Заболевания опорно-двигательного аппарата с дегенеративно-дистрофическим изменением мениска коленного сустава охватывают широкий слой населения, прежде всего трудоспособного и нередко становятся причиной инвалидности, что обусловливает медикосоциальную и экономическую нагрузку для каждого пациента и общества в целом [1]. Патогенез дегенерации мениска включает в себя биохимические, структурные и микроциркуляторные изменения, затрагивающие все структуры сустава, и понимание его важно для разработки новых методик лечения [2]. Дегенеративное поражение хряща развивается в результате комплексного воздействия биологических и механических факторов, приводящих к нарушению суставного гомеостаза, последующему развитию персистирующего воспаления с повышением концентрации провоспалительных цитокинов, инициации процессов апоптоза, снижению экспрессии генов компонентов внеклеточного матрикса, и, в итоге, к уменьшению объема хрящевой ткани и изменению биомеханики сустава [3].

В развитии и прогрессировании дегенеративных изменений тканей мениска значительную роль играют провоспалительные цитокины (IL1β, IL6, IL8, IL17A и фактор некроза опухолей). IL1β приводит к угнетению синтеза нового коллагена и протеогликанов в хондроцитах, в том числе за счет активации ферментов металлопротеиназ. Фактор некроза опухолей локально в суставе индуцирует воспаление синовиальной оболочки и апоптоз хондроцитов. IL8 приводит к рекрутированию иммунных клеток (нейтрофилов и макрофагов) в полость сустава, за счет чего повреждение усиливается [4]. IL6 известен не только как фактор развития и прогрессирования воспаления, большое значение имеют его физиологические эффекты. Он продуцируется Т-, В-лимфоцитами, гранулоцитами, клетками гладких мышечных волокон, эозинофилами, тучными, глиальными клетками, кератоцитами и участвует в функционировании эндокринной, кроветворной, нервной систем [5]. В ранее проведенных исследованиях in vitro установлена способность IL6 индуцировать ингибиторы матриксных металлопротеиназ [6]. Повышение концентрации цитокина в синовиальной жидкости приводит к усилению боли, потери объема хрящевой ткани, особенно на терминальной стадии остеоартрита [1, 7]. Показано, что при сочетании ожирения и остеоартрита концентрация IL6 в крови пациентов повышена и коррелирует с прогрессированием данных заболеваний [8].

В патогенезе развития дегенеративных изменений ткани мениска коленного сустава важную роль играет IL17A. Продуцируют цитокин макрофаги, а также γδ˗Тклетки, расположенные в слизистых оболочках, и принимающие участие в противомикробном иммунитете. Есть предположение об участии данных клеток в регенерации костной ткани. При дегенеративных изменениях ткани мениска коленного сустава γδ˗Тклетки способны приводить к повышенной продукции интерлейкина наравне с NK-клетками, количество которых при остеоартрите повышено в синовиальной оболочке [9]. NK-клетки накапливаются в воспаленных тканях, где их стимулируют другие провоспалительные цитокины (IL12, IL15 и IL18), секретируемые моноцитами. Под действием IL17A происходит подавление анаболических факторов (например, снижается экспрессия гена COL2A1) в хондроцитах с последующими дегенеративными изменениями. Так, было установлено, что концентрация провоспалительных цитокинов значительно снижается у пациентов после тотального эндопротезирования суставов [10–13].

Основным структурным компонентом внеклеточного матрикса является коллаген, обеспечивающий прочность, эластичность, регуляцию и регенерацию соединительной ткани. Коллаген II типа входит в состав хрящевой ткани, являясь основным компонентом альфа-цепи, и кодируется геном COL2A1 [14, 15]. Тканеспецифический характер экспрессии COL2A1 является основополагающим фактором в определении клинической картины ассоциированных заболеваний, разделенных на две группы в зависимости от вида пораженной ткани. В первую группу входят нарушения формирования опорно-двигательного аппарата (например, карликовость, кифосколиоз, укорочение конечностей, патологии суставов, нарушения формирования твердого неба) и его функциональная состоятельность во взрослом возрасте (например, остеоартрит суставов различной локализации). Во вторую группу включены внескелетные аномалии (потеря слуха, патология глазного аппарата, например миопия, отслойка сетчатки и др.) [16, 17].

Составляющими процесса дегенерации ткани мениска являются также апоптоз, окислительный стресс, возраст, питание и наследственность [18]. Запуск апоптоза происходит за счет активации рецептора CD95, располагающегося на цитоплазматической мембране клеток и являющегося представителем группы фактора некроза опухолей α (ФНОα) [19]. Запуск рецептора CD95 приводит к появлению мультибелкового комплекса, взаимодействие которого с адапторными молекулами приводит не только к гибели, но и пролиферации клеток. Наиболее часто апоптоз клетки происходит по митохондриальному пути, при котором митохондриальное содержимое попадает в цитоплазму за счет активации белка р53, активации ферментов, фрагментации ДНК, формирования проапоптотических телец и последующего фагоцитоза клетки [20]. 

Традиционно для лечения хондропатий различного генеза, в том числе при остеоартрите суставов, применяют нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), однако в последнее время все более широкое распространение получает обогащенная тромбоцитами плазма (PRP). В различных исследованиях показано, что PRP способна снижать воспаление и дегенерацию хондроцитов [21–24]. Фотоактивированная PRP усиливает биологическую активность тромбоцитов и их регенераторные способности за счет активного высвобождения факторов роста, содержащихся в альфагранулах, в частности за счет трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1), фактора роста фибробластов и тромбоцитарного фактора роста [25]. Эффективность применяемого метода лечения продемонстрирована на больших когортах пациентов, наряду с НПВП и глюкокортикостероидами, однако механизм изменения секреторного, фенотипического и матриксного профилей хондроцитов в дегенеративно измененной ткани мениска недостаточно изучен и представляет большой интерес для определения биологических мишеней при применении PRP.

Цель исследования — изучить влияние стандартной и фотоактивированной PRP in vitro на концентрацию провоспалительных цитокинов (IL6, IL17A), экспрессию гена коллагена II типа (COL2A1) и маркера апоптоза дегенеративных изменений мениска CD95 фиброхондроцитов мениска человека при IL1β-индуцированном воспалении.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Для проведения исследования были использованы хондроциты, выделенные из менисков коленного сустава пациентов; фрагменты менисков были получены при артроскопической резекции в ходе реконструкции передней крестообразной связки. Экспериментальная часть работы была проведена на базе ФГБОУ ВО «ЛГМУ им Свт. Луки» МЗ РФ. 

Образцы хрящевой ткани мениска были отобраны у 12 соматически здоровых пациентов 18–35 лет. Критерии исключения: наличие у пациентов системных воспалительных заболеваний иммунного и инфекционного генеза; септический артрит; проводение внутрисуставной инъекционной терапии с использованием глюкокортикостероидов на протяжении последнего месяца перед вмешательством. Критерии включения: верифицированное дегенеративное повреждение менисков коленного сустава по данным магнитно-резонансной томографии коленного сустава, подтвержденное при проведении артроскопии; возможность получения достаточного количества образцов ткани в общем количестве 4–8 мм³, используемых в дальнейшем в эксперименте.

Полученные образцы ткани мениска всех 12 доноров промывали в растворах фосфатно-солевого буфера с добавлением пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл), после чего измельчали до 1–2 мм³ и подвергали дальнейшей ферментативной обработке с использованием 0,2% коллагеназы II типа (Thermo Fisher Scientific, США; каталожный номер 17101015, с удельной активностью ≥ 125 U/mg (Mandl units)). Выбор данного фермента обусловлен оптимальным соотношением сопутствующих протеаз, клострипаина и липаз, необходимых для гидролиза жестких коллагеновых волокон II типа. Дезагрегацию хряща проводили на протяжении 12 ч при температуре 37 °C в атмосфере 5% CO₂ и постоянном покачивании. Полученную суспензию клеток фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 70 мкм и в последующем центрифугировали при 1500 об./мин на протяжении 5 мин. Выделенные в результате хондроциты культивировали в среде DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (Модифицированная дульбекко среда Игла / Питательная смесь Ф-12)) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствора пенициллина и стрептомицина при 37 °C, 5% CO₂. Для проведения экспериментальной части работы использовали клетки 2–3 пассажа. Образцы ткани мениска от каждого донора были разделены на четыре группы [26]: первую группу воздействию не подвергали, на всех остальных образцах было смоделировано дегенеративное повреждение посредством добавления IL1β, в клетки третьей группы вносили обычную PRP, четвертой — фотоактивированную PRP.

Дегенеративные изменения в клетках вызывали путем воздействия на конъюгированные культуры хондроцитов (80–90%) рекомбинантного человеческого IL1β (R&D Systems (Bio-Techne, США; каталожный номер: 201-LB-005 на 5 мкг), в концентрации 10 нг/мл на протяжении 48 ч. Выбор данного экспериментального подхода был основан на ранее валидированных моделях остеоартроза и дегенеративного повреждения ткани мениска, при которых демонстрируется IL1β-опосредованная активация катаболических сигнальных путей, деградация внеклеточного матрикса, продукция провоспалительных цитокинов и активация апоптоза [27].

PRP получали из периферической венозной крови доноров, которым принадлежали ткани мениска, после госпитализации пред проведением медикаментозного и оперативного лечения с целью минимизации воздействия лекарственных препаратов, применяемых при проведении наркоза и последующего лечения. Для обеспечения строгого контроля воспроизводимости метода и исключения контаминации клеточного состава и стандартизации дозирования для получения PRP использовали пробирки Ycellbio (Ycellbio Medical Co., Ltd., Южная Корея) и двухэтапный протокол центрифугирования. Забор цельной крови проводили непосредственно в пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта 3,8% раствор цитрата натрия в стандартном соотношении. Цитрат натрия использовали строго в качестве ингибитора преждевременной активации тромбоцитов во время забора крови и фракционирования. Выделение тромбоцитарного концентрата выполняли на специализированной лабораторной центрифуге PLC-02 (Ycellbio Medical Co., Ltd., Республика Корея), оснащенной фиксированным угловым ротором на 45° с максимальным радиусом вращения R_max = 13,5 см. Первое центрифугирование проводили при 1500 об./мин (относительное центробежное ускорение — около 300 × g) в течение 10 мин, через несколько секунд проводили второе центрифугирование при 3500 об./мин (относительное центробежное ускорение — около 1650 × g) в течение 10 мин. Полученная в итоге по протоколу производителя PRP содержала 1,0–1,2 × 10⁶ тромбоцитов/мкл, что соответствовало увеличению концентрации тромбоцитов в 4–5 раз по сравнению с исходным уровнем периферической крови. Согласно классификации PAW (Platelet, Activation, White blood cells): класс P3-А (высокое концентрирование тромбоцитов, отсутствие предварительной экзогенной активации, наличие лейкоцитарно-эритроцитарной фракции) [28].

Фотоактивацию экспериментальных образцов PRP без клеток хряща проводили путем воздействия красного света с использованием LED-системы фотоактивации (Juventix LED Activator, США) по следующим параметрам: длина волны — 650 ± 10 нм, плотность мощности — 80 мВт/см², полуширина спектра излучения — (FWHM) 20 нм, угол расходимости луча — 120°, время экспозиции — 7 мин, расстояние от источника света — 10 см, температура окружающей среды — 22–24 °C. Стабильность выходной плотности мощности (80 мВт/см²) обеспечивалась прецизионным источником питания тока со встроенной обратной связью по мощности, сертифицированным производителем оборудования. Цель выбранных параметров облучения состояла в высвобождении факторов роста из альфа-гранул тромбоцитов, за счет более интенсивного энергетического воздействия. Данные параметры активации PRP также были подобраны с учетом оптической плотности плазмы (возможность поглощения лучей белками). Сразу после фотоактивации PRP добавляли в культуральную среду, в которой находились хондроциты в конечной концентрации 10% [29].

Распределение биологических образцов, полученных от каждого донора, проводили равномерно по всем экспериментальным группам. Образцы от каждого донора (n = 12 биологических единиц (доноров)) были зашифрованы номерами, и лабораторную диагностику проводили слепым методом. Клетки от каждого донора были разделены на четыре экспериментальные группы, для каждой выполняли три технические реплики: первая (контроль) — интактные хондроциты, экспериментальному воздействию интерлейкина не подвергались; вторая — хондроциты, подвергшиеся действию IL1β с внесением физиологического раствора натрия хлорида 0,9%; третья — измененные под действием IL1β клетки с внесением PRP без фотоактивации; четвертая — измененные под действием IL1β клетки с внесением в них только фотоактивированной PRP. Физиологический раствор натрия хлорида 0,9% и PRP вносили в эквивалентных объемах. Исследование показателей IL6, IL17A, CD95, COL2A1 проводили через 48 ч после начала инкубации клеток с добавлением обычной и фотоактивированной PRP.

Определение концентрации IL6, IL17A проводили при помощи коммерческих наборов R&D Systems (бренд BioTechne), линейка: Quantikine ELISA (США), в соответствии с протоколом производителя. Маркер апоптоза CD95 оценивали при помощи метода проточной цитометрии, уровень экспрессии гена COL2A1 определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR).

Определение уровня экспрессии гена COL2A1 (коллагена II типа) выполняли методом количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) в строгом соответствии с международным стандартом MIQE [30].

Экстракцию тотальной РНК образцов хрящевой ткани проводили с использованием коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию и чистоту выделенной РНК оценивали спектрофотометрически при помощи NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США) по соотношению оптической плотности A260/A280 (в пределах 1,8–2,0). Целостность РНК подтверждали электрофорезом в 1%-м агарозном геле. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) осуществляли из 1 мкг тотальной РНК с использованием набора RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Scientific, США) с применением смеси олиго (dT) и случайных праймеров.

Для исключения ошибок, связанных с использованием единственного невалидированного референса, нормализацию данных проводили по геометрическому среднему двух стабильных генов человека: GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и ACTB (β-актин). Специфичные олигонуклеотидные праймеры для человека (NCBI Primer-BLAST) были подобраны на границах экзон-экзонных стыков (intron-spanning) для исключения амплификации геномной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX96 Touch, (Bio-Rad, США) с интеркалирующим красителем SYBR Green с помощью мастер-микса PowerUp SYBR Green Master Mix, (Applied Biosystems, США). Протокол включал денатурацию (95 °C, 2 мин) и 40 циклов: денатурация (95 °C, 15 с), отжиг/ элонгация (60 °C, 30 с). Для верификации специфичности продуктов после каждого запуска проводили анализ кривых плавления в диапазоне 65–95 °C; во всех реакциях регистрировали единственный пик плавления без димеров праймеров. Каждую биологическую пробу тестировали в технологических трипликатах с обязательной постановкой контролей без матрицы (NTC) и без обратной транскриптазы (NRT).

Эффективность амплификации (E) определяли по калибровочным кривым пятикратных серийных разведений пула кДНК. Наклон прямых составил от –3,31 до –3,34 (R₂ > 0,99), что продемонстрировало высокую и сопоставимую эффективность реакций: (E = 99,1%) для COL2A1, (E = 99,6%) для GAPDH и (E = 98,9%) для ACTB. Относительный уровень экспрессии мРНК гена COL2A1 рассчитывали сравнительным методом 2-ΔΔ Ct [31]. Значение ΔCt определяли, как разность между пороговым циклом гена-мишени и геометрическим средним пороговых циклов референсных генов (CtCOL2A1 — геом. среднее Ctref). Финальное значение кратности изменения экспрессии выражали относительно группы контроля (интактные/здоровые клетки без обработки).

Определение уровня экспрессии мембранного рецептора CD95 методом проточной цитометрии

Оценка относительного количества CD95-позитивных клеток и плотность экспрессии рецептора на мембране проводили с использованием моноклональных мышиных антител против CD95 человека (Mouse Anti-Human CD95, BioLegend, США). Для конъюгации антител применяли флуорохром фикоэритрин (PE) (BioLegend, Inc., США).

Суспензия хондроцитов в количестве 1 × 10⁶ клеток на тест осаждали центрифугированием при 300× g в течение 5 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА (буфер для цитометрии). С целью минимизации неспецифического связывания через Fc-рецепторы образцы предварительно инкубировали с реагентом для блокировки Fc-рецепторов (Human TruStain FcX (BioLegend), США), 10 мин при +4 °C. Добавляли моноклональные антитела Anti-CD95 (BioLegend, Inc., США) 5 мкл на тест и инкубировали в течение 30 мин в защищенном от света месте при температуре +4 °C. По окончании инкубации клетки дважды отмывали 1 мл избытка холодного буфера для цитометрии путем центрифугирования (300× g, 5 мин). Финальный осадок ресуспендировали в 300 мкл буфера. Для исключения артефактов за 5 мин до анализа в пробы вносили витальный краситель — пропидий иодид (PI) (Sigma-Aldrich (Merck), США) в концентрации 1 мкг/мл.

Гейтирование проводили на проточном цитометре BD FACSCanto II (BD Biosciences, США) с регистрацией для каждого образца не менее 50 000 целевых событий. Анализ данных проводили при помощи программы FlowJo (FlowJo, LLC (является дочерней компанией корпорации Becton, Dickinson and Company / BD Biosciences), США). Гейтирование живых клеток проводили при помощи построения гистограммы распределения флуоресценции витального красителя PI/7-AAD (Sigma-Aldrich, США; BD Biosciences, США). В дальнейших анализах использовали исключительно краситель отрицательной фракции (PI⁻/7-AAD⁻), полностью исключавший погибшие клетки из анализа уровня экспрессии CD95. Финальное гейтирование проводили на гистограмме флуоресценции в канале детекции РЕ путем установления пороговой линии (гейта), разделявшего CD95⁻- и CD95⁺-события. Позиционирование границы осуществляли строго по верхней границе флуоресценции изотипического / FMO-контроля (допускалось не более 0,1–0,5% ложноположительных событий в контроле). Оценивали количество в процентах CD95-позитивных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI, Mean Fluorescence Intensity), отражающую плотность рецепторов Fas на клетке.

Анализ данных выполняли в GraphPad Prism 9.4.1 (GraphPad Software, LLC (США) и G*Power 3.1.9.7 (Heinrich Heine University Düsseldorf, Германия). Априорный расчет мощности для модели rm-ANOVA (внутригрупповой фактор, четыре группы, α = 0,05, мощность 1-β = 0,80, ожидаемый крупный размер эффекта f = 0,45 на основе пилотных данных) определил минимальный объем выборки n = 10. В исследование включено 12 индивидуальных доноров хондроцитов. Нормальность распределения оценивали критерием Шапиро–Уилка и Q-Q plots [31], однородность дисперсий — критерием Левена [32], сферичность — критерием Мокли. Для связанных групп применяли rm-ANOVA (с поправкой Гринхауса–Гейссера при нарушении сферичности) с указанием F-статистики F (f_effect, df_error). Учитывая параллельный анализ четырех показателей (IL6, IL17A, CD95, COL2A1), критический уровень значимости для rm-ANOVA скорректирован поправкой Бонферрони до p_crit = 0,0125). Попарные постхок сравнения проводили критерием Тьюки (p < 0,05), основанным на внутрисубъектной остаточной дисперсии ошибки (MS_error). Данные представлены как Mean ± SD и Box-and-Whisker plots с индивидуальными точками. Рассчитывали 95% CI разности средних, частичную эта-квадрат (η²_p) для группового фактора и d Коэна (d_z) для попарных сравнений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под действием IL1β в хондроцитах мениска человека in vitro через 48 ч наблюдалось формирование стабильных иммуно-воспалительных изменений на молекулярном уровне, при которых в значительной степени возрастает концентрация исследуемых провоспалительных цитокинов. Уровень IL6 вырос в 2,8 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [48,2; 54,2]; η² = 0,984. Аналогичные изменения наблюдали и для концентрации IL17A, которая увеличилась в 3 раза, p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [26,8; 30,4]; η² = 0,984. В культурах клеток доноров, вошедших во вторую группу, процентное содержание CD95-положительных хондроцитов увеличилось в 4,2 раза, p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [20,1; 23,3]; η² = 0,980, что указывает на процессы инициации апоптоза фиброхондроцитов на фенотипическом уровне. Одновременно экспрессия основного матриксного белка COL2A1 угнеталась в 2,4 раза p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–0,62; –0,54]; η² = 0,954, что может говорить в пользу угнетения синтеза коллагена и его деградации под действием IL1β (табл. 1).

Внесение в образцы клеток мениска стандартной PRP приводило к частичному ослаблению индуцированных воспалительных и дегенеративных процессов во всех исследуемых культурах. Наглядно это проявилось в снижении концентрации IL6 в 1,4 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–27,1; –21,9]; η² = 0,911, IL17A в 1,5 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–15,4; –11,4]; η² = 0,879. На клеточном фенотипическом уровне процентное содержание CD95-положительных клеток уменьшалось в 1,66 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–12,8; –9,8]; η² = 0,919. Выросла экспрессия гена COL2A1 в 1,7 раза, p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [0,24; 0,34]; η² = 0,896 (табл. 2).

После внесения фотоактивированной PRP наблюдали статистически значимую регрессию воспалительных изменений хондроцитов во всех исследуемых группах. Произошло снижение IL6 в 1,4 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–19,1; –14,7]; η² = 0,970 по сравнению с показателями, полученными при внесении стандартной PRP. Концентрация IL17A снизилась в 1,6 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–12,1; –9,5]; η² = 0,972. На фенотипическом уровне после внесения фотоактивированной PRP наблюдали уменьшение процентного количества CD95-положительных клеток в 1,8 раза; p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [–8,4; –7,2]; η² = 0,975 по сравнению с группами клеток, в которые вносили стандартную PRP. Возросла экспрессия гена COL2A1 в 1,3 раза, p < 0,05; 95% ДИ разности средних: [0,18; 0,28]; η² = 0,931, что практически сопоставимо с уровнем интактной группы (табл. 3).

Динамика изменений исследуемых показателей во всех группах культур хряща менисков человека in vitro представлена на рисунке.

В сравнении с группой контроля концентрация IL6 во второй группе выросла на 180,3% (2,8 раза), IL17A на 201,4% (в 3 раза), CD95 на 319,1% (в 4,2 раза), COL2A1 снизился на 58,0% (в 2,4 раза) (рисунок). Применение стандартной PRP приводит к снижению IL6 на 30,8%, IL17A на 31,3%, CD95 на 39,6%, тогда как COL2A1 вырос на 69,0% в сравнении со второй группой. Применение фотоактивированной PRP приводило по сравнению с показателями во второй группе к снижению уровня провоспалительных цитокинов — IL6 на 52,01% (в 2,08 раза), IL17A на 56,54% (в 2,30 раза) маркера апоптоза CD95 на 67,02% (в 3,03 раза), и росту COL2A1 на 123,81% (в 2,24 раза). При сравнении с показателями в третьей группе эффект фотоактивированной PRP над эффектами от стандартной PRP превалировал: для IL6 — на 30,67% (в 1,44 раза), для IL17A — на 36,73% (в 1,58 раза), для CD95 — на 45,35% (в 1,83 раза) и роста COL2A1 — на 32,39% (1,32 раза), что подтверждается попарным постхок-критерием Тьюки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Дегенеративные изменения ткани мениска сопровождаются низкоинтенсивным воспалением за счет повышения уровня провоспалительных цитокинов и снижением объема хрящевой ткани [1, 5, 7]. В проведенном исследовании воздействие IL1β приводит к запуску иммуновоспаления и дегенерации в ткани мениска in vitro уже через 48 ч после инкубации. В пользу этого свидетельствует значительное повышение уровня IL6 и IL17А в сравнении с группой контроля, рост маркера апоптоза и снижение экспрессии гена COL2A1. Это обстоятельство позволяет предположить, что при более длительном воздействии IL1β способен приводить к более выраженным изменениям, являясь одним из ключевых цитокинов дегенеративного повреждения ткани мениска [8].

Выбор гена COL2A1 как одного из молекулярных показателей дегенеративных изменений фибрознохрящевой ткани мениска обусловлен его высокой патогенетической значимостью при моделировании остеоартрита. Ткань мениска гетерогенна за счет преобладания в сосудистой зоне коллагена I типа, обеспечивающего растяжимость; в аваскулярной зоне, которая забиралась нами для исследования, строение близко к гиалиновому хрящу за счет хондроцитоподобных клеток и экспрессии коллагена II типа [33]. При воспалении, ассоциированном с остеоартритом и ожирением, происходит фенотипический сдвиг в клетках мениска, что приводит к процессам апоптоза и снижению синтеза коллагена II типа (COL2A1). Этот ген является маркером дегенерации экстрацеллюлярного матрикса аваскулярной зоны мениска и потери амортизирующих свойств, до появления разрывов [34]. Исследование данного показателя позволяет верифицировать способность терапии сохранять хондроцитоподобный фенотип клеток мениска и блокировать катаболический каскад, что невозможно оценить, изолированно анализируя исключительно маркеры фиброзного замещения (коллаген I типа) [35].

Коррекция плазмой, обогащенной тромбоцитами, способна снизить проявления дегенеративных изменений в хондроцитах и приводит к снижению уровня воспалительного процесса наподобие действия нестероидных противовоспалительных препаратов или глюкокортикостероидов [2, 21–24]. При этом PRP не содержит дополнительных химических компонентов, а только тромбоциты, которые помимо регенераторных свойств, способны уменьшать проявление воспаления. В ходе эксперимента установлено снижение концентрации IL6 и IL17А и маркера CD95, увеличение уровня экспрессии COL2A1 за счет биологической активности PRP. Отдельные исследования in vitro и ex vivo говорят о том, что PRP способна приводить к пролиферации хондроцитов. Этот процесс может идти в ущерб зрелым клеткам, которые в подобных условиях проявляют свойства фибробластов, снижающих экспрессию COL2A1, и синтезируют фиброзный коллаген I типа (COL2A1) [36], что в проведенной работе не подтвердилось.

Использование фотоактивированной плазмы, как установлено в проделанном эксперименте, приводит к еще большему усилению биологической активности и регенеративных способностей тромбоцитов. Это может происходить за счет активного высвобождения тромбоцитарных факторов роста, которые депонированы в альфа-гранулах, и модуляции воспалительных сигнальных путей. Ключевая роль в процессах регенерации фибрознохрящевой ткани и уменьшении повреждения играет трансформирующий фактор роста β-1 (TGF-β1), фактор роста фибробластов (bFGF/FGF2) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) [24, 25]. Полученные молекулярногенетический и клеточный эффекты особенно значимы были в четвертой группе — снижение уровней IL6, IL17А и CD95, увеличение экспрессии гена COL2A1 произошли практически до показателей интактных хондроцитов первой группы. Снижение уровня провоспалительных цитокинов происходит за счет ингибирования ключевого провоспалительного транскрипционного фактора NF-κB (ядерного фактора каппа-Би). Под действием PRP блокируются фосфорилирование и деградация ингибиторного белка IκB, что впоследствии приводит к выключению генов провоспалительных цитокинов. Фотоактивация приводит к усилению подобного эффекта за счет активации цитохром-с-оксидазы митохондрий, стимуляции аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и кратковременного высвобождения активных форм кислорода, активирующего эндогенные противовоспалительные факторы. Активация каскада фосфорилирования приводит к ингибированию проапоптотических белков семейства Bcl-2 (Bax и Bad), блокировке транскрипционного фактора FoxO, в результате происходит деактивация рецепторов CD95 и дальнейший запуск эффекторных каспаз [37].

Увеличение экспрессии гена COL2A1 при добавлении фотоактивированной PRP происходит за счет активации сигнального пути Smad2/3 под действием TGF-β1, связывающегося с рецепторами TGFBR1/TGFBR2, в результате чего происходит фосфорилирование белков Smad2 и Smad3; в результате полученный комплекс транслоцируется в область ядра и связывается с промотором гена SOX9, отвечающего за хондрогенез. В активированном состоянии ген приводит к запуску каскада экспрессии мРНК COL2A1, что приводит к увеличению синтеза коллагена II типа и плотности внеклеточного матрикса мениска [38]. Применение стандартной PRP имеет меньший потенциал в отношении COL2A1 в сравнении с фотоактивированной формой, так как имеет меньшую кинетику дегрануляции. Резкая и избыточная пролиферативная стимуляция хондроцитов стандартной PRP способна вызвать их транзиторную дифференцировку, приводящую к угнетению синтеза ключевых структурных маркеров [39]. Фотоактивированная плазма при нарушении протокола облучения может иметь перестроенную кинетику дегрануляции, что обеспечивает растянутое во времени высвобождение факторов роста (PDGF, bFGF). Их избыток приводит к непрерывному делению хондроцитов, обусловливающему выключение анаболического синтеза клеточного матрикса COL2A1 и ACAN [25].

Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют в пользу возможности применения обогащенной тромбоцитами плазмы по стандартной методике и с фотоактивацией для регенерации хрящевой ткани и ее применения при реконструктивных операциях на менисках и хондропластике.

Ограничения исследования

Исключительно высокая величина эффекта (η² = 0,879– 0,984) и низкая междонорная вариабельность (CV ≈ 5–8%) для человеческого материала обусловлены жесткой биологической стандартизацией (использование клеток раннего пассажа, синхронизация клеточного цикла) и математической спецификой модели rm-ANOVA. Данный дизайн изолирует индивидуальную вариабельность доноров из дисперсии ошибки, что закономерно завышает долю дисперсии (η²p), объясняемую групповым фактором, и может ограничивать прямую экстраполяцию данных in vivo.

ВЫВОДЫ

В процессе проведенного исследования установлено, что воздействие IL1β на культуру хондроцитов ткани мениска человека in vitro приводит к увеличению концентрации в ней провоспалительных цитокинов IL6, IL17, маркера апоптоза CD95⁺-клеток и снижению уровня экспрессии гена COL2A1. Данные изменения демонстрируют иммуновоспалительный паттерн с запуском апоптоза хондроцитов и деградации экстрацеллюлярного матрикса в хряще под воздействием IL1β. Применение PRP, обладающей биологической активностью и регенеративным потенциалом за счет высокого содержания тромбоцитов, способно снижать выраженность воспаления и апоптоза в хрящевой ткани и положительно влияет на регенерацию и синтез коллагена II типа, т. е. эффективно влияет на секреторный (IL6, IL17A), матриксный (COL2A1) и фенотипический (CD95) профили фиброхондроцитов мениска человека при IL1βиндуцированном воспалении in vitro. В исследовании было показано, что фотоактивированная PRP способна оказывать более выраженную биологическую активность в отношении всех изучаемых параметров за счет более активного высвобождения факторов роста из тромбоцитов и снижения уровня воспаления и апоптоза клеток, сопровождается нормализацией секреторного, фенотипического и матриксного профилей. Дальнейшее изучение влияния обычной и фотоактивированной PRP в клинической практике с разработкой оптимальных сроков и кратности внутрисуставного введения позволит более точно оценить механизм регенерации хондроцитов при выборе методов клеточной терапии у пациентов с дегенеративным поражением хрящевой ткани мениска, в том числе при остеоартрите.