Туберкулез — одно из самых опасных инфекционных заболеваний современности, уносящее ежегодно более 1,4 млн жизней при 10,4 млн новых случаев заболевания [1]. Главной проблемой в лечении туберкулеза является возникновение и широкое распространение форм с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), выражающейся в резистентности возбудителя, Mycobacterium tuberculosis, к самым эффективным и слаботоксичным противотуберкулезным препаратам первого ряда — рифампицину и изониазиду [2], вследствие чего возникает необходимость прибегать к применению более дорогих и токсичных препаратов второго ряда [3]. Частным случаем МЛУ является широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) — МЛУ с дополнительной устойчивостью к одному препарату из группы фторхинолонов и к одному из инъекционных препаратов второго ряда (амикацин, канамицин либо капреомицин) [3]. В последние годы в Иране, Индии и ЮАР фиксировали случаи инфицирования M. tuberculosis, устойчивой ко всем применяемым противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда, т. е. обладающей тотальной лекарственной устойчивостью [4, 5, 6]. Россия и другие страны постсоветского пространства лидируют по уровню распространения туберкулеза с МЛУ [7]: почти в каждом пятом случае из всех случаев впервые диагностируемого туберкулеза и каждом втором — из всех случаев ранее леченного туберкулеза наблюдается МЛУ [1].

В последние 50–60 лет, т. е. в эру антибиотиков, наблюдается направленный отбор лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis. В норме, при частоте случайных мутаций 10^–6–10^–8 на одно клеточное деление, встретить МЛУ-штамм было бы практически невозможно, особенно при комплексной противотуберкулезной терапии. Однако развитию и распространению МЛУ способствует ряд факторов: монотерапия, обусловленная отсутствием запасов необходимых лекарств; неправильные или неэффективные режимы химиотерапии; несоблюдение режима химиотерапии самими пациентами [8]. Свою роль в этом процессе играет и длительное применение одного и того же набора препаратов. Так, за последние 40 лет единственным новым противотуберкулезным препаратом, введеным в клиническую практику, стал бедаквилин [9].

Повышение эффективности лечения туберкулеза зависит от разработки новых лекарственных препаратов, способных воздействовать на новые биомишени, тем самым преодолевая имеющиеся у возбудителя механизмы устойчивости. Перспективными мишенями представляются серин-треониновые протеинкиназы (СТПК) — одни из наиболее универсальных регуляторов жизнеспособности про- и эукариотических клеток. В частности, у микобактерий эти ферменты регулируют такие важные процессы жизнедеятельности клетки, как рост и деление, вирулентность, персистенция и природная лекарственная устойчивость к антибиотикам [10, 11, 12, 13, 14]. Способность ингибировать СТПК с высоким уровнем специфичности была показана для соединений классов аминопиридинов и аминопиримидинов [15], при этом ранее они не применялись в качестве противотуберкулезных препаратов, поэтому к ним нет пула устойчивых мутантов.

Ранее авторами была создана и валидирована тест-система Mycobacterium smegmatis aphVIII+, способная отбирать активные ингибиторы микобактериальных СТПК и, в частности, PknA M. tuberculosis [16]. Целью данной работы являлся отбор активных ингибиторов СТПК среди соединений классов аминопиридинов и аминопиримидинов — кандидатов в противотуберкулезные препараты, способные преодолевать МЛУ и ШЛУ.

Результаты, представленные в статье, являются частью диссертации на соискание степени кандидата биологических наук, защищенной одним из авторов в декабре 2016 г. [17]. Полученные результаты не публиковались ранее, и авторы считают их достаточно значимыми для представления широкой научной общественности путем опубликования в научном журнале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и условия культивирования

В работе использовали штамм Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS и штамм M. smegmatis mc² 155. Для культивирования E. coli использовали среду LB (Amresco, США), а для M. smegmatis — среду Lemco-Tw (5 г/л Lemco Powder, 5 г/л NaCl, 5 г/л бакто-пептона, 0,05 % Tween-80). Культивирование бактерий в жидкой среде проводили в шейкере-инкубаторе Multitron (Infors HT, Швейцария) при 37 ^°С и 250 об/мин. Твердые среды содержали 2,0 % агара. В качестве среды для тестирования соединений в тест-системе использовали среду M290 (триптон-соевый агар, HiMedia, Индия).

Методика тестирования соединений в тест-системе M. smegmatis aphVIII+

Культуру M. smegmatis aphVIII+ разводили в соотношении 1 : 9 : 10 (культура : вода : среда М290) и заливали верхним слоем на чашки Петри с агаризованной средой М290 в качестве нижнего слоя. В среду добавляли селективный антибиотик гигромицин до конечной концентрации 50 мкг/мл, а также тетрациклин в концентрации 10 нг/мл для индукции. После высыхания чашек с культурой на них накладывали бумажные диски либо с исследуемым соединением, либо с канамицином, либо с их комбинацией. Чашки инкубировали при 37 ^°C до появления газона, после чего производили измерение зон ингибирования роста культуры в 3–5 независимых повторах [16]. 

Очистка белков PknA M. tuberculosis и AphVIII

Синтез гена pknA M. tuberculosis с адаптацией кодонов для оптимизации экспрессии в клетках E. coli был проведен компанией «Евроген» (Россия). Ген был синтезирован и клонирован в составе экспрессионного вектора pET-32a. Плазмиды, содержащие гены pknA и aphVIII (pET16b-aphVIII) [18], были трансформированы в штамм E. coli BL21 (DE3) pLysS методом кальциевой трансформации [19]. Экспрессию проводили в течение ночи индукцией изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG; Anatrace, США) в концентрации 1 мМ. Очистку белков проводили при помощи набора Ni-NTA Fast Start Kit (Qiagen, США).

Постановка in vitro киназной реакции

Ингибирующая активность соединений в отношении PknA и APHVIII проверялась в киназной реакции при помощи набора Kinase-Glo Plus Luminiscent Kinase Assay Kit (Promega, США) на рабочей станции Biomek 3000 (Beckman Coulter, США) по методике, описанной Baki и соавт. [20]. Фосфорилирование субстрата оценивали косвенно — по уровню люминисценции остаточной АТФ. В качестве субстрата PknA использовали олигопептид IVDAELTGEIPII, в качестве субстрата APHVIII — канамицин. Реакцию проводили в рабочем растворе: 15 мМ HEPES (pH 7,4), 20 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 0,5 мМ EDTA, 0,02 % Tween-20, 0,1 мг/мл BSA.

Количественный состав реакционной смеси (45 мкл) в киназной реакции с PknA: белок — 3 мкг, АТФ — 5 мкМ, субстрат — 50 мкг.

Количественный состав реакционной смеси (45 мкл) в киназной реакции с APHVIII: белок — 50 нг, АТФ — 10 мкМ, субстрат — 5 мкг.

Анализ цитотоксичности соединений

Анализ цитотоксичности проводили при помощи МТТ-теста на фибробластах эмбриона человека (кожно-мышечная ткань; ФЭЧ-4). О жизнеспособности клеток судили по изменению цвета, происходящему при восстановлении тетразоля в формазан дегидрогеназами митохондрий. Окраску регистрировали на ридере Beckman Coulter DTX 880 Multimode Detector (Beckman Coulter США) при длине волны возбуждения 595 нм. Оптическую плотность в лунках, где клетки инкубировались только со средой (контроль), принимали за 100 % [21].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор активных ингибиторов СТПК в тест-системе M. smegmatis aphVIII+ 

В ранее валидированной тест-системе M. smegmatis aphVIII+ дисковым методом был проведен первичный отбор ингибиторов СТПК из числа 192 соединений класса аминопиридинов и аминопиримидинов.

Тест-система функционирует следующим образом: СТПК MSMEG_5513 фосфорилирует белок APHVIII в клетках M. smegmatis, повышая устойчивость клеток к канамицину; при добавлении активного ингибитора СТПК, действующего на MSMEG_5513, прекращается фосфорилирование APHVIII, снижается его активность и, как следствие, устойчивость бактериальных клеток к канамицину. Собственная антимикобактериальная активность ингибитора обусловливается ингибированием им же СТПК MSMEG_0030 (ортолог PknA M. tuberculosis) — жизненно важного белка для микобактерий, а также, возможно, других биомишеней. В опыте эффект снижения уровня устойчивости к канамицину выражался в увеличении зоны ингибирования роста вокруг диска, содержавшего комбинацию канамицина и активного ингибитора СТПК, относительно диска, содержавшего только канамицин (рис. 1) [16].

Одним из критериев отбора соединений в тест-системе M. smegmatis aphVIII+ является величина их субингибирующей концентрации. Для 53 соединений этот показатель составил до 100 нмоль/диск, в то время как остальные соединения в такой концентрации не проявили антибактериального действия в отношении M. smegmatis. Отобранные соединения были протестированы с помощью тест-системы, при этом ингибитор СТПК LCTA-1389 (11b) [22, 23] взяли в качестве положительного контроля, а неактивный аналог стандартных ингибиторов СТПК класса индолилмалеимидов BisV [24] — в качестве отрицательного.

Достоверное увеличение зоны ингибирования роста бактериальной культуры на твердой питательной среде при совместном действии с канамицином (при сравнении с зоной, образуемой только лишь под действием канамицина) показали 22 соединения, которые исследовали в дальнейшем в качестве ингибиторов микобактериальных СТПК и потенциальных «хит»-соединений (рис. 2): 1f8, 1g8, 1e11, 1g11, 1h11, 1a12, 1c8, 2f4, 2c3, 2c6, 2a3, 2a4, 2a7, 2h11, 2h12, 2d3, 2d11, 2b4, 2b5, 2e12, 2g12, 2h12.

Исследование in vitro ингибирующей активности отобранных соединений в отношении белка PknA M. tuberculosis 

Перечисленные выше соединения тестировали на способность ингибировать СТПК PknA M. tuberculosis in vitro в концентрации 200 мкМ (молярное соотношение ингибитор : мишень — 154 : 1). В качестве положительного и отрицательного контролей также использовали LCTA-1389 (11b) и BisV соответственно. Результаты измерения степени ингибирования киназной реакции представлены на рис. 3. Все соединения проявили ингибирующую активность на уровне положительного контроля или выше, как в случае с двумя соединениями: 1H11 (26,9 ± 6,1 %) и 2G12 (23,2 ± 2,0 %).

Все отобранные соединения также были проверены в том же молярном соотношении (ингибитор : мишень) на способность ингибировать фосфотрансферазную активность APHVIII in vitro — для исключения их неспецифического действия в тест-системе M. smegmatis aphVIII+. Ни одно соединение не проявило такой активности, т. е. их активность в клеточной тест-системе была обусловлена ингибированием именно СТПК M. smegmatis, а не белка APHVIII.

Исследование цитотоксичности отобранных соединений

Отобранные соединения были проверены на цитотоксичность на клетках ФЭЧ-4 и по результатам разделены на три группы: сильно токсичные (< 10 мкг/мл; 1F8, 1G11, 2D11, 2F4, 2C3, 2A3, 2H11); среднетоксичные (10–50 мкг/мл; 1E11, 1G8, 1H11, 2D3, 2E12, 2G12, 2A4, 2A7); слаботоксичные (> 50 мкг/мл; 2C6).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В эпоху развития и распространения лекарственной устойчивости среди штаммов M. tuberculosis разрабатываемые противотуберкулезные препараты должны обладать двумя основными характеристиками: принципиально новым механизмом действия и низкой токсичностью для человека.

Концепция разработки антибактериальных препаратов (в том числе антимикобактериальных), применяемая в течение последних 15 лет, основана на биохимическом мишень-направленном отборе соединений, ингибирующих жизненно важные бактериальные ферменты. Эта концепция имела ограничения применительно к M. tuberculosis в связи с тем, что подавляющее большинство отобранных таким способом соединений не оказывало действия на бактериальную клетку в силу разных причин, например из-за непроницаемости бактериальной клеточной стенки для этих химических соединений [25]. Тогда исследователи вернулись к скринингу соединений на быстрорастущей M. smegmatis, поскольку ее клеточная стенка по проницаемости схожа с таковой у M. tuberculosis, и именно так был отобран бедаквилин [26]. Однако при таком подходе возникает необходимость дальнейшего уточнения биомишени, на которую действует отобранное соединение [27].

Тест-система M. smegmatis aphVIII+ позволяет проводить отбор как по антимикобактериальному действию, так и по мишень-специфичности [16]. Последняя была подтверждена in vitro для отобранных в работе соединений, хотя невозможность определения концентрации полумаксимального ингибирования IC₅₀, вызванная, вероятно, пониженной активностью белка PknA, очищавшегося нами в виде фьюжн-белка с тиоредоксином, является относительным недостатком исследования. Большое количество белка в реакционной смеси делало необходимым анализ максимально растворимой концентрации тестируемых соединений. Однако сравнение ингибирующей активности отобранных соединений с положительным контролем [22, 23] и, в частности, превосхождение его показателей in vitro соединениями 1H11 и 2G12 наряду с ранее показанной ингибирующей активностью соединений классов аминопиридинов и аминопиримидинов в отношении СТПК [15], позволяет говорить о перспективе их использования в качестве эффективных ингибиторов СТПК.

В результате проведенного скрининга нами были отобраны для дальнейшей разработки в качестве потенциальных противотуберкулезных препаратов нового поколения, ингибиторов микобактериальных СТПК, три соединения, проявившие наибольшую активность в тест-системе M. smegmatis aphVIII+, на белке PknA in vitro и наименьшую токсичность на культуре клеток человека (рис. 4). Два соединения с наивысшей активностью (1H11 и 2G12) были отнесены к группе среднетоксичных, но в данной работе был проведен первичный скрининг, позволивший отобрать «хит»-соединения, а их дальнейшая лидерная оптимизация может быть направлена как на повышение их активности, так и на снижение токсичности: активность соединений должна быть проверена непосредственно на M. tuberculosis, должна быть оценена их острая и хроническая токсичность in vitro, а также они должены быть протестированы на панели СТПК человека во избежание их неспецифичного действия.

ВЫВОДЫ

В работе показана принципиальная возможность разработки новых препаратов для борьбы с лекарственно устойчивыми формами туберкулеза на основе аминопиридинов и аминопиримидинов. Отобранные «хит»-соединения (1E11, 2C6, 2G12) требуют дальнейшей проверки на антимикобактериальную активность в отношении M. tuberculosis и лидерной оптимизации с фокусом на возможное повышение их активности и снижение токсичности.