Замершая беременность является одной из наиболее значимых проблем современной репродуктивной медицины и занимает важное место в структуре ранних репродуктивных потерь. Несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения, частота данной патологии остается высокой. Нарушение развития эмбриона на ранних сроках гестации обусловлено комплексом генетических, иммунологических, эндокринных, инфекционных и сосудистых факторов, вклад каждого из которых может различаться в зависимости от конкретной клинической ситуации.

Нормальное течение беременности обеспечивается согласованным взаимодействием между организмом матери и развивающимся эмбрионом. Успешная имплантация и дальнейшее формирование плацентарного комплекса требуют адекватной инвазии трофобласта, ремоделирования внеклеточного матрикса, формирования сосудистой сети и поддержания иммунологической толерантности. Нарушение любого из указанных процессов может привести к прекращению развития беременности.

В ранее выполненных исследованиях выявлены молекулярные особенности тканей, полученных при замершей беременности. Установлено, что ранние репродуктивные потери сопровождаются изменениями содержания рибосомной ДНК [1, 2], нарушением экспрессии ряда плацентоспецифических белков семейства PSG [3, 4], а также снижением экспрессии белка ретикулона-4 (RTN4), участвующего в регуляции процессов апоптоза и клеточной дифференцировки. Полученные результаты свидетельствуют о наличии комплексных молекулярных нарушений, затрагивающих различные этапы эмбрионального развития и формирования плаценты [1–6]. Вместе с тем механизмы иммунной регуляции и ремоделирования тканей при замершей беременности остаются недостаточно изученными. В связи с этим особый интерес представляют гены трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и матриксной металлопротеиназы 9 (MMP-9), играющие важную роль в обеспечении иммунологической толерантности, инвазии трофобласта и формировании плацентарного ложа.

MMP-9 является ферментом, участвующим в деградации компонентов внеклеточного матрикса. Ее активность имеет важное значение для миграции и инвазии трофобластических клеток, ремоделирования тканей эндометрия и формирования плацентарного комплекса. Нарушение регуляции MMP-9 может сопровождаться дефектами плацентации и осложненным течением беременности [7–13].

Матриксная металопротеиназа 9 играет также важную роль в миграции лейкоцитов, остеокластической резорбции костной ткани, принадлежит к семейству пептидаз М10А, функционирует как фактор роста, регулирующий клеточную дифференцировку, миграцию и клеточную смерть, активирует клеточные сигнальные каскады через CD63 и ITGB1. По данным STRING (рис. 1), она также участвует в белково-белковых взаимодействиях.

TGF-β относится к числу ключевых регуляторов клеточной пролиферации, дифференцировки и иммунного ответа. Во время беременности данный цитокин участвует в формировании иммунологической толерантности между организмом матери и плодом, ограничивая развитие избыточных иммунных реакций и способствуя сохранению беременности [14–25].

Несмотря на значительное количество исследований, посвященных роли TGF-β и MMP-9 в репродуктивных процессах, сведения об особенностях их экспрессии при замершей беременности остаются ограниченными и во многом противоречивыми. Это определяет необходимость дальнейшего изучения данных молекулярных маркеров.

По данным STRING (рис. 2), TGF-β участвует в белковобелковых взаимодействиях следующим образом.

Между собой и совместно исследуемые гены (протеомы) практически не взаимодействуют (рис. 3).

Цель исследования — оценить уровень экспресcии генов (TGF-β и MMP-9) в периферической крови женщин с физиологической и замершей беременностью, а также определить их потенциальную прогностическую значимость при оценке риска ранних репродуктивных потерь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования. Проведено сравнительное одноцентровое исследование, направленное на изучение экспрессии генов TGF-β и MMP-9 в периферической крови женщин с физиологически протекающей и замершей беременностью.

Характеристика обследованных пациенток

В исследование были включены 40 беременных женщин. Контрольную группу составили 20 пациенток с одноплодной физиологически развивающейся беременностью сроком 9–11 недель, проходивших первый пренатальный скрининг. Основную группу составили 20 женщин с диагнозом замершей беременности. Замершую беременность обнаруживали в момент планового посещения и ультразвукового исследования, а срок ее устанавливали на основании анамнестических данных и УЗИ эмбриона. У 13 пациенток прекращение развития беременности произошло в сроки от 6 до 9 недель гестации, у 4 — в сроки от 9 до 12 недель. При этом было обнаружено несоответствие антропометрических данных по результатам ультразвукового исследования мертвых эмбрионов с гестационным возрастом 3–5 недель. У 3 пациенток было проведено прерывание беременности после консультации с генетиком и консилиума по медицинским показаниям (тератогенные эффекты) на сроке 13–21 неделя. Установление кариотипов плодов при аномалиях развития не проводилось. Критерии включения: возраст старше 18 лет; подтвержденная маточная беременность; подписанное добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: многоплодная беременность.

Получение биологического материала

У всех пациенток перед проведением оперативного лечения и ультразвукового исследования осуществляли забор периферической венозной крови из локтевой вены. Основной диагноз получали после обследования ткани эмбриона в цитогенетической лаборатории.

Выделение РНК и синтез кДНК

Для выделения тотальной РНК использовали цельную венозную кровь. После лизиса клеточных элементов образцы центрифугировали, а дальнейшее выделение РНК выполняли с использованием коммерческого набора ExtractRNA («Евроген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Качество полученной РНК контролировали методом электрофореза. Концентрацию нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрически на приборе Nano500 (AllSheng, Китай). Для синтеза комплементарной ДНК применяли набор BioMaster RNAscribe RT Plus («Биолабмикс», Россия). В реакцию обратной транскрипции вносили 1 мкг тотальной РНК. После завершения реакции полученную кДНК разводили безнуклеазной водой и использовали для дальнейшего анализа экспрессии генов.

Определение экспрессии генов

Уровень экспрессии генов TGF-β и MMP-9 определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Амплификацию проводили на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Все образцы анализировали в двух технических повторностях. Для повышения специфичности анализа посадку праймера проводили на экзон–экзон, что исключало амплификацию с геномной ДНК. В качестве референсных генов использовали B2M и GUSB. Относительный уровень экспрессии рассчитывали методом ΔΔCt с последующей нормализацией по среднему значению референсных генов.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения StatPlus 2007. Для количественных показателей рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку среднего, медиану, минимальные и максимальные значения. Сравнение независимых групп проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Данный метод был выбран в связи с ограниченным объемом выборки и отсутствием необходимости предполагать нормальное распределение изучаемых признаков. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости p < 0,05. Для оценки диагностической информативности исследуемых показателей использовали ROC-анализ с определением оптимальных пороговых значений, чувствительности и специфичности. Коррекцию на множественные сравнения не проводили. Исследование носило предварительный характер, поскольку размер выборки состоял из 20 человек в каждой группе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведен сравнительный анализ уровней экспрессии генов TGF-β и MMP-9 в периферической крови женщин с физиологически протекающей и замершей беременностью. При анализе пороговых циклов амплификации статистически значимых различий между группами выявлено не было (таблица). Среднее значение Ct для TGF-β в группе замершей беременности составило 27,15 ± 0,30, тогда как в контрольной группе данный показатель был равен 28,21 ± 0,33. Для гена MMP-9 средние значения Ct составили 27,81 ± 0,42 и 29,31 ± 0,37 соответственно.

Следовательно, TGFb и MMP-9 не имеют 100%-й диагностической ценности при прогнозировании замершей беременности, однако на самом деле данных больше, например, нами были точно рассчитаны границы интервалов, по которым удалось обнаружить очень тонкую разницу. Так, анализ параметров по риску «замершая беременность» (рис. 4) показал наиболее значимые различия по параметрам Ct_TGFb и Ct_MMP9.

Диагностически важное значение для Ct_MMP9 имеет число ≤ 29, при котором чувствительность достигает 80% при специфичности 60% (рис. 4). Для Ct_TGFb таким числом экспрессии является 27,4, при котором чувствительность достигает 75% при специфичности 70%. Прогнозирование замершей беременности по экспрессии Ct_TGFb и Ct_MMP9 может довести до результата 80% / 70%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании проведена оценка экспрессии генов TGF-β и MMP-9 в периферической крови женщин с физиологически протекающей и замершей беременностью. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий между исследуемыми группами, результаты ROC-анализа продемонстрировали наличие пороговых значений исследуемых показателей, обладающих определенной прогностической информативностью. Полученные данные свидетельствуют о том, что изменение экспрессии TGF-β и MMP-9 не может быть рассмотрено как единственный механизм развития замершей беременности. Вероятно, выявляемые молекулярные изменения отражают лишь отдельные звенья сложного патогенетического процесса, включающего нарушения плацентации, иммунологической адаптации и межклеточных взаимодействий на материнскоплодовом интерфейсе [14–25].

Известно, что успешная имплантация эмбриона и дальнейшее развитие беременности требуют адекватной инвазии трофобласта в эндометрий и формирования полноценного маточно-плацентарного кровотока. Важная роль в этих процессах принадлежит матриксным металлопротеиназам, обеспечивающим контролируемое ремоделирование внеклеточного матрикса [7–13]. Среди представителей данного семейства особое значение имеет MMP-9, участвующая в деградации компонентов базальной мембраны, миграции трофобластических клеток и формировании плацентарного ложа [7–13].

По данным ряда исследований, активность MMP-9 тесно связана с процессами инвазии трофобласта и нормальным развитием плаценты [7–13]. Нарушение регуляции металлопротеиназ может приводить к неполноценной плацентации в разные сроки гестации плода и формированию осложнений беременности [7–13]. Полученные в настоящем исследовании данные о потенциальной прогностической значимости MMP-9 согласуются с современными представлениями о роли данного фермента в ранних этапах гестации.

Не менее важным компонентом успешного течения беременности является формирование иммунологической толерантности между организмом матери и плодом [15–25]. Центральное место в регуляции данного процесса занимает TGF-β, обладающий выраженными иммуномодулирующими свойствами [15–25]. Этот цитокин участвует в контроле активности Т-лимфоцитов, натуральных киллеров и других иммунокомпетентных клеток, обеспечивая поддержание иммунного баланса, необходимого для сохранения беременности [14–25].

Согласно данным литературы, снижение активности сигнальных путей TGF-β может сопровождаться нарушением материнско-плодовой иммунной толерантности и повышением риска невынашивания беременности [15–25]. Полученные нами результаты не выявили достоверных различий между группами из-за недостаточного количества измерений исследуемых показателей в разные сроки эмбриогенеза и плацентации, однако наличие диагностически значимого порогового значения позволяет предположить участие TGF-β в механизмах, связанных с риском прекращения развития беременности.

Следует учитывать, что патогенез замершей беременности имеет многофакторный характер [7–25]. Генетические нарушения эмбриона, эндокринные расстройства, инфекционные процессы, нарушения гемостаза и иммунологические изменения способны реализовываться одновременно, формируя различные клинические варианты заболевания. В связи с этим использование отдельных молекулярных маркеров не всегда обеспечивает высокую диагностическую точность. К ограничениям настоящего исследования следует отнести относительно небольшой объем выборки, а также неоднородность сроков беременности в группе пациенток с замершей беременностью. Кроме того, забор биологического материала проводили после установления диагноза, что не позволяет оценить динамику изменения экспрессии исследуемых генов на различных этапах патологического процесса.

Таким образом, полученные результаты подтверждают перспективность дальнейшего изучения TGF-β и MMP-9 как компонентов комплексных прогностических моделей оценки риска ранних репродуктивных потерь [7–25]. Для уточнения клинической значимости выявленных закономерностей необходимы исследования с включением большего числа наблюдений и расширенного спектра молекулярно-генетических показателей.

Проведенное исследование позволило оценить особенности экспрессии генов TGF-β и MMP-9 в периферической крови женщин с физиологически протекающей и замершей беременностью. Статистически значимых различий между группами по уровням экспрессии исследуемых генов выявлено не было. Вместе с тем результаты ROC-анализа показали наличие пороговых значений показателей TGF-β и MMP-9, обладающих определенной прогностической информативностью при оценке риска замершей беременности.

Полученные данные свидетельствуют о возможном участии исследуемых генов в молекулярных механизмах, обеспечивающих нормальное течение беременности. Однако ограниченный объем выборки не позволяет рассматривать выявленные закономерности как окончательно доказанные. Дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение экспрессии TGF-β и MMP-9 в более крупных и клинически однородных группах пациенток, а также на разработку комплексных прогностических моделей, объединяющих молекулярногенетические, лабораторные и клинические показатели.

ВЫВОДЫ

Уровни экспрессии генов TGF-β и MMP-9 в периферической крови женщин с физиологически протекающей и замершей беременностью статистически значимо не различались. Для гена MMP-9 диагностически значимым оказалось пороговое значение Ct ≤ 29, обеспечивающее чувствительность 80% и специфичность 60%. Для гена TGF-β наиболее информативным было значение Ct ≤ 27,4 с чувствительностью 75% и специфичностью 70%. Полученные результаты свидетельствуют о потенциальной прогностической значимости данных молекулярных маркеров, необходимости дальнейших исследований для подтверждения их клинической ценности и валидации на независимой выборке.