Трансляционная медицина — современное направление развития молекулярной медицины, предусматривающее тесную связь и трансляцию фундаментальных исследований в сферу практического применения в медицине. Изоферменты цитохрома Р450 (CYP) — суперсемейство гем-содержащих монооксигеназ, осуществляющих I фазу биотрансформации ксенобиотиков, в том числе около 75 % лекарственных препаратов, а также метаболизм эндогенных физиологически активных соединений [1, 2]. Цитохром Р450-зависимый метаболизм лекарственных препаратов — главная причина различий в фармакокинетике и индивидуальной реакции на фармакотерапию. Среди 57 изоферментов цитохрома Р450 человека 5 основных форм (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4/5) осуществляют примерно 95 % реакций биотрансформации [3, 4, 5]. Изоферменты цитохрома P450 катализируют различные химические реакции: гидроксилирование, O-, S-, N-деалкилирование, эпоксидирование, сульфоокисление, дезаминирование, дегалогенирование и др. Так как цитохромы Р450 имеют широкую субстратную специфичность, исследование взаимодействия лекарственных препаратов в цитохром Р450-системах имеет особую клиническую значимость [6, 7, 8]. Для доклинической оценки лекарственной интерференции и скорости биотрансформации лекарственных средств в системах in vitro разработаны методы электроанализа клинически значимых форм цитохромов Р450 [9, 10, 11, 12].

В каталитическом цикле цитохромов Р450 участвуют белки редокс-партнеры цитохром Р450 редуктаза, цитохром b₅, а донором электронов является никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН). Для проявления каталитической активности необходимо участие всех компонентов сложной цепи переноса электронов. Анализ каталитической активности цитохромов Р450 электрохимическими методами не требует белков редокс-партнеров и доноров электронов НАДФН (рис. 1). Электроанализ цитохромов Р450 является модельной неинвазивной системой в исследовании механизма биотрансформации ксенобиотиков, лекарственной интерференции. Электрохимические подходы перспективны для исследования фермент-субстратных взаимодействий вследствие высокой чувствительности [13]. В результате каталитической цитохром Р450-зависимой реакции в электрохимической системе регистрируется катодный (восстановительный) ток, увеличение которого соответствует дополнительному потоку электронов к органическому субстрату (лекарственному препарату). Катодный ток (имеющий отрицательное значение в отличие от анодных процессов с положительным значением тока) является мерой электрокаталитической активности фермента. Исследование электроаналитических характеристик цитохромов Р450 является важным этапом в поиске новых субстратов/ингибиторов этих гемопротеинов в качестве лекарственных препаратов, а также при изучении лекарственной интерференции [14, 15].

Разработанный нами метод электроанализа каталитической активности цитохромов Р450 позволяет использовать систему электрод/фермент на стадии доклинических испытаний как неинвазивный инструмент оценки каталитических функций цитохромов Р450 с целью поиска новых субстратов, ингибиторов, модуляторов этих ферментов [18].

Несмотря на значительные достижения медицины в вопросах диагностики и лечения, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) продолжают лидировать в структуре заболеваемости и смертности наиболее трудоспособной части населения большинства экономически развитых стран, в том числе и России. Разрабатываются новые стратегии лечения ССЗ. Когда была выявлена взаимосвязь свободных жирных кислот (ЖК) с риском смертности от сердечно-сосудистой патологии атеросклеротического генеза, начались исследования ингибиторов парциального β-окисления ЖК pFOX (partial fatty acid oxidation inhibitors) [19]. Метаболические средства, повышающие эффективность использования кислорода, переключающие метаболизм на более экономные пути, защищающие ткани от последствий оксидативного стресса при реперфузии, должны обладать антиишемическим эффектом за счет влияния на обменные процессы в миокарде [20].

В середине 1970-х гг. в Институте органического синтеза Латвии был синтезирован триметилгидразиния пропионат (мельдоний), который ограничивает транспорт ЖК через мембраны [21]. Показано, что мельдоний способен обеспечить замедление скорости β-окисления ЖК в митохондриях и ограничение транспорта ЖК через клеточные мембраны, что актуально в условиях избыточного накопления ЖК [22]. Мельдоний обеспечивает процессы ишемического прекондиционирования за счет снижения скорости трансмембранного транспорта ЖК, ацил-СоА и ацилкарнитина в клетке, уменьшения потребления кислорода, замедления β-окисления ЖК и повышения скорости биосинтеза γ-бутиробетаина; индуцирует биосинтез NO в эндотелии кровеносных сосудов, уменьшая сопротивление периферических кровеносных сосудов и агрегацию тромбоцитов, увеличивает эластичность мембран эритроцитов; позволяет минимизировать метаболический ацидоз, развивающийся в результате активации анаэробного гликолиза и накопления молочной кислоты. Мельдоний используется в составе комплексной терапии сердечно-сосудистых заболеваний; при пониженной работоспособности, физическом перенапряжении, в послеоперационный период для ускорения реабилитации; при синдроме абстиненции при хроническом алкоголизме [23, 24].

Несмотря на активное использование мельдония в клинике как метаболического антигипоксантного средства в составе комбинированной терапии, его влияние на каталитические функции цитохромов Р450 как основных ферментов I фазы биотрансформации ксенобиотиков не исследовалось. При проведении комбинированной фармакотерапии необходимо учитывать, что лекарственная интерференция может иметь как положительные, так и отрицательные последствия для пациента. В связи с этим особое значение приобретает информация о наличии субстратных свойств, возможности ингибирования или индукции изоферментов цитохрома Р450 лекарственными средствами, которые используются преимущественно в составе комплексной терапии.

Ранее нами электрохимическими методами были исследованы витамины-антиоксиданты (витамины С, А и Е), а также витаминоподобные вещества (таурин и коэнзим Q), которые обладали положительным влиянием на электрокаталитическую активность цитохрома Р450 3А4 [18, 25]. В связи с этим цель работы состояла в изучении влияния мельдония на каталитические функции цитохрома Р450 3А4 — изофермента, участвующего в биотрансформации более 50 % лекарственных препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Электрохимические исследования проводили с помощью потенциостата/гальваностата Autolab PGSTAT 12 (Metrohm Autolab, Нидерланды), снабженного программным обеспечением GPES (версия 4.9.7). Все измерения проводили при комнатной температуре. Электрохимические исследования цитохрома Р450 3A4 проводили в 0,1 М калий-фосфатном буфере, содержащем 0,05 М NaCl, рН 7,4. в работе использовали трехконтактные электроды, полученные методом трафаретной печати (ООО «КолорЭлектроникс», Россия); с графитовыми рабочим и вспомогательным электродами и хлорсеребряным электродом сравнения. Диаметр рабочего электрода 2 мм. Все потенциалы приведены относительно хлорсеребряного Ag/AgCl электрода сравнения. Спектральные измерения проводили с помощью спектрофотометра Cary 100 UV-Vis (Agilent Technologies, США), снабженного программным обеспечением Cary WinUV.

Цикловольтамперограммы регистрировали при скорости развертки потенциала от 10 до 100 мВ/с. Параметры, используемые при исследовании катодной квадратно-волновой вольтамперометрии (КВВА): начальный потенциал +100 мВ, конечный потенциал −600 мВ, шаг потенциала 5 мВ, амплитуда 20 мВ, частота от 10 до 100 Гц.

В работе использовали следующие реактивы: дидодецилдиметиламмония бромид (ДДАБ) и эритромицин фирмы Sigma-Aldrich (США), мельдоний фирмы Grindeks (Латвия), уксусная кислота, аммония ацетат и ацетилацетон фирмы ООО «Спектр-Хим». Препарат рекомбинантного Р450 3А4 человека (182 мкM в 550 мM калий-фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,2 % CHAPS, 1 мМ дитиотреитол и 20 % глицерин) был получен генно-инженерным способом, выделен и охарактеризован в Институте биоорганической химии (Минск, Республика Беларусь). Концентрация фермента определялась спектрофотометрически по образованию комплекса восстановленной формы с углерода монооксидом, используя коэффициент поглощения ε_450–490 = 91 мМ⁻¹см⁻¹ [26].

На поверхность рабочего графитового электрода наносили 1 мкл 0,1 М ДДАБ в хлороформе, после испарения хлороформа (10 мин) наносили 1 мкл 18,2 мкМ цитохрома Р450 3А4. Электроды оставляли на 12 ч при +4 °С во влажной камере, предотвращающей полное высыхание электродов.

N-деметилазную электрокаталитическую активность цитохрома Р450 3А4 по отношению к эритромицину определяли по накоплению одного из продуктов реакции — формальдегида, который образует окрашенное соединение с реактивом Nash (4 М ацетат аммония, 0,1 М ледяная уксусная кислота, 0,04 М ацетилацетон), коэффициент поглощения ε₄₁₂ = 4 мМ⁻¹см⁻¹ [27, 28]. Ферментный электрод помещали в электрохимическую ячейку с 1 мл электролитного буфера, содержащего 100 мкМ эритромицина. Электролиз проводили в течение 20 мин при контролируемом потенциале рабочего электрода −0,5 В. После проведения электролиза инкубационную смесь смешивали в соотношении 1 : 1 с реактивом Nash и инкубировали при +37 °С в течение 30 мин для развития окраски. Концентрацию формальдегида, образовавшегося в процессе электрокатализа, определяли спектрально.

На рисунках 3, 4 и в таблице приведены средние значения ± стандартное отклонение из 3–5 независимых опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мельдоний относится к классу антигипоксантных средств и используется в составе комбинированной фармакотерапии для различных патологических состояний. Влияние мельдония на каталитические функции цитохрома Р450 3А4, иммобилизованного на электроде, полученном методом трафаретной печати (ПГЭ), модифицированном дидодецилдиметиламмония бромидом (ПГЭ/ДДАБ), исследовали методом циклической вольтамперометрии, регистрируя максимальное значение катодного пика. Как следует из рис. 2, мельдоний не влияет на электрохимическое восстановление цитохрома Р450 3А4, не вызывает увеличения или снижения восстановительного тока цитохрома Р450 3А4, т. е. не проявляет как субстратных, так и ингибиторных свойств по отношению к ферменту. Кроме того, проведенный нами спектральный анализ связывания цитохрома P450 3A4 с мельдонием показал, что мельдоний не вызывает ни I (субстратного), ни II (ингибиторного) типов изменения дифференциального спектра цитохрома Р450 3А4, что согласуется с данными, полученными с помощью электрохимической системы.

Исследование концентрационной зависимости мельдония в диапазоне концентраций 10–75 мкМ также подтвердило отсутствие влияния этого препарата на восстановление цитохрома Р450 3A4 (рис. 3).

Влияние мельдония на цитохром Р450 3А4-зависимую биотрансформацию эритромицина было исследовано при использовании 50 мкМ мельдония и 100 мкМ эритромиина. Реакцию N-деметилирования эритромицина, катализируемую цитохромом Р450 3А4, регистрировали по образованию формальдегида. В результате реакции Ханша формальдегид образует окрашенное производное, которое регистрировали спектрально при 412 нм [26]. Как следует из таблицы, каталитические константы k_cat электрокаталитических цитохром Р450-зависимых реакций имеют близкие значения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эффективность катализа и лекарственную интерференцию оценивали по электрохимической активности иммобилизованного на электроде фермента цитохрома Р450 3А4. Для исследования электроаналитических характеристик были использованы вольтамперные отклики электродов, регистрируемые с помощью циклической вольтамперометрии и квадратно-волновой вольтамперометрии. Субстраты соответствующих форм цитохромов Р450 вызывают существенное повышение каталитического тока (рис. 4, опыты 2, 5), а ингибиторы не изменяют или снижают максимальные амплитуды токов [13]. Итраконазол, ингибитор цитохрома Р450 3А4, не дает увеличение катодного тока при связывании с ферментом, так как не происходит дополнительных процессов переноса электронов в системе (рис. 4, опыт 3).

Ранее было изучено стимулирующее влияние метаболических антиоксидантных препаратов на первую стадию каталитического цикла цитохромов Р450 — восстановление иона железа гема [18]. Исследование лекарственной интерференции при одновременном взаимодействии субстрата цитохрома Р450 3А4 диклофенака и таких лекарственных препаратов, как элькар (L-карнитин), антиоксидантое витаминоподобное вещество тиоктовая (альфа-липоевая) кислота, показало, что эти препараты не влияют на каталитический ток, регистрируемый при взаимодействии диклофенака с ферментом (рис. 4, опыты 6–8). Все лекарственные препараты были исследованы в диапазоне концентраций 10–400 мкМ. Такой диапазон рабочих концентраций был выбран на основе анализа данных по определению электрохимической константы Михаэлиса и из данных о концентрации лекарственных препаратов в плазме крови [29]. Направленная регуляция каталитического цикла цитохрома Р450 может приводить как к снижению скорости метаболизма лекарственных препаратов, так и к активации биотрансформации субстратов [30, 31, 32].

В присутствии 50 мкМ липоевой кислоты в электрохимической системе не наблюдается увеличение электрокаталитической константы P450 3A4-зависимого N-деметилирования эритромицина. Сравнение кинетических параметров позволяет сделать выводы о возможности комбинированной терапии и отсутствии лекарственной интерференции для макролидного антибиотика эритромицина и антиоксидантного метаболического препарата тиоктовой кислоты.

Препарат мельдоний, так же как и L-карнитин, липоевая кислота, не оказывает влияния на электрокаталитическую активность цитохрома Р450 3А4.

ВЫВОДЫ 

С помощью электроанализа проведено исследование лекарственной интерференции типичных субстратов цитохрома Р450 3А4 диклофенака и эритромицина с метаболическими лекарственными препаратами, обладающими антиоксидантными свойствами, а также с антигипоксантным препаратом мельдонием. Препарат мельдоний, так же как и L-карнитин, липоевая кислота, не оказывает влияния на электрокаталитическую активность цитохрома Р450 3А4, в результате чего снижается вероятность возникновения межлекарственного взаимодействия на уровне метаболизма лекарственных препаратов при его использовании в составе комплексной фармакотерапии. Данную информацию необходимо учитывать врачам различного профиля при выборе оптимального препарата с антиоксидантными и антигипоксантными свойствами при назначении его в комплексной терапии коморбидных пациентов.