Дифтерия, несмотря на эффективность вакцинопрофилактики, остается актуальной инфекцией в условиях спорадической заболеваемости и циркуляции возбудителя среди населения. Способность Сorynebacterium diphtheriae вызывать дифтерию ассоциирована с выработкой дифтерийного токсина, последовательность которого кодируется геном tox [1]. Механизм действия дифтерийного токсина основан на АДФ-рибозилировании фактора элонгации 2, что приводит к нарушению синтеза белка в клетках человека [2]. Стоит отметить, что наличие tox в геноме C. diphtheriae не всегда свидетельствует о токсигенности штамма. Отдельного рассмотрения требуют нетоксигенные tox-несущие штаммы (НТТН-штаммы), которые в результате различных мутационных событий потеряли способность синтезировать полноценный токсин [3, 4].

Несмотря на то, что tox является частью генома коринефага, железоопосредованная репрессия дифтерийного токсина осуществляется металлорегуляторным белком DtxR — продуктом хромосомного гена dtxR. Таким образом, транскрипция tox непосредственно связана с гомеостазом железа, низкая концентрация которого индуцирует экспрессию данного гена и, соответственно, синтез дифтерийного токсина [5].

Ген dtxR присутствует у токсигенных и нетоксигенных штаммов [6], что свидетельствует о наличии у него других функций помимо регуляции синтеза дифтерийного токсина. Согласно исследованиям, регулон DtxR может включать еще 20 локусов, в том числе гены, ответственные за усвоение железа. Так, на сегодняшний день известно, что у C. diphtheriae посредством DtxR регулируется синтез сидерофоров и высокоаффинная транспортная система (ciuABCDEFG), транскрипция трех локусов, вовлеченных в работу гем-монооксигеназы (hmuO) [1, 7]. Возможна также дополнительная роль DtxR в регуляции вирулентности [7].

Железо, которое не является легкодоступным элементом, необходимо микроорганизмам в больших количествах. В то же время его избыток приводит к образованию токсичных активных форм кислорода. Уменьшение концентрации свободного железа в организме млекопитающего представляет собой один из эволюционно сложившихся механизмов неспецифической противоинфекционной защиты и достигается путем связывания этого металла специфическими белками [8, 9].

Выживание и распространение патогена в организме хозяина, таким образом, становится зависимым и от его способности усваивать различные ионы металлов из комплексов с белками. Для этого существуют разные системы захвата, кодируемые генами. Экспрессию генов контролируют металлорегуляторные белки — высококонсервативные регуляторы транскрипции [10, 11]. Такие транскрипционные факторы при связывании со специфичным ионом металла претерпевают конформационные изменения, в результате чего происходит активация или угнетение связывания активного центра с оператором регулируемого гена [12].

DtxR является одним из классических представителей металлорегуляторных белков. Кристаллографические исследования показывают, что в неактивном состоянии DtxR представляет собой мономер, который состоит из двух доменов: большой консервативный N-концевой домен содержит два сайта связывания для иона железа, а также мотив спираль–поворот–спираль (helix–turn–helix), способный взаимодействовать с ДНК; малый менее консервативный С-концевой домен имеет сходство с SH3-доменами эукариот. При соединении ионов железа с каждым из сайтов связывания происходит активация репрессора с последующей его димеризацией [13].

Два домена DtxR соединяются между собой посредством богатого пролином пептидного сегмента. При неактивном состоянии репрессора данный участок связывается с SH3-подобным доменом, что приводит к образованию комплекса пролилпептид–SH3 (Pr-SH3). Таким образом происходит стабилизация неактивного состояния репрессора. При активации DtxR посредством специфического связывания железа N-концевым доменом комплекс Pr-SH3 диссоциирует, после чего пролиновый сегмент стабилизирует спирали N-концевого домена, что приводит к димеризации двух субъединиц белка [14].

Учитывая значимость DtxR для C. diphtheriae, молекулярно-генетическое исследование кодирующего его гена dtxR позволит более подробно изучить патогенный потенциал C. diphtheriae, особенности формирования популяции циркулирующих штаммов в эволюционном развитии данного вида, а также оценить возможность использования dtxR в качестве мишени при ПЦР-диагностике дифтерии и инфекций, ассоциированных с нетоксигенными штаммами C. diphtheriae. В связи с этим целью данной работы являлось определение генетического полиморфизма DtxR и последующий анализ структуры популяции штаммов С. diphtheriae, циркулирующих на территории России.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе изучены генотипические свойства 45 штаммов C. diphtheriae, выделенных в 2010–2015 гг. и относящихся к биоварам gravis и mitis. Штаммы C. diphtheriae были присланы в Референс-центр по мониторингу за возбудителями кори, краснухи, эпидемического паротита, коклюша и дифтерии МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского из бактериологических лабораторий лечебно-профилактических организаций и Центров гигиены и эпидемиологии 14 регионов Российской Федерации. Исследованные в работе штаммы выделялись с диагностической, с профилактической целями или по эпидемическим показаниям. В работе использованы коллекционные штаммы: C. diphtheriae 178-01 (ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия), C. diphtheriae PW 8 (НЦЭСМП, Москва, Россия). Помимо этого, в качестве отрицательного контроля для ПЦР в работу включили по 1 штамму C. ulcerans, C. pseudotuberculosis, C. amycolatum, C. glucuronolyticum, C. xerosis, C. afermentans subsp. afermentans, C. afermentans subsp. lipophilum, C. coyleae, C. pseudodiphtheriticum, C. macifaciens, C. simulans, C. durum из рабочей коллекции МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Выделение штаммов С. diphtheriae проводили согласно методическим указаниям «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13. Исследуемый материал засевали на кровяно-теллуритовую среду на основе 2 % сухого питательного агара («Микроген», Россия) с 10 % крови крупного рогатого скота («ЛейТран», Россия) и 0,02 % теллурита калия (ГНЦ ПМБ, Россия) и термостатировали 24–48 ч при 37 °С. Выросшие колонии оценивали по культурально-морфологическим, токсигенным и биохимическим свойствам согласно МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13, а  акже с использованием биохимической тест-системы «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» (НПО «Диагностические системы», Россия).

Хромосомную ДНК выделяли методом кипячения из 24-часовой культуры С. diphtheriae, выросшей на 2 % сухом питательном агаре с добавлением 10 % крови крупного рогатого скота. Петлю суточной культуры суспендировали в 100 мкл деионизованной воды, инкубировали 20 мин при 95 °C и подвергали центрифугированию, полученный супернатант использовали для проведения ПЦР.

ПЦР для амплификации гена dtxR у штаммов С. diphtheriae проводили с использованием одной пары праймеров, охватывающей всю область гена dtxR: ранее предложенного F₁ 5’-GGGACTACAACGCAACAAGAA-3’ [15] и R₁ 5’-TCATCTAATTTCGCCGCCTTTA-3’, подобранного с использованием приложения PerlPrimer v1.1.21 [16]. Видовая специфичность используемых праймеров была проверена путем поиска схожих последовательностей у других видов рода Corynebacterium в базе данных NCBI Nucleotide с помощью программы BLASTn.

Реакционная смесь содержала ПЦР-буфер с 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂, 0,2 мкМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 1 мкл раствора ДНК, 1 е. а. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва) в объеме 50 мкл. Амплификация фрагментов гена выполнялась в автоматическом режиме на приборе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Детекцию результатов амплификации проводили путем электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Наработанные фрагменты нуклеотидных последовательностей подвергали последующему секвенированию в компании «Евроген» (Россия).

Генотипирование штаммов С. diphtheriae проводили с помощью мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) согласно международному протоколу [17] на основе секвенирования фрагментов 7 генов «домашнего хозяйства» (house-keeping genes): atpA (кодирует α-субъединицу АТФ-синтазы), dnaE (кодирует α-субъединицу холофермента ДНК полимеразы III), dnaK (кодирует шаперон Hsp70), fusA (кодирует фактор элонгации G), leuA (кодирует 2-изопропилмалатсинтазу), odhA (кодирует компоненты Е1 и Е2 комплекса 2-оксоглутаратдегидрогеназы) и rpoB (кодирует β-субъединицу РНК-полимеразы) — с последующей идентификацией аллельного профиля каждого штамма.

Результаты секвенирования сопоставляли с опубликованными в международной базе данных генотипов GenBank нуклеотидными последовательностями генов. В качестве референса использовали последовательность dtxR из генома C. diphtheriae PW8 (идентификатор доступа: Genbank NC_016789.1).

Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью алгоритма MUSCLE [18]. Положение полиморфизмов относительно структурных элементов белка анализировали по базе данных PDB. Поиск в базе данных NCBI Nucleotide осуществляли с помощью программы BLASTn. Для идентификации аллелей генов «домашнего хозяйства» C. diphtheriae использовали программное обеспечение международной базы данных PubMLST.  Для оценки мутационного отбора гена dtxR рассчитывали индекс K_a/K_s — отношение количества синонимичных (K_s) и несинонимичных (K_a) замен на сайт последовательности — c использованием метода Nei–Gojobori [19]. Точный критерий Фишера для таблиц сопряженности произвольного размера рассчитывали с использованием алгоритма AS159 [20] с помощью R 3.3.2. Реконструкция филогении осуществлялась методом присоединения соседей (neighbor-joining) на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена dtxR. Для построения филогенетического дерева dtxR исследованных штаммов помимо C. diphtheriae PW8 были использованы нуклеотидные последовательности C. diphtheriae NCTC 13129 и C. diphtheriae 178-01 (идентификаторы доступа: Genbank NC_016789.1, BX248353.1 и NZ_JZUJ01000001.1). Эволюционные расстояния были вычислены с использованием MCL-метода (Maximum Composite Likelihood method) [21] в единицах количества замен оснований, приходящихся на сайт. Эволюционные анализы проводили в программе MEGA7 v.7.0.21 [22].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В поставленных ПЦР ген dtxR выявлен в 100 % случаев как у токсигенных, так и у нетоксигенных штаммов C. diphtheriae. Кроме того, результат ПЦР у всех проверенных штаммов родственных видов в 100 % случаев был отрицательным.

В результате секвенирования образцов и сопоставления с опубликованными в базе данных GenBank последовательностями гена dtxR у изученных 45 штаммов С. diphtheriae нами были выявлены полиморфизмы в 18 позициях гена: 66, 126, 225, 273, 358, 402, 440, 474, 504, 507, 516, 558, 564, 579, 639, 640, 654 и 685 (табл. 1).

Большинство замен нуклеотидов относительно референсной последовательности dtxR оказались синонимичными. В частности, наиболее распространенная однонуклеотидная замена в 273 позиции гена dtxR, обнаруженная у 14 из 45 изученных штаммов C. diphtheriae, не влияла на последовательность белка.

Выявленные полиморфизмы в положениях 440 и 640, приводящие к заменам A147V и L214I соответственно, предположительно, не оказывают значительного влияния на функцию DtxR. В соответствии с трехмерной структурой белка, опубликованной в базе данных PDB (идентификатор 2QQ9), аминокислотная позиция 147 расположена в неструктурированном богатом пролином (Pr) участке. Т. к. этот сегмент участвует в димеризации белка, нельзя исключать, что аминокислотная замена в нем может повлиять на процесс активации DtxR. Замена лейцина на изолейцин в положении 214, находящемся в С-концевом домене белка, предположительно, также не влияет на фолдинг белка, т. к. данные аминокислоты обладают схожими свойствами. Таким образом, выявленные несинонимичные замены с высокой вероятностью не влияют на функцию DtxR.

Многие из вариантов последовательностей были описаны ранее, но нами впервые обнаружен однонуклеотидный полиморфизм в положении 358, также не затрагивающий аминокислотную последовательность. При поиске в базе данных NCBI Nucleotide с помощью программы BLASTn такой вариант замены нуклеотида обнаружен не был.

Полиморфизмы в гене dtxR относительно референсной последовательности у штаммов C. diphtheriae встречались в различных комбинациях. Согласно выявленным сочетаниям нуклеотидных замен исследованные изоляты были разделены на группы (табл. 2).

Более половины (55 %) нуклеотидных последовательностей были отличны от референса. Стоит отметить, что впервые выявленная замена в положении 358 обнаружена у единственного штамма, отнесенного к группе 5, который, кроме того, имеет наибольшее количество замен относительно референсной последовательности, в том числе несинонимичных.

На основании полученного выравнивания последовательностей dtxR была построена дендрограмма филогенетических взаимоотношений (рисунок).

Реконструкция порядка ветвления в значительной степени условна, что связано с большим сходством анализируемых последовательностей и, следовательно, низким уровнем филогенетического сигнала. Дендрограмма филогенетических взаимоотношений изучаемых штаммов представлена без укоренения дерева в связи с невозможностью подобрать подходящую внешнюю группу.

При более подробном изучении были проанализированы соотношения состава групп с такими параметрами, как токсигенность, принадлежность к определенному биовару и сиквенс-тип (ST) по МЛСТ (табл. 3). Данные о принадлежности штаммов НТТН описаны в работе [23].

На основании данных о распределении относительно каждого аллеля dtxR токсигенных и нетоксигенных штаммов различных биоваров был проведен точный тест Фишера. Тест выполняли в таблицах сопряженности 2 × 7 для распределения биовара относительно варианта аллеля dtxR (p = 0,00078) и 3 × 7 для распределения токсигенности относительно варианта аллеля dtxR (p = 2,8∙10⁻⁹). Полученные результаты позволяют утверждать, что распределение таких признаков, как биовар и токсигенность, относительно варианта аллеля dtxR не является случайным, что свидетельствует о наличии филогенетического сигнала, который складывается из взаимосвязей между аллельным вариантом dtxR и биологическими признаками штаммов. Распределение по сиквенс-типу оказалось неоднородным, одинаковые сиквенс-типы в большинстве случаев не встречались в разных группах.

Для оценки мутационного отбора гена dtxR в отношении сделанного выравнивания был произведен расчет индекса К_а/К_s, который составил 0,0526. Полученное значение индекса (К_а/К_s < 1) свидетельствует о выраженном отрицательном отборе, т. е. давление естественного отбора направлено на сохранение существующей последовательности белка [24].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 

Настоящее исследование подтвердило важную роль DtxR в жизнедеятельности С. diphtheriae как токсигенных, так и нетоксигенных штаммов. Обнаруженные полиморфизмы предоставляют новую информацию о современной изменчивости С. diphtheriae на территории России.

Аллельные варианты dtxR на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей изучались ранее при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии [25, 26, 27]. В данной работе в условиях спорадической заболеваемости проводился комплексный анализ нуклеотидных последовательностей в соотнесении их с такими свойствами штамма, как токсигенность, принадлежность к определенному биовару и сиквенс-типу. Такой подход позволил нам на основании полученных данных глубже исследовать структуру популяции современных штаммов С. diphtheriae.

Предположение о значительном влиянии горизонтального переноса генов на формирование популяции С. diphtheriae высказывалось и ранее [17]. Так, описаны механизмы переноса генов, ответственных за антибиотикоустойчивость [28] и факторы патогенности [29]. Состав DtxR-регулона в различных штаммах C. diphtheriae также может изменяться вследствие получения, утраты, частичной делеции генов, оказывающих влияние на обеспечение бактериальной клетки железом и, следовательно, на экспрессию гена tox [1, 30]. Обнаруженная нами взаимосвязь между сиквенс-типом и аллелем dtxR подтверждает ранее высказанную идею, что наличие гомологичной рекомбинантной изменчивости у C. diphtheriae не перекрывает полностью филогенетический сигнал [17]. В то же время проведенный нами анализ структуры популяции C. diphtheriae не показал прямого соответствия между биоваром и аллелем dtxR, что подтверждает отсутствие филогенетической основы данной классификации, обусловленное, предположительно, распространенностью горизонтального переноса генов [31].

Сравнение последовательностей dtxR исследуемых штаммов показало, что менее половины (45 %) из них идентичны референсной. Из 18 полиморфизмов лишь один был выявлен впервые (позиция 358), однако он не затрагивал аминокислотную последовательность. Наиболее распространенным был синонимичный полиморфизм в позиции 273 гена dtxR, который встречался у 14 штаммов C. diphtheriae. В сравнении с другими работами современные штаммы, выделенные на территории РФ, обладают относительно малым разнообразием вариантов первичной структуры DtxR [26, 27].

Стоит отметить, что, хотя dtxR влияет на устойчивость бактерий к оксидативному стрессу, он не является жизненно важным геном для C. diphtheriae в обычных условиях [32], что подтвердил эксперимент с мутантным штаммом с нарушенной функцией DtxR [33]. Тем не менее в изученных последовательностях значимых изменений, которые могли бы привести к синтезу функционально неактивного белка, обнаружено не было. Два повторно выявленных однонуклеотидных полиморфизма действительно приводили к замене аминокислот, однако данные изменения согласно анализу структур, представленных в базе данных PDB, предположительно, не оказали влияния на фолдинг белка. Вероятно, функционально значимые полиморфизмы в гене dtxR снижают приспособленность штаммов к существованию внутри организма млекопитающего, таким образом ограничивая распространение в популяции C. diphtheriae аллелей, приводящих к синтезу дефектного белка. Предположение о том, что DtxR находится под контролем стабилизирующего отбора подтверждает полученное значение индекса К_а/К_s.

Реализация патогенного потенциала C. diphtheriae не всегда связана со способностью штамма к выработке дифтерийного токсина. Так, нетоксигенные штаммы С. diphtheriae в настоящее время стали чаще являться причиной серьезных заболеваний, в частности, эндокардитов [34], артритов [35] и остеомиелитов [36]. Особую опасность нетоксигенные штаммы представляют для иммунокомпрометированных лиц [37, 38]. Данный факт требует расширения подходов к идентификации C. diphtheriae, т. к. существующие методы в большинстве случаев ориентированы на выявление токсигенных штаммов.

Проведенные нами исследования подтвердили наличие dtxR в геноме токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, что позволяет говорить о практической ценности ПЦР-идентификации C. diphtheriae, предложенной ранее [39]. Последующее секвенирование показало преимущественное расположение полиморфизмов в части последовательности, соответствующей С-концевому домену DtxR [15]. Тем не менее варианты замен нуклеотидов, в том числе впервые выявленный, встречались и в других частях гена (позиции 66, 126, 225, 273, 358). Одна из таких замен (позиция 126), обнаруженная у 5 штаммов (группа 2), находилась в области праймера, предложенного для ПЦР-dtxR в нескольких других работах [15, 39]. Апробированная в данном исследовании пара праймеров обладала высокой специфичностью, что подтверждено отсутствием ложноположительных результатов. Таким образом, идентификация C. diphtheriaе методом ПЦР представляет собой перспективное направление в диагностике дифтерии и инфекций, ассоциированных с нетоксигенными штаммами.

ВЫВОДЫ 

В исследовании проведен анализ структуры популяции С. diphtheriae, основанный на вариантах аллеля гена dtxR. Отличными от референсной последовательности dtxR оказались 55 % штаммов, при этом большинство обнаруженных однонуклеотидных полиморфизмов было синонимичным. Отсутствие в исследованиях диких штаммов с нарушенной продукцией DtxR и высокое сходство анализируемых нуклеотидных последовательностей позволяет говорить о высокой активности отрицательного отбора, направленного на поддержание в популяции существующей последовательности репрессора дифтерийного токсина.

Наличие гомологичной рекомбинантной изменчивости действительно снижает уровень филогенетического сигнала, но не перекрывает его полностью. В результате проведенной работы были обнаружены определенные ассоциации между аллельными вариантами dtxR и такими параметрами, как токсигенность и принадлежность к биовару.

Полученные нами результаты позволяют заключить, что dtxR является консервативной последовательностью, и рекомендовать детекцию продуктов ПЦР dtxR как точный метод идентификации токсигенных и в особенности нетоксигенных штаммов C. diphtheriae.