую зону» попадали 0–3,2% проб.

После применения поправки частота наиболее представленной группы Lactobacillus spp. снизилась с 126 (68,1%, до поправки) до 38 (20,5%, 30% порог) и 24 (13%, 100% порог). Отдельные виды лактобацилл и группы УПМ после применения поправок обнаруживали в 0,5–16,2% случаев при 30% пороге и в 0,5–13% при 100% пороге; сигналы по L. acidophilus, L. johnsonii, U. urealyticum, U. parvum отсутствовали в образцах эндометрия после коррекции вне зависимости от использованного порога (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В образцах эндометрия исследованных пациенток выявили 22 из 27 целевых групп микроорганизмов (рис. 1). Lactobacillus spp. обнаружили в 68,1% проб с медианным количеством 10^3,5 ГЭ/образец, тогда как остальные группы идентифицировали менее чем у трети пациенток, что согласуется с известными данными о низком альфа-разнообразии и копийности микробиоты эндометрия [1, 2, 21]. Значения частоты обнаружения всех 22 групп были выше в цервикальных образцах, чем в образцах эндометрия. Так, Lactobacillus spp. выявляли в 88,6% цервикальных образцов с медианным количеством 10^4,9 ГЭ/образец (p < 0,0001 как для частоты, так и для количества). Данное наблюдение в сочетании с ранее полученным in vitro результатом о 30%-м переносе бактериальной ДНК из цервикальной слизи в пробу эндометрия при использовании зонда Пайпель C2 [22] указывает на то, что часть положительных сигналов в образцах эндометрия может быть обусловлена цервикальной контаминацией.

Для дифференцирования истинно эндометриальных сигналов от цервикальной контаминации мы сравнили количество ДНК каждого микроорганизма в эндометриальном образце с его количеством в цервикальном образце той же пациентки. Использовали два порога допустимого переноса: 30% (ожидаемый, основанный на in vitro эксперименте [22]) и 100% (консервативный, при котором количество микроорганизма в эндометрии превышает его количество в цервиксе и не может быть объяснено контаминацией). При обоих порогах более половины образцов эндометрия не содержали положительных сигналов в надпороговых значениях (рис. 2), что не позволяет рассматривать эти пробы как истинно положительные — присутствие микроорганизмов в них могло быть полностью объяснено цервикальным переносом. Среди положительных проб (44,3% при пороге 30%, 37,3% при пороге 100%) большинство содержали не более 3 групп микроорганизмов. Таким образом, после применения поправки на контаминацию из 144 (77,8%) изначально положительных проб эндометрия почти половина были переклассифицированы как неинтерпретируемые, а в сохранившихся положительных пробах присутствовали единичные таксоны.

Следующим шагом мы оценили результаты по каждой целевой группе микроорганизмов с учетом введенных поправок на возможную контаминацию. В зависимости от результата каждую пробу относили к одной из трех категорий: отрицательный результат (сигнал отсутствует), «серая зона» (сигнал обнаружен, но не превышает установленного порога переноса), истинный эндометриальный сигнал (превышает порог и не может быть объяснен только контаминацией). Для Lactobacillus spp. и отдельных видов лактобацилл большинство проб — от 2/3 до 3/4 изначально положительных — попадали в «серую зону» (рис. 3). Так, до поправки Lactobacillus spp. выявили у 126 (68,1%) пациенток; после применения порога 30% — у 38 (20,5%), порога 100% — у 24 (13%). Аналогичные паттерны наблюдали для трех основных видов лактобацилл — L. crispatus, L. iners и L. jensenii. Для УПМ доля проб, попадавших в «серую зону», была ниже, чем для лактобацилл: 8,6 и 9,7% для G. vaginalis, 3,8 и 7% для Eubacterium spp. при порогах 30 и 100% соответственно; для остальных УПМ — 0–1,6% и 0–3,2%. Таким образом, среди положительных проб на УПМ большинство оставались истинно положительными и после применения поправок, хотя частота их обнаружения не превышала 16,2% при пороге 30% и 13% при пороге 100%.

Полученные результаты согласуются с осторожной позицией авторов исследования [2], предположивших, что преобладание лактобацилл в микробиоте трансцервикально собранных проб эндометрия [5, 18, 25–27] может быть обусловлено цервикальной или вагинальной контаминацией. В пользу этого предположения свидетельствуют и более ранние культуральные исследования, продемонстрировавшие более высокую частоту выделения бактерий из образцов эндометрия, полученных трансцервикально, по сравнению с трансабдоминальным доступом [28]. В нашем исследовании мы напрямую оценили вклад цервикальной контаминации при трансцервикальном заборе: использование парных цервикальных образцов и пороговой модели переноса ДНК продемонстрировало, что цервикальная контаминация способна объяснить большинство положительных сигналов в эндометрии. Тот факт, что Lactobacillus spp. в данной работе демонстрировал наибольшую долю проб в «серой зоне», подтверждает высказанное Winters и соавторами предположение о том, что Lactobacillus-доминирование эндометрия может быть артефактом забора материала [2]. Более того, после введенных поправок на возможную контаминацию G. vaginalis и Eubacterium spp. оказались самыми часто встречающимися микроорганизмами в образцах эндометрия наряду с Lactobacillus spp. и опережали все отдельные виды лактобацилл (табл. 2).

Обнаружение целевого микроорганизма в эндометрии в количествах выше установленного порога цервикального переноса не является абсолютным доказательством его эндометриального происхождения, однако с высокой вероятностью отражает истинное присутствие микроорганизма в полости матки, поскольку такой сигнал не может быть объяснен цервикальной контаминацией в рамках использованной модели. В настоящем исследовании у 37,3% пациенток микробные сигналы в образцах эндометрия сохранялись даже при консервативном пороге 100%, что не может быть полностью объяснено цервикальной контаминацией и указывает на присутствие аутохтонной микробиоты эндометрия. Однако в большинстве случаев она была представлена 1–3 группами нелактобациллярных микроорганизмов, а частота обнаружения самой распространенной группы не превышала 13%.

Преимущественное попадание лактобацилл в «серую зону» не обязательно означает их отсутствие в эндометрии. Не исключено, что в части проб лактобациллы присутствовали, но в количествах, недостаточных для уверенного отличия от цервикального переноса. Анатомическая близость шейки и полости матки может обусловливать объективное сходство микробных сообществ этих биотопов. Показательно, что при использовании материала после гистерэктомии и секвенирования гена 16S рРНК не было выявлено значимых различий между микробиотой цервикса и эндометрия [2].

Примечательно, что большинство УПМ, обнаруженных в эндометрии, сохранялись в качестве истинно положительных сигналов даже после применения консервативного порога контаминации 100% (рис. 3). Причины данного явления остаются неясными, однако этот факт имеет практическое значение. В отличие от лактобацилл, которые в большинстве случаев попадали в «серую зону», детекция УПМ в образце эндометрия с высокой вероятностью отражает их действительное присутствие в полости матки, а не артефакт забора материала. Это особенно важно в клиническом контексте, поскольку именно УПМ традиционно ассоциируются с патологией эндометрия и являются основной целью микробиологического исследования образцов из полости матки.

Сильной стороной настоящего исследования является дизайн с парными образцами (цервикс–эндометрий), полученными от одной пациентки в ходе одной процедуры. Такой подход позволил использовать индивидуальный уровень цервикальной микробной нагрузки в качестве референсного для оценки контаминации, а не полагаться на усредненные групповые значения, что полностью исключает влияние клинической разнородности пациенток на оценку контаминации. Использование двух порогов переноса — 30% (ожидаемый, основанный на in vitro модели [22]) и 100% (консервативный, полностью исключающий возможность контаминации) — позволило оценить устойчивость полученных результатов к выбору порога. Применение количественной ПЦР с детекцией 27 групп микроорганизмов обеспечило высокую аналитическую чувствительность и позволило оценить как частоту, так и абсолютное количество каждой целевой группы микроорганизмов, что выгодно отличает данную работу от исследований, основанных исключительно на секвенировании гена 16S рРНК.

Практическим следствием полученных результатов является необходимость пересмотра подходов к исследованию микробиоты эндометрия. Использование зондов с защитным проводником (Пайпель C2), даже в сочетании с антисептической обработкой, не позволяет надежно дифференцировать эндометриальные и цервикальные микроорганизмы. В краткосрочной перспективе целесообразным представляется изучение совокупной цервико-эндометриальной микробиоты в общем образце, полученном при трансцервикальном заборе, — такой подход, по крайней мере, не создает иллюзии селективного исследования эндометрия. В долгосрочной перспективе необходима разработка методов, позволяющих минимизировать цервикальную контаминацию.

Ограничения исследования

Настоящее исследование имеет ряд ограничений. Во-первых, модель контаминации предполагала, что единственный цервикальный образец адекватно отражает микробную нагрузку по всей длине цервикального канала; однако возможна региональная вариабельность концентрации микроорганизмов, что могло приводить к недооценке или переоценке уровня переноса. Во-вторых, протокол выделения ДНК различался для цервикальных и эндометриальных образцов: эндометриальные пробы подвергались предварительной депротеинизации, что могло повлиять на эффективность экстракции ДНК и соотношение количеств микроорганизмов между биотопами. В-третьих, использованные ПЦР-панели были ограничены 27 целевыми группами микроорганизмов; в отличие от секвенирования гена 16S рРНК, такой подход не позволяет оценить полный таксономический состав микробиоты и выявить микроорганизмы, не включенные в панели. В-четвертых, количественная ПЦР не позволяет отличить живые микроорганизмы от внеклеточной ДНК, поэтому часть детектируемых сигналов могла быть обусловлена нежизнеспособными бактериями или свободной ДНК, попавшей в полость матки из нижних отделов репродуктивного тракта, что должно учитываться при клинической интерпретации результатов. В-пятых, вагинальные образцы были собраны, но не проанализированы в рамках настоящей работы. Хотя риск контаминации эндометрия влагалищной микробиотой считается низким при визуальном контроле введения зонда, отсутствие этих данных ограничивает возможность оценки полного континуума микробных сообществ нижних отделов репродуктивного тракта. Наконец, исследование выполнено в одном центре, и его результаты требуют независимого воспроизведения.

ВЫВОДЫ

Проведенное       исследование     демонстрирует,   что трансцервикальное взятие эндометрия с помощью зондов Пайпель C2 (Эндобраш) не позволяет надежно отличить эндометриальную микробиоту от цервикальной у большинства пациенток. Истинные эндометриальные сигналы методом количественной ПЦР обнаруживали примерно у 40% женщин и, как правило, всего по 1–3 таксонам. Большая часть положительных эндометриальных проб на лактобациллы (например, около 2/3 от изначально положительных на Lactobacillus spp.) попадала в «серую зону» и могла быть обусловлена как присутствием микроорганизмов в эндометрии, так и контаминацией образца цервикальной микробиотой. Напротив, обнаружение УПМ в эндометрии можно интерпретировать как маркер их реального присутствия, поскольку их количества в большинстве случаев превышали установленные пороги цервикального переноса. Полученные результаты указывают на необходимость разработки новых методов взятия образцов эндометрия, позволяющих эффективно исключать контаминацию цервикальной микробиотой, либо интерпретировать результаты исследования такого биоматериала как совокупную цервико-эндометриальную микробиоту.