Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относят болезнь Крона и язвенный колит, представляют собой хронические иммуноопосредованные состояния, при которых нарушаются кишечный барьер и регуляция иммунного ответа [1]. В последние годы все активнее изучают молекулярные составляющие мукозального барьера, такие как связывающий жирные кислоты белок (I-FABP), муцин-2 и трефоиловые факторы (TFF2, TFF3). Эти компоненты играют ключевую роль в сохранении целостности кишечного эпителия и модуляции воспалительного ответа [2, 3]. Важную роль в поддержании мукозального барьера играет кишечная микробиота [4].

Современные исследования показывают, что I-FABP служит чувствительным маркером повреждения энтероцитов, а его уровень в сыворотке крови коррелирует с активностью воспалительного процесса при ВЗК [5]. Основной компонент кишечной слизи муцин-2 образует защитный слой, препятствующий адгезии патогенов и их проникновению в эпителий. При ВЗК синтез и структура муцина-2 нарушаются, что ведет к повышенной проницаемости кишечного барьера [6]. Трефоиловые факторы TFF2 и TFF3 участвуют в репарации слизистой оболочки кишечника, а TFF3 рассматривают как перспективный маркер активности воспаления при язвенном колите [7, 8]. Пептиды TFF также являются частью хронического воспалительного ответа при различных заболеваниях, таких как язвенный колит, дивертикулит, холецистит, ВЗК, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, панкреатит и хроническая обструктивная болезнь легких [9].

Современные исследования подчеркивают важность комплексной оценки состояния мукозального барьера и его молекулярных компонентов при ВЗК. Показано, что нарушение барьерной функции кишечного эпителия, в том числе на уровне митохондриальных механизмов, вносит значимый вклад в патогенез воспалительных заболеваний кишечника и может быть оценено по уровню сывороточных маркеров. В связи с этим актуальной задачей остается поиск доступных лабораторных показателей, отражающих состояние мукозального барьера [10, 11].

Целью исследования было провести сравнительную комплексную оценку сывороточных компонентов мукозального барьера у здоровых доноров и у пациентов с ВЗК.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 20 пациентов с ВЗК в возрасте 20–70 лет, находившиеся на стационарном лечении в стадии обострения язвенного колита, и 20 здоровых доноров в возрасте 18–65 лет без признаков ВЗК. Критерии включения в исследование пациентов с ВЗК: наличие установленного диагноза ВЗК, подтвержденного клиническими, эндоскопическими и морфологическими данными; стадия обострения заболевания. Критерии исключения: беременность или грудное вскармливание, сопутствующая патология печени или почек в стадии декомпенсации, наличие илеостомы или колостомы, ранее проведенная обширная резекция тонкой или ободочной кишки, субтотальная или тотальная колэктомия, наличие врожденной или приобретенной формы иммунодефицита, злокачественные новообразования, наличие у пациента признаков активного инфекционного процесса, прием антибактериальных препаратов в течение трех месяцев до включения в исследование, отказ пациента подписать информированное согласие на участие в исследовании.

В группу здоровых доноров были включены лица без ВЗК. Критерии исключения: 1) сопутствующие заболевания и состояния, влияющие на микробиоту кишечника: ВЗК, синдром мальабсорбции, онкологические заболевания, операции на ЖКТ (кроме аппендэктомии), функциональные заболевания кишечника, целиакия, аллергические заболевания, сахарный диабет 1-го и 2-го типов, метаболический синдром, неалкогольная жировая болезнь печени, психиатрические заболевания, прием иммуносупрессивных, цитостатических, антибактериальных препаратов, глюкокортикостероидов, пробиотиков/пребиотиков, регулярный прием НПВП в течение трех месяцев до исследования, ожирение или дефицит массы тела; 2) злоупотребление алкоголем и наркотическими веществами; хронические заболевания внутренних органов; 3) инфекционные и паразитарные заболевания; 4) диарея (с частотой стула более трех раз в день) в течение не менее трех дней подряд на протяжении последнего месяца; 5) беременность или лактация. Выборка участников исследования была случайной, исследование было одноцентровое, одномоментное. Размер выборки предварительно не рассчитывали.

Забор биоматериала и методика исследования

Образцы венозной крови собирали в вакуумные пробирки с активатором свертывания. Сыворотку получали центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин при +4 °C, после чего аликвотировали и хранили при – 80 °C до проведения анализа.

Концентрации I-FABP, TFF2, TFF3 и муцина-2 (MUC2) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов реагентов (Cloud-Clone Corp., США) в строгом соответствии с инструкциями производителя. Диапазоны измерения: для I-FABP — 15,6–1000 пг/мл, для TFF2 — 6,25–400 пг/мл, для TFF3 — 12,5–800 пг/мл, для MUC2 — 0,156–10 нг/мл.

Результаты эксперимента анализировали с использованием программы статистики на платформе MedCalc® Statistical Software, версия 20 (MedCalc Software Ltd., Бельгия). Данные представлены как медиана и интерквартильный размах Me [Q₂₅–Q₇₅]. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05, для сравнения использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнительный анализ содержания в сыворотке крови компонентов мукозального барьера у пациентов с ВЗК и здоровых доноров выявил ряд изменений (таблица).

Содержание I-FABP и муцина-2 в группе больных с ВЗК соответствовало показателям контрольной группы. В то же время отмечались изменения в содержании трефоиловых факторов.

Концентрация TFF2 у пациентов с ВЗК достоверно превышала показатели контрольной группы в 5 раз. Медиана TFF2 у пациентов с ВЗК составила 83,30 пг/мл, у здоровых доноров — 16,60 пг/мл. Следует отметить, что если в группе здоровых доноров нижний квартиль значений TFF2 находился на нулевой отметке, то у пациентов с ВЗК минимальный уровень этого фактора составлял 46,29 пг/мл.

Статистически значимые различия были также выявлены для TFF3, уровень которого в 4,2 раза превышал значения в группе контроля, а именно 253,12 пг/мл против 59,90 пг/мл, при этом нижний квартиль TFF3 у здоровых доноров также регистрировался на нулевом уровне.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные указывают на изменения в содержании ключевых компонентов мукозального барьера у пациентов с ВЗК, что согласуется с современными представлениями о патогенезе этих заболеваний.

Наиболее выраженные сдвиги отмечены для трефоиловых факторов, что подтверждает их важную роль в поддержании целостности кишечного барьера и репарации слизистой оболочки [1].

Особого внимания заслуживает значительное повышение уровня TFF3 у пациентов с ВЗК (в 4,2 раза). Известно, что столь выраженное увеличение концентрации TFF3 представляет собой компенсаторную реакцию, направленную на восстановление поврежденного эпителия. Примечательно, что даже минимальные значения TFF3 у пациентов с ВЗК существенно превышали показатели здоровых лиц, что может указывать на постоянную активацию репарационных механизмов при хроническом воспалении [2].

Обнаруженное в нашем исследовании 4,2-кратное увеличение уровня TFF3 у пациентов с ВЗК имеет важное патогенетическое и клиническое значение. Более того, современные публикации подтверждают, что степень повышения TFF3 коррелирует с тяжестью повреждения эпителия и площадью пораженной слизистой [6]. Столь значимое увеличение концентрации TFF3, вероятно, отражает активацию компенсаторных механизмов, направленных на восстановление целостности кишечного барьера. Это подтверждается экспериментальными данными, согласно которым TFF3 стимулирует миграцию эпителиальных клеток и ускоряет регенерацию повреждений слизистой [12].

Помимо общепризнанной роли TFF3 в стабилизации муцинового слоя, который секретируют бокаловидные клетки кишечника, известна его способность стимулировать репарацию слизистой за счет активации пути ERK [7]. Экспрессия TFF3 активируется в ответ на повреждение слизистой оболочки, а также под влиянием провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNFα) и различные интерлейкины.

Выявленное значительное повышение концентрации TFF3 может быть обусловлено двумя основными механизмами. Во-первых, это компенсаторная реакция, направленная на восстановление поврежденного эпителия и активацию противовоспалительных механизмов. Во-вторых, это усиление его поступления в системный кровоток вследствие нарушения целостности мукозального барьера, обусловленного как повышением транскапиллярной проницаемости, так и дисфункцией щелевых контактов между энтероцитами.

Современные данные расширяют представления о функциях TFF. Пептиды TFF выполняют не только митогенную, но и структурную роль в составе нерастворимого внутреннего слизисто-бикарбонатного барьера желудка (комплекс TFF2/MUC6) и в предполагаемой системе очищения слизистой для различных микроорганизмов. Они могут задерживать вирусы с помощью иммуноглобулинов на поверхности слизистой и участвуют во врожденной иммунной защите [13]. Экспрессия TFF3 регулируется через толл-подобные рецепторы комменсальными бактериями. Показано, что TFF1 может играть защитную роль при воспалительных процессах, в том числе в головном мозге, а TFF3 экспрессируется в активированных микроглиальных клетках и может действовать как нейронный хемотаксический фактор [13]. В литературе отмечается, что повышение концентрации трефоиловых факторов можно наблюдать и при воспалительных процессах другой локализации [14, 15]. К таким состояниям относится и пародонтит, при котором повышенные уровни TFF-1 и TFF-3 выявляются как локально, так и системно, что указывает на участие этих пептидов в ответе на разрушение пародонтальных тканей [15].

Полученные нами данные согласуются с работами, в которых TFF3 рассматривают как маркер регенерации слизистой при язвенном колите [16], а TFF2 — как фактор, стабилизирующий муциновый барьер и участвующий в защите от повреждения [17, 18]. В экспериментальных моделях TFF2/SP-дефицитные мыши имели повышенную чувствительность к NSAID-повреждению, что подтверждает защитную роль TFF2 [17]. 

Внимания заслуживают иммуномодулирующие свойства TFF2, которые активно изучают в последние годы. Установлено, что TFF2 способен подавлять продукцию ключевых провоспалительных цитокинов, включая IL1β и TNFα, через ингибирование NF-κB сигнального пути [9]. Отмечается также, что макрофаги способствуют пролиферации эпителия через TFF2-зависимый механизм [19]. Эти данные позволяют предположить, что повышение уровня TFF2 при ВЗК может представлять собой не только следствие повреждения эпителия, но и активный компенсаторный механизм, направленный на ограничение воспалительной реакции [15]. Важным аспектом является взаимодействие TFF2 с кишечной микробиотой. По последним исследованиям, этот белок способен модулировать состав и функциональную активность кишечного микробиома [20].

Представляют также интерес результаты, касающиеся муцина-2. Хотя статистически значимых различий между группами выявлено не было, наблюдаемая тенденция к повышению его концентрации у пациентов с ВЗК согласуется с современными представлениями о компенсаторной гиперпродукции муцинов в условиях хронического воспаления [21]. Важным патофизиологическим аспектом является то, что муцин-2 представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, что существенно ограничивает его пассивную диффузию через кишечный барьер. В связи с этим сывороточный уровень муцина-2 может быть менее чувствительным маркером нарушения барьерной функции по сравнению с низкомолекулярными белками, такими как I-FABP. Отсутствие значимого роста концентрации муцина-2 в крови, несмотря на активное воспаление, можно объяснить тем, что его повышенная секреция при ВЗК направлена в первую очередь на формирование защитного муцинового слоя в просвете кишки. Кроме того, наблюдаемая тенденция к повышению может быть следствием компенсаторного усиления его синтеза, в то время как значительное поступление в системный кровоток происходит лишь при крайней степени повреждения мукозального барьера.

Ограничения исследования

Результаты исследования следует рассматривать с учетом ряда естественных ограничений. Во-первых, объем выборки (по 20 человек в каждой группе) был относительно небольшим, что могло отразить некоторую ограниченность статистической мощности анализа. Во-вторых, одноцентровый и одномоментный (поперечный) характер работы не позволяет оценить динамику маркеров во времени и их связь с долгосрочными исходами. В-третьих, исследуемая группа включала пациентов с язвенным колитом в стадии обострения, поэтому полученные результаты в первую очередь относятся к этой категории больных.

ВЫВОДЫ

У пациентов с ВЗК в стадии обострения выявлено повышение сывороточных концентраций TFF2 и TFF3 по сравнению со здоровыми донорами. Медиана TFF2 составила 83,30 пг/мл против 16,60 пг/мл (p = 0,0104), TFF3 — 253,12 пг/мл против 59,90 пг/мл (p = 0,0109). Содержание I-FABP и муцина-2 в сыворотке крови у пациентов с ВЗК значимо не отличалось от показателей здоровых доноров. Это может быть связано с тем, что I-FABP отражает острое повреждение энтероцитов и при хроническом воспалении не всегда повышается, а муцин-2 представляет собой крупный гликопротеин, который плохо проникает в системный кровоток, поэтому его сывороточный уровень слабо отражает активность воспаления в кишечнике. Минимальные значения TFF3 у пациентов с ВЗК превышали показатели здоровых лиц, что может отражать постоянную активацию репаративных процессов при хроническом воспалении. Определение сывороточных TFF2 и TFF3 может быть использовано как дополнительный лабораторный критерий активности воспаления при ВЗК.