ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
МЕТОД
Тканевая хемилюминесценция как метод оценки супероксид радикал-продуцирующей способности митохондрий
Информация об авторах
Кафедра медицинской биофизики, факультет фундаментальной медицины,Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва
Для корреспонденции: Джатдоева Айшат Абдрахмановна
Ломоносовский пр-т, д. 31, корп. 5, г. Москва, 119192; moc.liamg@jdtahsya
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 14-15-00375).
Благодарности: авторы благодарят Алексея Гришина, студента кафедры физиологии МГУ имени М. В. Ломоносова, за помощь в подборе состава газовых смесей.
Статья получена: 01.10.2015
Статья принята к печати: 09.12.2015
Опубликовано online: 05.01.2017
|
Митохондрии, апоптоз и болезни человека
Митохондрии являются важной органеллой клетки: они выполняют множество функций, но прежде всего вырабатывают энергию путем окислительного фосфорилирования и регулируют процессы роста, старения и апоптоза клетки. Число описанных в научной литературе болезней митохондриального происхождения приближается к 400, и митохондриальная медицина получила развитие как самостоятельное научное направление.
Нарушение энергообеспечения клетки может быть причиной нейромышечных патологий [1]. Особо чувствительной к снижению энергетического обмена является нервная ткань [2]. Однако энергетическая дисфункция — возможно, не самое опасное нарушение работы митохондрий. Митохондрии являются главным источником образования внутриклеточных свободных радикалов [3], прежде всего — супероксид анион-радикала (САР). Накопление САР и его производных — активных форм кислорода — приводит к митохондриальному окислительному стрессу. Это чрезвычайно опасно для клетки, так как может запустить процесс ее запрограммированной гибели — апоптоз [4]. Существует два основных пути запуска апоптоза: внешний (рецепторный) и внутренний (митохондриальный) [5], — и большинство форм апоптоза у позвоночных реализуется по второму пути [6].
Показано, что окислительный стресс в митохондриях является этиологическим фактором или звеном патогенеза многих заболеваний: нейродегенеративных (болезнь Паркинсона [7], болезнь Альцгеймера [8], рассеянный склероз [9], боковой амиотрофический склероз и др.), нейроофтальмопатий, гломерулонефритов [10], инсулинорезистентности, — а также старения. Повышенный риск ряда заболеваний (рак, диабет [11], кардиоваскулярные болезни) связывают с полиморфизмом антиоксидантных ферментов, марганец-зависимой супероксиддисмутазы (Mn-СОД) и глутатион-пероксидазы, которые купируют последствия митохондриального окислительного стресса. Также выявлена важнейшая роль дисфункции митохондрий в развитии раковых заболеваний [5].
Нарушение работы митохондрий и накопление свободных радикалов в клетке происходят под влиянием неблагоприятных факторов. Один из таких факторов — генные мутации. В отличие от других органелл митохондрии имеют собственную дезоксирибонуклеиновую кислоту (мтДНК), которая кодирует некоторые субъединицы комплексов окислительного фосфорилирования. Именно мутации в мтДНК, а также генах ядерной ДНК, кодирующих митохондриальные белки, вызывают развитие наследственной атрофии зрительных нервов Лебера [12], синдрома NARP (нейропатия, атаксия, пигментный ретинит) [13], синдрома MERRF (миоклонус эпилепсия с «рваными» красными волокнами в скелетных мышцах), синдрома MELAS (митохондриальная энцефаломиопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные эпизоды) [14], синдрома Кернса–Сейра (пигментный ретинит, наружная офтальмоплегия, блокада сердца, птоз, мозжечковый синдром) [15], синдрома Пирсона (поражение костного мозга, панкреатическая и печеночная дисфункции) [16] и др.
Митохондрии как источники свободных радикалов при апоптозе
Во время аэробного дыхания происходит утечка 1–2 % электронов с электронной транспортной цепи митохондрий, которые восстанавливают кислород с образованием супероксид анион-радикала [17]. Основными центрами продукции активных форм кислорода являются комплекс I и комплекс III дыхательной цепи. В норме антиоксидантная система организма нейтрализует образующиеся свободные радикалы. Однако под влиянием неблагоприятных факторов уровень содержания свободных радикалов возрастает во много раз.
Сперва в митохондриях происходит блокирование переноса электронов [18], что приводит к угнетению дыхания, снижению синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) и, самое главное, к увеличению образования митохондриями супероксид анион-радикала [19]. Затем под действием митохондриальной супероксиддисмутазы образуется пероксид водорода в матриксе. В дальнейшем происходит образование комплекса специфического митохондриального фосфолипида — кардиолипина с цитохромом c [20]. Как было показано в модельных экспериментах, этот комплекс обладает пероксидазной активностью [4] и в присутствии пероксида водорода окисляет органические субстраты, включая полиненасыщенные жирные кислоты, в результате чего образуются свободные радикалы липидов [21] и запускается цепная реакция липопероксидации [22]. Липопероксидация в мембранах митохондрий приводит к набуханию матрикса [23], разрыву наружной мембраны или по меньшей мере образованию в ней больших пор, через которые из митохондрий выходит цитохром c. Появление цитохрома с в цитоплазме приводит к запуску реакций апоптоза [24].
Методы оценки радикал-продуцирующей способности митохондрий в живой ткани
Для оценки радикал-продуцирующей способности митохондрий в живой ткани применяют различные методы, в том числе метод хемилюминесценции (ХЛ) [25]. ХЛ позволяет регистрировать не концентрацию радикалов (которая в живых системах крайне низкая), а скорость реакции, в которой они участвуют. Недавно был разработан метод регистрации тканевой ХЛ с использованием фотоумножителя [26], имеющий ряд преимуществ перед весьма трудоемким и дорогостоящим методом японских исследователей с использованием охлаждаемой фотоматрицы [27]. Предложенный метод оценки радикал-продуцирующей способности ткани [26] заключается в том, что в условиях термостатирования (37 °С) в систему, содержащую исследуемые образцы ткани и активатор люцигенин, подают через капилляр слабый поток воздуха от перистальтического насоса (рис. 1А). Подобранные уровень расположения капилляра и скорость аэрации позволяют регистрировать образование супероксид анион-радикалов в переживающей ткани. Однако в исследовании [26] было показано нарастание ХЛ во времени, которое затрудняет анализ полученных кривых. Возможно, дополнительное усиление ХЛ связанно с увеличением рН раствора среды во времени, а не с дополнительным образованием радикалов в ткани. Как известно, интенсивность свечения люцигенина зависит от водородного показателя среды [28]. Повышение рН среды способствует образованию катиона люцигенина, который и взаимодействует с САР с последующим испус канием кванта света.
Наше исследование включало два эксперимента. Целью первого эксперимента явилось определение оптимального состава газовой смеси для поддержания постоянного уровня рН при аэрации опытных образцов с использованием изучаемого метода, второго — оценка уровня образования супероксид анион-радикалов при гипоксии и паркинсонизме в образцах тканей сердца крыс и мозга мышей изучаемым методом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Схема установки
В опытах использовали хемилюминометр SmartLum–100 («ДИСофт», Россия), дополнительно оснащенный перистальтическим насосом Pumps 323 (Watson Marlow, Великобритания). К насосу были подключены резервуары, содержащие различные газовые смеси. Схема установки приведена на рис. 1А.
Расстояние от дна кюветы до кончика капилляра (l), по которому поступал газ в рабочий раствор, составляло 1,5 см (рис. 1Б). Это способствовало быстрой диффузии газа к исследуемому образцу без нарушения его положения в пространстве. Срезы располагали на дне кюветы таким образом, чтобы сторона образца с наибольшей площадью была обращена к детектору (рис. 1Б).
Животные и манипуляции над ними
В исследовании использовали сердце самцов белых крыс линии Wistar в возрасте 2–3 мес. и мозг мышей линии С57BL/6 в возрасте 2,5–3 мес. При работе с животными соблюдали регламент, установленный Приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 г. No 755. Эксперименты были одобрены Комиссией по биоэтике МГУ имени М. В. Ломоносова. Животных содержали в условиях вивария, по 6 особей в стандартных клетках Т4 с регулируемым освещением (12 часов — ночь, 12 часов — день), со свободным доступом к кормам и воде.
Крысы. Все манипуляции по извлечению органов производили на глубоко наркотизированных хлоралгидратом животных (400 мг/кг). После извлечения органы промывали в физиологическом растворе (NaCl 0,9 %). С помощью острого лезвия отрезали небольшой прямоугольный кусочек левого желудочка, не более 5 x 5 x 5 мм, и промывали его.
Мыши. Для моделирования ранней симптомной стадии паркинсонизма мышам четырехкратно с двухчасовым интервалом между инъекциями вводили подкожно пронейротоксин 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП; Sigma, США) в дозе 12 мг/кг [29]. Контрольным животным по такой же схеме вводили физиологический раствор (NaCl 0,9 %). Через 12 ч после введения последней дозы пронейротоксина мышей декапитировали (без наркоза) и выделяли мозг. С помощью вибратома (Vibratome 1000 Plus, США) получали тонкие фронтальные срезы толщиной 300 мкм. В срезах выделяли блоки ткани, содержащие черную субстанцию (место локализации тел дофаминергических нейронов) и стриатум (область проекции аксонов дофаминергических нейронов).
Для сохранения жизнеспособности тканей все манипуляции с ними проводили в охлажденном растворе Кребса–Рингера состава: 6,96 г NaCl, 0,36 г KCl, 0,22 г CaCl2, 0,33 г MgSO4•H2O, 2,1 г NaHCO3, 1,82 г D-глюкозы, 4,8 г HEPES, 1,0 л дистиллированной воды (с последующим доведением рН раствора до 7,4). В экспериментах использовали только свежеприготовленный раствор.
Определение оптимального состава газовой смеси для аэрации
Определение оптимального состава газовой смеси для аэрации проводили на образцах ткани сердца крыс. Для этого образец ткани помещали в кювету, содержащую 90 мкМ люцигенина в растворе Кребса–Рингера. Люцигенин был использован в качестве селективного зонда на САР. Хемилюминесценцию образцов ткани регистрировали в течение 125 мин в условиях термостатирования (37 °С) и аэрации при скорости вращения ротора насоса 6 об/мин. Такая скорость подачи газовой смеси позволяла сохранять достаточный темп насыщения раствора газами, перемешивать раствор и омывать образец, сохраняя его неподвижным на дне кюветы. Каждые 20 мин измеряли рН раствора.
Были изучены три газовых смеси следующего состава:
- атмосферный воздух: 21 % O2, 0,03 % CO2, 78 % N2,
- карбоген: 95 % O2, 5 % CO2,
- выдыхаемый человеком воздух: 15 % O2, 4 % CO2, 74 % N2, другие — 7 %.
Регистрация хемилюминесценции ткани при имитации гипоксии и при паркинсонизме
Основываясь на результатах эксперимента по определению оптимального состава газовой смеси для аэрации, приготовили технические смеси нового состава, которые использовали для регистрации хемилюминесценции при моделировании гипоксии и паркинсонизма:
- кислородсодержащая газовая смесь (КГС): 15 % O2, 5 % CO2, 80 % N2,
- бескислородная газовая смесь (БГС): 5 % CO2, 95 % N2.
Моделирование гипоксии. Исследование проводили на образцах ткани сердца крыс с использованием трех моделей гипоксии. Для каждой модели регистрировали ХЛ одного образца. Для создания гипоксических условий через раствор, содержащий кусочек ткани, пропускали бескислородную газовую смесь, а для создания условий реоксигенации — кислородсодержащую газовую смесь. Было исследовано три модели гипоксии.
Модель 1 — гипоксия в течение 15 мин. Первые 30 мин регистрировали ХЛ при аэрации КГС, затем 15 мин — при аэрации БГС (гипоксия), после этого возобновляли аэрацию КГС в течение 30 мин (реоксигенация). Цикл гипоксии повторяли шесть раз. Общее время регистрации ХЛ составляло 400 мин.
Модель 2 — гипоксия в течение 150 мин. Первые 30 мин регистрировали ХЛ при аэрации КГС, затем 150 мин — при аэрации БГС (гипоксия), после этого возобновляли аэрацию КГС в течение 30 мин (реоксигенация). Циклы гипоксии повторяли дважды. Общее время регистрации ХЛ составляло 325 мин.
Модель 3 — гипоксия в течение 240 мин. Первые 30 мин регистрировали ХЛ при аэрации КГС, затем 240 мин — при аэрации БГС (гипоксия), после этого возобновляли аэрацию КГС в течение 30 мин (реоксигенация). Общее время регистрации ХЛ составляло 350 мин.
Изменение образования радикалов оценивали по параметру S/S0, где S — площадь под кривой ХЛ за 30 мин реоксигенации в конце эксперимента с моделью (отражает количество образовавшихся радикалов), а S0 — площадь под кривой ХЛ за первые 30 мин регистрации свечения (отражает начальное количество радикалов). Единица измерения S — (имп/с) × мин.
Моделирование паркинсонизма. Исследование проводили на срезах мозга мышей. Регистрировали ХЛ трех срезов ткани области черной субстанции и трех срезов области стриатума мозга (как опытных, так и контрольных животных). Хемилюминесценцию регистрировали в течение 25 минут в условиях аэрации кислородсодержащей га- зовой смесью. Образование САР оценивали по параметру S/S0 (за 20 мин аэрации), где S — площадь под кривой ХЛ ткани экспериментальных животных и S0 — площадь под кривой ХЛ ткани контрольных животных.
Статистическую обработку данных проводили, исполь- зуя программные пакеты Statistica 7.0 и MS Office Excel 2010. Результаты представлены в виде среднего значения и среднего квадратичного отклонения. Достоверность различия между группами определяли с помощью критерия Манна–Уитни. Различия признавали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Зависимость pH от состава газовой смеси для аэрации
Было проведено исследование влияния состава трех разных газовых смесей на рН раствора, содержащего образец ткани сердца. В условиях аэрации атмосферным воздухом происходило увеличение pH с 7,4 до 9,0 (рис. 2А). Изменение водородного показателя влияло на интенсивность люцигенин-зависимой хемилюминесценции. Зарегистрированные изменения кинетики кривой ХЛ являлись прямым следствием защелачивания среды: динамика развития ХЛ и увеличение рН совпадали во времени (рис. 2).
Наоборот, аэрация смесями газов с повышенным содержанием CO2 (карбоген и выдыхаемый воздух) не приводила к значимому изменению рН среды в ходе эксперимента. Свечение ХЛ оставалось на постоянном уровне (рис. 2Б).
Таким образом, содержание в газовых смесях СО2 на уровне 4–5 % является достаточным для удержания рН на уровне физиологической нормы (7,4). Поэтому для дальнейшей регистрации ХЛ образцов тканей была подготовлена техническая смесь газов, в которой процентное содержание основных компонентов было аналогично выдыхаемому воздуху, но отсутствовали примесные газы (КГС). Для создания условий гипоксии была использована бескислородная газовая смесь с высоким содержанием СО2 (БГС).
Образование свободных радикалов в тканях сердца крыс при гипоксии
В условиях повторяющихся циклов гипоксии длительностью 15 мин значимый рост образования супероксид анион-радикала зафиксировано только в момент реоксигенации на 300-й минуте эксперимента: количество САР увеличилось в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем. В условиях более длительных циклов гипоксии (150 и 240 мин) также наблюдали достоверное увеличение ХЛ в конце эксперимента, при этом образование САР возросло в 1,8 и 2,0 раза соответственно (рис. 3, табл. 1).
Образование свободных радикалов в тканях мозга мышей при паркинсонизме
Смоделированная стадия паркинсонизма у мышей соответствует ранней симптомной стадии у людей, и на этой стадии у животных было зафиксировано увеличение образования супероксид анион-радикала. В случае со срезами ткани мозга, содержащей стриатум, произошло достоверное увеличение продукции САР в 1,7 раза. Для срезов ткани мозга, содержащей черную субстанцию, значимых различий между опытными и контрольными животными не наблюдалось, но была выявлена тенденция к увеличению образования радикалов в 1,3 раза (рис. 4, табл. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Люцигенин-активированная хемилюминесценция является перспективным инструментом для измерения уровня образования САР и оценки нарушений, происходящих в отдельных клетках и ткани в целом. Однако ее применение требует поддержания постоянства pH среды, равного 7,4. При аэрации образцов атмосферным воздухом происходит изменение водородного показателя, и объема буферной системы Кребса–Рингера (2 мл на 1 мг ткани) оказывается недостаточно для стабилизации pH на уровне 7,4. С одной стороны, использование проточной системы может помочь решить выявленную проблему за счет постоянного обновления раствора, омывающего ткань. Но необходимое техническое дооснащение установки и увеличение расхода реактивов делают этот подход трудноосуществимым. С другой стороны, возможность изменения состава газовой смеси для аэрации раствора, а именно: увеличение содержания СО2, — является более простым и доступным способом. Насыщение омывающего раствора углекислотой позволяет удерживать рН на постоянном уровне за счет растворения газа в воде и установления равновесия:
СО2 + Н2О ↔ Н2СО3 ↔ Н+ + НСО2 ↔ 2Н+ + СО2-
Нами было показано, что аэрация газовой смесью, содержащей 4–5 % углекислого газа, является оптимальной для использования метода.
Известно, что ключевую роль в инфарктных состояниях человека играет цикл гипоксия/реоксигенация. При этом наиболее сильные повреждения ткань получает при резком увеличении образования активных форм кислорода и гибнет после возобновления кровоснабжения. Оценка уровня образования супероксид анион-радикала при различной продолжительности гипоксии показала, что циклическое воздействие коротких периодов гипоксии приводило к меньшей продукции свободных радикалов по сравнению с более длительными периодами гипоксии.
Регистрация люцигенин-активированной ХЛ в условиях аэрации образца ткани кислородсодержащей газовой смесью показала увеличение уровня образования САР в ткани мозга уже через 12 ч после введения последней дозы пронейротоксина. Это свидетельствует о том, что увеличение продукции свободных радикалов, приводящее к дегенерации нервных клеток, происходит задолго до проявления первых клинических симптомов патологии.
ВЫВОДЫ
Оптимизированы условия использования метода люцигенин-активированной хемилюминесценции для оценки радикал-продуцирующей способности биологических тканей. Подобраны составы кислородсодержащей и бескислородной газовых смесей для аэрации опытного образца, позволяющие поддерживать pH омывающего образец раствора на уровне 7,4.
Продемонстрирована возможность использования метода для оценки уровня образования радикалов при гипоксии и паркинсонизме. Показано достоверное увеличение уровня образования радикалов в ткани сердца для циклов гипоксии длительностью 150 мин — в 1,8 раза, 240 мин — в 2,0 раза. При паркинсонизме уровень образования САР в областях стриатума и черной субстанции через 12 ч после введения последней дозы пронейротоксина оказался выше в 1,7 и 1,3 раза соответственно в сравнении с контролем.