С-реактивный белок (СРБ) является белком острой фазы воспалительного процесса. Он был открыт в 1930 г. В. Тиллетом и Т. Фрэнсисом, синтез его осуществляется клетками печени в ответ на продукцию провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1, 6, фактор некроза опухолей) [1]. Белок относится к семейству пентраксинов, кальцийзависимых лиганд-связывающих белков плазмы и включает в себя пять идентичных негликозилированных субъединиц, каждая из которых содержит в себе 206 аминокислотных остатков. Он стал первым лабораторным маркером воспаления или повреждения тканей, сердечнососудистой патологии [2–6].

Нативная пентамерная форма СРБ (nСРБ) циркулирует в плазме крови, она способна к локальной диссоциации под действием воспаления или инфекционных агентов. Катализирующим фактором подобных изменений может выступить изменение микроокружения (например, повышение температуры, дефицит ионов кальция, рост концентрации молочной кислоты), что приводит к переходу nСРБ в mСРБ. В здоровом организме концентрация nСРБ < 5 мг/л, при воспалении этот показатель возрастает в 100–1000 раз. Образующийся mСРБ обладает мощным провоспалительным действием за счет взаимодействия с клетками эндотелия, нейтрофилами, макрофагами и тромбоцитами [7, 8]. Изоформа mСРБ нерастворима и имеет склонность к агрегации и депонированию в субэндотелиальном матриксе сосудов и синовиальной оболочке, тогда как nСРБ частично способен растворяться в плазме крови. Функция nСРБ заключается в опсонизировании апоптотических клеток, за счет чего и происходит активация фагоцитоза [9].

От интенсивности патологического процесса зависит скорость синтеза СРБ [10]. В последнее время широкое распространение получила гипотеза о значении СРБ при развитии нейродегенеративных заболеваний [11–12]. При ожирении развивается хроническое воспаление, при котором постоянно происходит выработка провоспалительных цитокинов и СРБ [13–15]. Белок служит основным маркером при ревматоидном артрите, при остеоартрозе, он также показывает степень воспалительного процесса [15]. Установлено, что показатель СРБ у пациентов с рентгенологическими признаками остеоартроза выше и ингибирование его зависит от дозы противовоспалительных препаратов [16, 17].

Целью работы было изучить концентрацию СРБ, его изоформ (nСРБ и mCРБ) плазмы крови крыс с артрозом, сочетанным с ожирением, в зависимости от введения различных доз дексаметазона на протяжении 10 суток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Моделирование артроза и ожирения, определение дозы дексаметазона

Эксперимент проводили на базе ФГБОУ ВО «ЛГМУ им. Свт. Луки» МЗ РФ на 180 белых лабораторных крысах-самцах, линии Вистар, возрастом 8–10 недель, массой 200– 250 г. Животных содержали в условиях стандартного вивария (22 °C ± 2 °C, при 12-часовом цикле дня и ночи) при свободном доступе к воде и пище. С использованием метода «конвертов» сотрудником, который не принимал участия в эксперименте, животные были разделены на пять групп (n = 36) до моделирования артроза и ожирения, одна в экспериментальном моделировании патологического состояния не участвовала. После моделирования артроза и ожирения проведена повторная рандомизация 144 животных (n = 36) на четыре группы.

Ожирение моделировали путем назначения высококалорийной диеты, состоявшей из 45% растительных и животных жиров и 35% углеводов на срок 8 недель. Оценку степени ожирения проводили при помощи индекса Ли:

Ли = 1000 × масса тела (г) / длина от кончика носа до ануса (см).

Для исследования отбирали животных с показателем 310 и более и увеличением веса на 25–40% от исходной величины (средняя степень ожирения) [18].

Артроз коленного сустава смоделирован за счет многократного малоинвазивного повреждения хряща. Процедуру выполняли снаружи вовнутрь при помощи тонкого тросика с разволокнениями на конце, вводимого при помощи иглы для инъекций в полость сустава. Повреждения хряща наносили путем быстрого протягивания через полость сустава с последующей жесткой иммобилизацией сустава в физиологическом положении при помощи пластикового тутора, изготовленного из полимерного гипсового бинта на срок 4 недели. Перед моделированием артроза область сустава эпилировали, после чего обрабатывали раствором 70%-го этилового спирта и обезболивали 2%-м раствором лидокаина в объеме 1,0 мл. Положительным считали результат, при котором наблюдали достоверные признаки остеоартроза сустава (сужение суставной щели, узурацию, наличие остеофитов, появление субхондрального склероза) на рентгенограммах, выполненных стоматологическим аппаратом Posdion Rextar X, 70 кВ (Posdion, Южная Корея).

Животным группы I (интактным) после эпиляции и обработки места введения 70%-го раствора этилового спирта внутримышечно вводили 1,0 мл физиологического раствора натрия хлорида (ОАО «Дальхимфарм», Россия), группы II (остеоартроз + ожирение) + 1,0 мл NaCl; группам III, IV, V (остеоартроз + ожирение) внутримышечно вводили в концентрации 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл раствора дексаметазона (вводимый объем составлял 1 мл, производитель ООО «Эллара», Россия), введение дексаметазона и физиологического раствора натрия хлорида осуществляли однократно, в один и тот же период времени. Забор крови производили из хвостовой вены на третьи, пятые, 10-е сутки. Обоснование доз дексаметазона происходило из следующего расчета: 1 нг/мл — это низкая и минимально эффективная концентрация, позволяющая получить минимальный противовоспалительный эффект без развития иммуносупрессии; 10 нг/мл — это терапевтическая доза, вводимая с целью подавления цитокин-индуцированного воспаления; 100 нг/мл — высокая доза, применяемая для моделирования возможного «парадоксального» эффекта при введении глюкокортикоидов. Подобранный диапазон доз позволял оценить дозозависимые ответы СРБ и его изоформ от минимальной до супертерапевтической. Подобная схема имеет полное соответствие с описанием моделирования противовоспалительного эффекта дексаметазона у лабораторных животных в ранее опубликованных работах [19]. Побочные эффекты, оказываемые дексаметазоном, оценивали на основании поведенческой активности при проведении теста «Открытое поле» [20], колебаний массы и индекса Ли. Выраженных побочных эффектов при введении 1 и 10 нг/мл дексаметазона не наблюдали, введение 100 нг/мл приводило к развитию гипергликемии, снижению активности, что имеет полное согласование с известными подобными эффектами от введения дексаметазона.

Подготовка плазмы

Кровь из латеральной хвостовой вены отбирали в пробирки (кат. № 450531; Greiner Bio-One, Австрия) с напылением антикоагулянта (ЭДТА) в количестве 1 мл. Плазму получали путем центрифугирования при 3000 об./мин на протяжении 15 мин при температуре 4 °C, после чего ее помещали в аликвоты и подвергали немедленному замораживанию при температуре –80 °C до проведения анализа. Повторное размораживание и замораживание исключали для избежания диссоциации нативного СРБ (nСРБ) в мономерную форму (mСРБ).

Определение концентрации общего СРБ плазмы крови

Концентрацию СРБ определяли с использованием коммерческих наборов для ELISA, диагностического планшета Rat ELISA Kit (Abcam, Великобритания). Каждая размороженная проба была разведена из расчета 1 : 5 буферным раствором, после чего проведена инкубация с первичными антителами из расчета 100 мкл/лунку 2 ч при температуре 37 °C. Через 30 мин проводили добавление биотинилированных антител при температуре 37 °C. По прошествии 30 мин при температуре 37 °C добавляли стрептавидин-HRP, а через 15 мин в условиях полной темноты — TMB-хромоген. Измерение оптической плотности производили при 450 нм на микропланшетном ридере BioTek ELx808 (BioTek, США).

Определение концентрации nCРБ плазмы крови

Концентрацию nCРБ в плазме определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (сэндвичИФА) с использованием коммерческого набора ELISA, диагностического планшета Rat ELISA Kit (Abcam, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. В лунки планшета, предварительно сенсибилизированные специфическими антителами к nCРБ крысы, вносили по 100 мкл разведенных образцов плазмы и стандартов. После инкубации и промывки добавляли биотинилированные детекторные антитела и конъюгат авидина с пероксидазой хрена (HRP). Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 450 нм на ридере BioTek ELx808 (BioTek, США).

Определение концентрации mСРБ плазмы крови

Концентрацию mСРБ определяли при помощи конформационно-специфического сэндвич-ИФА, согласно протоколу производителя. Микротитровальные планшеты сорбировали в ночное время при 4 °C моноклональными антителами, специфично распознающими скрытый неоэпитоп mСРБ (клон 9C9 или 3H12, в концентрации 2 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,6). После блокировки свободных участков связывания 1%-м раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS, в лунки вносили образцы плазмы (в разведении 1 : 10) и инкубировали 2 ч при 37 °C. Для подтверждения отсутствия перекрестной реактивности и спонтанного распада пентамера в ходе анализа, в качестве отрицательного контроля использовали стандарты очищенного нативного пентамерного СРБ (кат. № PHP277; Bio-Rad Laboratories, Inc., Великобритания). Детекцию осуществляли с помощью поликлональных антител козы к nСРБ крысы (кат. № A110102P; Bethyl Laboratories, Inc., США), конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP). Реакцию визуализировали с использованием субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) и останавливали добавлением 2M H2SO4. Измерение оптической плотности проводили при 450 нм. Нижний предел обнаружения mСРБ составлял 1,0 нг/мл.

Статистический анализ полученных результатов

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 10.0. Данные, соответствующие нормальному распределению (тест Шапиро–Уилка), представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (М ± SD). Статистическую значимость различий между экспериментальными группами в связи с неравенствами дисперсий (критерий Левина) оценивали с использованием критерия Краскела– Уоллиса, с последующим попарным сравнением по критерию Стьюдента, используя поправку Бонферрони. В качестве меры эффекта использовали разности средних значений показателей групп с группой контроля с 95%-ми доверительными интервалами. Оценку величины вклада изучаемых факторов (величина эффекта) проводили посредством расчета частичной эта-квадрат (η²). Различия между группами признавали статистически значимыми при достижении уровня критической значимости p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании удалось установить взаимосвязь между ожирением на фоне артроза и коррекцией различными дозами дексаметазона на третьи, пятые, 10-е сутки. За счет воспаления происходило повышение концентрации СРБ во II группе, на фоне использования дексаметазона воспалительный процесс уменьшался. В III группе происходило снижение концентрации СРБ на третьи сутки, а на пятые и 10-е сутки концентрация СРБ возрастала, превышая показатели II группы. В IV и V группах дексаметазон оказывал противовоспалительный эффект на протяжении пятых суток, к 10-м суткам эффект снижался, концентрация СРБ была ниже, чем у II группы (табл. 1).

При анализе показателя СРБ во II группе на третьи сутки установлено увеличение на 2,1%, η² = 0,005; на пятые сутки — на 26,4%, η² = 0,378; на 10-е сутки — на 174,5%, η² = 0,933 в сравнении с контрольной группой. В III группе на третьи сутки имело место снижение концентрации СРБ на 7,9%, η² = 0,089 и на 9,82%, η² = 0,131; на пятые сутки наблюдался рост на 44,2%, η² = 0,632 и на 14,07%, η² = 0,210; на 10-е сутки — на 231,6%, η² = 0,919 и на 20,82%, η² = 0,551 в сравнении с I и II группами соответственно. В IV группе на третьи сутки концентрация белка снизилась на 26,1%, η² = 0,498 и на 27,64%, η² = 0,530; на пятые сутки — на 7,9%, η² = 0,069 и на 27,22%, η² = 0,724, на 10-е сутки наблюдали рост на 152,3%, η² = 0,951 и снижение на 8,07%, η² = 0,224 в сравнении с I и II группами соответственно. При увеличении дозы дексаметазона в V группе на третьи сутки показатель СРБ снизился на 21,4%, η² = 0,425 и на 23,16%, η² = 0,466; на пятые сутки — на 9,52%, η² = 0,091 и на 28,44%, η² = 0,740; на 10-е сутки наблюдали рост на 149%, η² = 0,935 и снижение на 9,10%, η² = 0,274 в сравнении с I и II группами соответственно.

Наглядно динамику изменений концентрации СРБ в исследуемых группах на протяжении всего периода эксперимента можно проследить на графике (рис. 1).

Мониторинг пентамерной формы (nСРБ) показывал незначительное изменение концентрации даже под влиянием дексаметазона. Во II группе на третьи сутки концентрация СРБ возрастала, затем снижалась с минимальным показателем на 10-е сутки. В III группе концентрация nСРБ была максимальна на третьи сутки и снижалась, достигая минимального значения на 10-е сутки. В IV группе максимальная концентрация наблюдалась на третьи сутки, на пятые сутки она снизилась, оставаясь на более высоком уровне в сравнении со II и III группами, с минимальным значением на 10-е сутки. В V группе концентрация nСРБ была выше на третьи и пятые сутки в сравнении с I группой и на пятые сутки в сравнении со II группами, на 10-е сутки она снизилась, но была выше, чем во II группе (табл. 2).

Анализ уровня nСРБ показал, что во II группе произошло повышение концентрации на 11,3%, η² = 0,505 на третьи сутки, на пятые сутки он снизился на 5,4%, η² = 0,072; на 10-е сутки на 25,7%, η² = 0,651 в сравнении с контрольной группой. В III группе под действием дексаметазона эта изоформа СРБ на третьи сутки снизилась на 3%, η² = 0,039 и на 12,96%, η² = 0,580; на пятые сутки концентрация снизилась на 7,6%, η² = 0,250 и на 2,33, η² = 0,022; на 10-е сутки на 28,5%, η² = 0,798 и на 3,84, η² = 0,083 в сравнении с I и II группами соответственно. В IV группе снижение концентрации белка на третьи сутки составило 3%, η² = 0,064 и на 12,96, η² = 0,640; на пятые сутки концентрация снизилась на 4,4%, η² = 0,034 и рост на 1,16%, η² = 0,002; на 10-е сутки снижение концентрации на 22,8%, η² = 0,580 и рост 3,84%, η² = 0,022 в сравнении с I и II группами соответственно. В V группе на третьи сутки наблюдался рост концентрации nСРБ на 1%, η² = 0,002 и снижение на 9,26%, η² = 0,385; на пятые сутки концентрация выросла на 1,1%, η² = 0,002 и на 6,98%, η² = 0,052; на 10-е сутки концентрация снизилась на 18,1%, η² = 0,626 с ростом на 10,25%, η² = 0,337 в сравнении с I и II группами соответственно. На рис. 2 представлена динамика изменений концентрации нативного СРБ в исследуемых группах на протяжении всего периода эксперимента.

Анализ мономерного СРБ показал его значительный рост во II группе на протяжении всего периода эксперимента с максимальным значением на 10-е сутки. В III группе дексаметазон вызвал снижение концентрации mСРБ на третьи и пятые сутки, на 10-е сутки концентрация значительно возрастала, превышая значения I и II групп. В IV и V группах дексаметазон способствовал снижению концентрации mСРБ на протяжении пяти суток, на 10-е сутки показатель белка вырос, в сравнении с I группой, оставаясь ниже по отношению ко II группе (табл. 3).

При анализе концентрации mСРБ во II группе установлено увеличение концентрации на третьи сутки на 91%, η² = 0,977; на пятые сутки — на 161,8%, η² = 0,987; на 10-е сутки — на 287,1%, η² = 0,997 в сравнении с контрольной группой. В III группе на третьи сутки концентрация mСРБ в плазме крови снизилась на 5,9%, η² = 0,101 и на 50,77%, η² = 0,986; тогда как на пятые сутки его концентрация возросла на 7,8%, η² = 0,080 и снизилась на 58,8%, η² = 0,969; на 10-е сутки рост концентрации на 360,2%, η² = 0,999 и на 18,89% η² = 0,953 в сравнении с I и II группами соответственно. В IV группе на третьи сутки наблюдали снижение концентрации на 32,6%, η² = 0,790 и на 64,77% η² = 0,993, на пятые сутки изменений не наблюдали 0% η² = 0,000, со снижением на 61,80%, η² = 0,991; на 10-е сутки наблюдали значительный рост концентрации на 270,9%, η² = 0,992 со снижением на 4,17%, η² = 0,274 в сравнении с I и II группами соответственно. В V группе на третьи сутки mСРБ снизился на 19,8%, η² = 0,507 и на 58,03%, η² = 0,984; на пятые сутки рост составил 6,7%, η² = 0,126, со снижением на 59,23%, η² = 0,985; на 10-е сутки имел место рост концентрации на 280,6%, η² = 0,994, со снижением на 1,67%, η² = 0,069 в сравнении с I и II группами соответственно. 

Динамические изменения концентрации СРБ в плазме крыс с ожирением, сочетанным с артрозом, представлены на рис. 3.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На фоне ожирения и артроза сустава концентрация СРБ в крови увеличивается за счет провоспалительных цитокинов, выделяемых жировой тканью [1]. Артроз в сочетании с ожирением приводит к увеличению концентрации СРБ на протяжении всего периода эксперимента, с достижением максимального значения к 10-м суткам по сравнению с группой контроля. Концентрация СРБ в плазме крови у крыс с экспериментальной моделью ожирения, сочетанного с артрозом, возрастает, что подтверждает наличие воспаления в организме [2–6]. На фоне введения 1 нг/мл дексаметазона показатель общего СРБ снижается на третьи сутки, что говорит в пользу уменьшения воспаления, на пятые и 10-е сутки концентрация значительно возрастает, даже в сравнении с группой с ожирением, сочетанным с артрозом. При введении дексаметазона на фоне острой ишемии нижних конечностей на протяжении 3–7 суток концентрация СРБ снижается в 2 раза в сравнении с показателями пациентов, его не получавших, что вполне согласуется с нашим исследованием [21].

Такие данные могут свидетельствовать в пользу слабого влияния дексаметазона в низких дозах на степень выраженности воспаления при длительном применении. Применение 10 нг/мл дексаметазона оказывает более выраженный эффект; на 10-е сутки концентрация СРБ возрастает, оставаясь ниже, чем в группе с ожирением и артрозом. Увеличение дозы действующего вещества до 100 нг/мл приводит к более значительному снижению показателя СРБ: на 10-е сутки показатель был выше только при сравнении с группой контроля. Длительное введение дексаметазона не оказывает выраженного положительного действия на степень выраженности воспаления [22]. По данным литературы, длительное применение глюкокортикостероидов способно приводить к апоптозу хондроцитов и прогрессированию артроза с риском развития стероидного диабета, вызывать возможное снижение количества рецепторного аппарата к дексаметазону [23]. Напротив, при лечении COVID-19 дексаметазон показал хороший результат именно при длительном введении, на протяжении 18–19 дней. Эффективность вводимой концентрации дексаметазона прослеживается в снижении уровня СРБ как маркера воспалительного процесса с 65,49 ± 71,4 мг/л при поступлении в стационар до 9,52 ± 12,81 при выписке; средний срок лечения при этом составлял 19,4 ± 9,0 дней [24]. При введении высоких доз дексаметазона с целью лечения пневмонии на протяжении 10 дней летальность наблюдалась у девяти из 98 пациентов, концентрация СРБ снижалась со 132 мг/л до 7,3 мг/л [25].

В организме nСРБ является более стабильной формой, состоящей из пяти одинаковых субъединиц, выполняет противовоспалительную функцию и участвует в поддержании гомеостаза [9]. На фоне ожирения, сочетанного с артрозом, его концентрация возрастала на третьи сутки, что говорит о противовоспалительном эффекте белка, после чего она снижалась на пятые и 10-е сутки. Поскольку дексаметазон даже в небольшой дозе оказывал выраженный противовоспалительный эффект, при введении 1 нг/мл на сутки концентрация nСРБ возрастала, после чего снижалась. Это может свидетельствовать в пользу угнетения воспалительного процесса, вызываемого артрозом и ожирением, в остальных группах концентрация nСРБ оставалась на стабильно высоком уровне, по отношению к группе с ожирением, сочетанным с артрозом, поскольку воспаление угнетается за счет действующего вещества и имеет невыраженные колебания в зависимости от дозы.

В организме mСРБ приводит к развитию и прогрессированию воспаления, за счет локального накопления в тканях создает угрозу развития кардиоваскулярной патологии, а также развития риска нейродегенеративных процессов [7, 11, 12]. При ожирении в сочетании с артрозом его концентрация нарастает на протяжении всего периода эксперимента, что указывает на прогрессирование воспаления. На фоне введения 1 нг/мл дексаметазона концентрация mСРБ снижается на третьи и пятые сутки и резко возрастает на 10-е сутки, что дает возможность предполагать неэффективность длительного введения дексаметазона. Подобное наблюдается и при введении 10 и 100 нг/мл дексаметазона, проявляясь в виде снижения концентрации мономерной формы СРБ на третьи и пятые сутки с последующим ее возрастанием на 10-е сутки. В высоких дозах дексаметазон демонстрирует эффективность при коротком однократном введении. Так введение 1 мг/кг дексаметазона у пациентов с индексом массы 26 приводит к снижению концентрации СРБ в послеоперационном периоде при вмешательстве на внутренних органах брюшной полости [26].

После проведения тотального эндопротезирования сустава дексаметазон в высокой дозе не приводит к значительным изменениям концентрации СРБ [27]. Возможно, такой вариативный эффект может быть связан с различным влиянием дексаметазона на воспаление тканей внутренних органов и суставов.

ВЫВОДЫ

Сочетание экспериментального ожирения и артроза приводит к стойкому системному воспалительному ответу, при котором наблюдается увеличение концентрации СРБ. Подобные изменения происходят на фоне постоянного истощения нативной противовоспалительной пентамерной формы nСРБ и роста провоспалительной мономерной формы mСРБ. Введение дексаметазона в дозе 1 нг/мл приводит к краткосрочному противовоспалительному эффекту на третьи сутки, после чего эффективность снижается. В дозе 10 нг/мл дексаметазон проявляет эффективность на протяжении пяти суток, затем она уменьшается. К 10-м суткам эффективность всех доз дексаметазона снижается, что проявляется в росте mСРБ. Перспектива дальнейшего исследования состоит в изучении более длительного действия дексаметазона и других его доз на концентрацию СРБ при воспалении с оценкой отсроченных и поздних эффектов.