В геноме человека насчитывается 19 817 белок-кодирующих генов и 15 787 генов длинных некодирующих РНК [1]. При этом примерно функции 40 % белок-кодирующих генов неизвестны. Длинные некодирующие РНК являются и вовсе неизученными: всего лишь около сотни из них хорошо исследованы экспериментально [2, 3, 4, 5]. Одними из самых простых и эффективных подходов к изучению функции генов являются эксперименты по их оверэкспрессии и нокдауну, при которых исследуются вызываемые ими эффекты как на молекулярном, так и на клеточном уровне.

Подходы по оверэкспрессии генов возникли с развитием методов генной инженерии и молекулярного клонирования. Разработано множество различных способов усилить экспрессию гена, как простых — через создание экспрессионных конструкций на основе плазмид, так и сложных — на основе индуцибельных систем, вирусных векторов и др. [6]. Подходы к подавлению экспрессии генов появились позже. Первым инструментом стали антисмысловые олигонуклеотиды [7, 8], которые, однако, сначала не были высокоэффективными. Революцией в молекулярной биологии стало открытие механизма РНК-интерференции — специфического посттранскрипционного подавления экспрессии гена, опосредованного малыми молекулами РНК, так называемыми эндогенными микроРНК (miRNA) и экзогенными малыми интерферирующими РНК (siРНК) [9]. Использование siРНК оказалось настолько простым и эффективным, что за короткое время нокдаун генов с их использованием стал применяться повсеместно — как в фундаментальных исследованиях по установлению функции генов, так и в прикладных работах по разработке геноспецифических препаратов [10, 11, 12, 13, 14].

На сегодняшний день существует две стратегии нокдауна генов с использованием РНК-интерференции: 1) использование siРНК и 2) использование вектора, содержащего последовательность малых шпилечных РНК (shРНК) [15].

Малая интерферирующая РНК — это двуцепочечная молекула РНК длиной 20–25 нуклеотидов с двумя неспаренными нуклеотидами на 3’-конце каждой цепи. Попадая в клетку, она встраивается в комплекс RISC (RNA-induced silencing complex), после чего происходит удаление из комплекса одной из цепей siРНК (цепи-спутницы, passenger strand). Оставшаяся цепь (ведущая, guide strand) связывается по принципу комплементарности со своей РНК-мишенью, и, если комплементарность полная, происходит разрезание целевой РНК, что приводит к деградации мРНК и снижению уровня экспрессии гена [16, 17, 18]. Малые шпилечные РНК — это короткие молекулы РНК, образующие шпилечную структуру. Стебель такой шпильки имеет длину 19–22 пар нуклеотидов, а петля — 4–11 нуклеотидов. shРНК является предшественником siРНК в клетке. Последовательность shРНК доставляется в клетки в составе экспрессионного бактериального или вирусного вектора.

По сравнению с siРНК shРНК имеют ряд преимуществ: более продолжительное воздействие на экспрессию гена-мишени; возможность интеграции вектора в геном и получение клеток, стабильно экспрессирующих shРНК; возможность создания индуцибельных систем нокдауна; возможность одновременной экспрессии с репортерным геном для контроля эффективности трансфекции и отбора трансфицированных клеток. С другой стороны, использование shРНК требует больших трудозатрат. Поэтому если по условиям эксперимента достаточно краткосрочного (5–7 дней) [19] снижения уровня экспрессии исследуемого гена, то следует использовать siРНК.

Однако сам нокдаун с помощью siРНК является многостадийным процессом, выполнение которого занимает около недели. Отсутствие стандартного протокола нокдауна и широкая доступность метода привели к тому, что в настоящее время публикуются данные, полученные в результате применения значительно различающихся методик. Более того, многие исследователи не указывают подробности проведения экспериментов [20, 21, 22], что, конечно, приводит к низкой воспроизводимости результатов. Качество работы на каждом этапе нокдауна может существенно влиять на результаты. Например, в статьях достаточно редко указывают эффективность трансфекции siРНК, а от этого зависит эффективность нокдауна и проявление последующих эффектов. В эксперименте большое значение имеют и количество трансфицируемых клеток, и уровень экспрессии целевого гена, не говоря уже о техниках выполнения базовых операций — выделении РНК, проведении реакции обратной транскрипции, проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» и др., выполняемых в разных лабораториях по-разному.

В данной работе рассматривается вся схема проведения нокдауна с помощью siРНК (рис. 1). Обсуждаются потенциальные сложности каждого этапа и пути их преодоления. Приводится пример методики, которая используется в лаборатории функциональной геномики Медико-генетического научного центра (Москва). Важно отметить, что для каждого этапа приведены контроли, которые необходимы для оценки правильности выполнения методик. Мы надеемся, что данная методика станет опорой в постановке нокдауна новых, неизученных генов как для студента, так и для научного сотрудника, и приведет к получению качественных результатов для публикации в высоко цитируемых журналах.

I. Дизайн эксперимента

1. Корректная постановка задачи

Перед началом работы по нокдауну интересующего гена в клеточной культуре необходимо проанализировать литературу и доступные в интернете баз данных, чтобы выбрать биологическую модель для исследования и определить нуклеотидную последовательность изучаемого гена.

Подходящая биологическая модель. Необходимо оценить уровень экспрессии исследуемого гена в предполагаемых клеточных культурах. Информацию об экспрессии генов в различных тканях и клеточных линиях можно найти в таких базах данных, как FANTOM5, GTExPortal, BioGPS, Human Protein Atlas; данные RNA-seq — в геномном браузере UCSC. По возможности следует выбирать клеточную модель с достаточно высокой экспрессией исследуемого гена, т. к. нокдаун генов, изначально экспрессирующихся на очень низком уровне, может быть неэффективен. Кроме того, необходимо предварительно экспериментально оценить уровень экспрессии исследуемого гена в реально используемой биологической модели при помощи ПЦР в режиме «реального времени».

Анализ последовательности гена. siРНК должна взаимодействовать с уникальным участком гена. Поэтому перед тем, как осуществлять дизайн siРНК, необходимо понять, насколько последовательность мРНК анализируемого гена подходит для специфичного нокдауна. В этом вопросе могут помочь широко распространенные инструменты анализа нуклеотидных последовательностей, такие как BLAST и геномные браузеры (например, UCSC). С их помощью следует определить, имеет ли данный ген псевдогены или высокогомологичные паралоги; содержатся ли в последовательности повторы; сколько изоформ существует у этого гена.

2. Дизайн siРНК

При существующих на сегодняшний день подходах дизайн siРНК сводится к выбору оптимального сайта связывания с последовательностью РНК-мишени. Этот сайт связывания соответствует смысловой цепи siРНК. Антисмысловая цепь является комплементарной смысловой, и именно она образует стабильную связь с комплексом RISC. Не существует единого алгоритма для выбора наиболее эффективной последовательности siРНК [23, 24]. Доступные онлайн-программы, основанные на различных принципах подбора (эмпирические правила, данные BLAST, нейросети), могут давать различные результаты при анализе одной и той же последовательности РНК-мишени [16, 23, 25]. После анализа последовательности изучаемого гена программой пользователю выдается список siРНК, из которых необходимо выбрать 3–4 лучших. Ниже приведены основные правила дизайна siРНК.

1. Длина последовательности — 20–25 нуклеотидов (обычно — 21–23 нуклеотида).
2. Содержание G/C-нуклеотидов — 35–55 %.
3. 5’-конец антисмыловой цепи siРНК должен содержать больше A/U-нуклеотидов, т. к. известно, что с комплексом RISC эффективнее связывается та цепь siРНК, которая имеет менее термодинамически стабильный 5’-конец.
4. На 3’-конец каждой цепи siРНК должен быть добавлен неспаренный дезоксидинуклеотид dTdT. Это делается для увеличения стабильности дуплекса и эффективности загрузки siРНК в комплекс RISC.
5. siРНК должна быть специфичной. Это означает, что при анализе последовательности siРНК с помощью BLAST не должны обнаруживаться транскрипты других генов, полностью комплементарные выбранной siРНК.
6. Комплементарность siРНК с  другими транскриптами не должна быть больше 16 нуклеотидов подряд.
7. siРНК должна подавлять экспрессию всех изоформ транскриптов выбранного гена, если по условиям эксперимента не стоит другая задача.
8. siРНК не должна иметь в своем составе повторов нуклеотидных мотивов и большого количества одинаковых нуклеотидов, идущих подряд (больше 3).
9. Существует ряд эмпирических правил, соблюдение которых позволяет увеличить эффективность работы siРНК. Например, необходимо стремится к тому, чтобы последовательность siРНК содержала конкретные нуклеотиды в определенной позиции в соответствии с табл. 1. Более подробно ознакомиться с правилами дизайна siРНК можно в работе Lagana и соавт. [26]. Список некоторых программ по подбору siРНК, доступных на сегодняшний день, представлен в табл. 2.

3. Необходимые контроли

Контроль эффективности доставки siРНК в клетку. Проводится при помощи неспецифической siРНК, меченной флуоресцентной меткой. Мы используем siРНК, меченную флуоресцентным красителем FAM на 5’-конце каждой цепи siFlu.

Отрицательный контроль для оценки специфичности нокдауна и вызываемых им побочных изменений в клетке. Таким контролем является неспецифическая siРНК, не влияющая на экспрессию генов в клетке. Многие фирмы-производители предоставляют готовые к использованию неспецифичные siРНК (например, Negative control siRNA от Qiagen, Германия, или Silencer Negative Control от Invitrogen, США). Другим подходом к проведению отрицательного контроля является использование scramble siРНК. Такая siРНК имеет тот же нуклеотидный состав, что и целевая, но другую последовательность. Однако такой подход требует создания в каждом эксперименте нового контроля, для которого необходимо подтверждать отсутствие нецелевого эффекта, что является затруднительным при проведении большого количества экспериментов по нокдауну. Поэтому мы в своей работе используем неспецифическую siРНК, последовательность которой была получена из открытого источника — control siMax siRNAs [38].

Положительный контроль позволяет быть уверенным в правильности проведения эксперимента. Положительным контролем служат молекулы siРНК с подтвержденной высокой эффективностью нокдауна (> 70 %) хорошо детектируемых генов. Примером положительного контроля могут являться эффективные siРНК к генам p53, GAPDH, ламинов. Последовательность таких siРНК можно найти в литературе или воспользоваться коммерческими предложениями различных фирм.

Контроли качества проведения методик на всех этапах нокдауна: выделения РНК, обработки РНК ДНКазой I, получения кДНК, проведения ПЦР в режиме «реального времени». Постановка данных контролей будет описана в соответствующих разделах статьи.

II. Доставка siРНК в клетки

Наиболее часто используемыми подходами к доставке siРНК в клетки являются химическая трансфекция и электропорация. Существует ряд методик химической трансфекции, но наиболее распространенной является липофекция — трансфекция с использованием катионных липосом [11, 39, 40, 41]. Достоинствами данной методики являются высокая воспроизводимость и простота исполнения при достаточно высокой эффективности. К недостаткам можно отнести то, что липофекция эффективна в отношении делящихся клеток и малоэффективна в отношении неделящихся, поэтому при работе с некоторыми «труднотрансфицируемыми» культурами клеток (медленно делящимися или первичными) ее эффективность может быть недостаточной. В таком случае оптимальной методикой может быть электропорация. Однако к ее минусам можно отнести высокий уровень клеточной гибели и большое количество варьируемых параметров, требующих оптимизации. Таким образом, при проведении эксперимента на наиболее распространенных, «легкотрансфицируемых» клеточных моделях оптимально использовать именно липофекцию. В настоящее время на рынке доступны различные реагенты для липофекции, самыми распространенными из них являются Lipofectamine (Invitrogen) и Metafectene (Biontex, Германия). В нашей работе используется последний.

Принцип липофекции следующий. Во время инкубации siРНК с липидами в растворе образуются липосомы, внутрь которых попадает siРНК. При смешивании получившегося раствора с клетками происходит присоединение липосом к клеточной мембране и их объединение, в результате чего siРНК оказывается внутри клетки, имея возможность взаимодействовать с мРНК в цитоплазме.

1. Оптимизация проведения липофекции с siРНК

Эффективность липофекции зависит от многих параметров, которые могут варьироваться в зависимости от используемой клеточной культуры. Поэтому перед проведением нокдауна необходимо определить оптимальные условия трансфекции для наиболее эффективной доставки siРНК в клетки. Липофекция siРНК может проводиться в различных форматах (в планшетах с 6, 12, 24 или 96 лунками; в чашках диаметром 6 или 10 см) в зависимости от целей эксперимента. В нашей лаборатории для проведения нокдауна наиболее часто используемым форматом работы является планшет на 96 лунок, поэтому далее будет приведен пример оптимизации проведения нокдауна именно для этого формата. Параметры проведения оптимизации трансфекции для других форматов приведены в официальном протоколе производителя Metafectene [42]. Вне зависимости от формата эксперимента в первую очередь необходимо оптимизировать следующие параметры.

1. Соотношение количества siРНК/липосомы (мкг/мкл): от 1 : 1 до 1 : 8.
2. Абсолютное количество трансфицируемых комплексов (siРНК + липосомы). Для 96-луночного планшета количество siРНК может варьироваться от 0,04 до 0,3 мкг, а количество липосом — от 0,2 до 4 мкл.
3. Количество клеток. Для получения оптимальных результатов трансфекцию необходимо проводить на стадии логарифмического роста клеток. Оптимальной конфлюэнтностью для проведения трансфекции является 30–60 % [42]. При этом количество клеток зависит от типа и размера клеток. Для 96-луночного планшета количество клеток обычно варьируется от 5×10³ до 60×10³.

Кроме того, на эффективность липофекции влияют и другие параметры: 1) состояние клеток на момент трансфекции (должны быть здоровыми, активно делящимися); 2) наличие сыворотки в среде (для большинства культур трансфекция проходит эффективно при наличии 10 % сыворотки); 3) время инкубации с трансфицирующим комплексом (обычно составляет 3–6 ч, но может увеличиваться и до 72 ч); 4) в некоторых случаях увеличить эффективность трансфекции позволяет обработка клеток трансфицирующим раствором в течение часа после рассаживания.

Оценку эффективности липофекции клеток проводят по siРНК, меченной флуоресцентным красителем FAM (siFlu). При этом варьируют вышеописанные параметры. Кроме того, необходимо проводить котрольные эксперименты с липосомами без siРНК, а также оставлять необработанные клетки. Это необходимо как для определения токсического эффекта трансфицирующих агентов, так и для оценки эффективности трансфекции. Саму оценку проводят через 24 ч после проведения трансфекции, и определяют ее как долю клеток, содержащих флуоресцентную метку, от общего количества клеток. Также оценивается и токсичность трансфицирующих реагентов как изменение общего количества клеток после трансфекции относительно необработанного контроля

Ниже приведен расчет (табл. 3) для проведения эксперимента по оптимизации условий трансфекции для 96-луночного формата. Подробный протокол проведения трансфекции см. в подразделе 3 «Протокол проведения липофекции».

После проведения оптимизации условий трансфекции можно оценить, насколько они пригодны для выполнения нокдауна. Также эффективность трансфекции может дать примерное представление о том, какое изменение экспрессии гена-мишени можно будет обнаружить в дальнейшем с помощью ПЦР в режиме «реального времени» при различной эффективности нокдауна (рис. 2). Например, если эффективность трансфекции составила 75 % и исследователи предпологают, что эффективность нокдауна будет 40 %, то детектируемое значение Δ∆Сt для гена-мишени составит менее 0,5 цикла, что в реальности может быть сложно достоверно определить с помощью ПЦР в режиме «реального времени». Если же эффективность нокдауна будет равна 90 %, то ∆∆Сt может достигать 1,5 цикла, а это можно детектировать с помощью ПЦР в режиме «реального времени».

2. Постановка трансфекции с siРНК к исследуемому гену

После проведения оптимизации условий трансфекции можно приступать к постановке эксперимента с целевой siРНК. Данный эксперимент необходимо ставить в нескольких биологических повторностях (от 5 до 7) для последующей корректной статистической обработки данных. И очень важно, чтобы в него входили следующие трансфекции:

• с siРНК, меченной флуоресцентной меткой (siFlu), для оценки эффективности трансфекции;
• с неспецифической siРНК (sicontrol);
• с siРНК к исследуемому гену;
• без siРНК.

В нашей работе трансфицированные клетки инкубировали до 120 ч для оценки эффекта нокдауна на различные клеточные показатели

3. Протокол проведения липофекции

Ниже представлен протокол для проведения трансфекции клеточной линии HEK293 с использованием реагента Metafectene [42].

Необходимые реактивы:

1. полная ростовая среда для клеточной культуры (в зависимости от используемой клеточной культуры),
2. натрий-фосфатный буфер (PBS),
3. реагент Metafectene,
4. растворы siРНК.

Необходимое оборудование:

1. камера Горяева или проточный цитофлуориметр,
2. ламинар для работы с эукариотами,
3. CO₂ инкубатор.

Методика протокола для клеточной линии HEK293 с siFlu представлена ниже.

1. Рассчитать количество реагентов, необходимых для трансфекции, исходя из планируемого числа реакций трансфекций (табл. 4).
2. Подготовить клетки для трансфекции: определить количество клеток в небольшой аликвоте, а далее довести клетки до необходимой концентрации в расчете на лунку планшета (например, для 96-луночного планшета на 25 лунок необходимо подготовить 4 мл суспензии с концентрацией клеток 67×10³ клеток/мл и внести в каждую лунку по 150 мкл этой суспензии).
3. Подготовить реагенты: разморозить siРНК, подготовить метафектен и пробирки.
4. Для каждого типа образцов приготовить растворы А и Б, используя объемы, указанные в табл. 2. Примечание. Раствор А можно пипетировать интесивно, раствор Б — пипетировать один раз.
5. К раствору Б добавить раствор А и однократно пипетировать во избежание разрушения липосом. Инкубировать смесь 15 мин при комнатной температуре.
6. В это время посадить клетки в лунки планшета. Необходимо, кроме образцов с siРНК, подготовить лунки с образцами, куда будет добавлен только метафектен, и контрольные лунки с клетками, куда не будет добавлено никаких реагентов (необработанные клетки, контроль выживаемости вне зависимости от трансфекции).
7. По каплям добавить раствор А + Б в нужные лунки планшета. Помешать содержимое в лунках, покачивая планшет. Инкубировать 6 ч при 37 ^°С и содержании СO₂5 %.
8. Через 6 ч посмотреть на клетки под микроскопом. Если адгезионные клетки прикрепились к подложке, то аккуратно поменять среду из-за токсичности метафектена. Инкубировать 18 ч при 37 ^°С и содержании СO₂5 %.
9. Через 24 ч после трансфекции клетки из всех контрольных лунок промыть PBS, снять трипсином, затем инактивировать трипсин полной средой, открутить, ресуспендировать и посчитать на проточном цитометре для оценки эффективности липофекции и токсичности реактивов.

III. Оценка эффективности нокдауна

1. Выделение тотальной РНК из культур клеток

Следующим этапом проведения нокдауна является приготовление лизатов трансфицированных клеток и выделение из них РНК. Этот этап является очень важным при проведении эксперимента, поскольку именно выделенная РНК будет служить основой для анализа ответа изучаемых генов. Существуют различные методы выделения РНК, основанные на разных принципах. Одним из первых появился метод выделения РНК в градиенте CsCl. Несмотря на то, что он позволяет получить очень качественный результат, сегодня его используют редко из-за трудоемкости и значительных затрат времени. Самый распространенный, простой и быстрый метод — это абсорбция на силикатных сорбентах. Для этого подхода выпускается множество различных наборов реагентов, но они довольно дороги и не всегда гарантируют хорошее качество выделения. Третий метод — выделение РНК фенол-хлороформной экстракцией. Этот метод является наиболее дешевым и качественным. На рынке доступен реагент TRIzol [43], позволяющий выделять РНК этим методом. Мы в своих экспериментах пользуемся классическим методом фенол-хлороформной экстракции [44, 45].

При выделении РНК существует достаточно большая вероятность ее контаминации РНКазами, которых много в окружающей среде. Поэтому выделение РНК должно происходить в чистой зоне, а используемые реагенты должны быть чистыми от РНКаз.

Для лизиса клеток используется гуанидин-тиоционатный буфер. Гуанидин тиоционат быстро проникает внутрь клеток и инактивирует РНКазы. Важно, чтоб перед лизисом трансфицированные клетки держали на холоде, а свежеприготовленные лизаты — во льду для предотвращения деградации РНК. После очистки образцов от дебриса лизаты следует поделить на две части, одну из которых можно хранить при –70 ^°С до полугода, а из другой части выделять РНК. Если в дальнейшем на каком-то этапе что-то не получится, можно взять материал из предыдущего шага, а не переделывать все сначала.

При фенол-хлороформной экстракции происходит разделение фенольной и водной фаз, при этом в верхней водной фазе остаются нуклеиновые кислоты, а белки частично уходят в фенольную фазу, частично — остаются в интерфазе. Чтобы разделить ДНК и РНК, применяют кислый фенол с pH 4,4, т. к. только в этом случае РНК стабильна, тогда как ДНК частично уходит в органическую фазу и интерфазу вместе с белками.

Необходимые реагенты:

1. кислый фенол, насыщенный цитратным буфером (рН 4,4),
2. хлороформ,
3. этиловый спирт 96 % и 70 %,
4. гуанидин тиоционат буфер (ГТБ): 4 Mгуанидин тиоционат, 25 mМ цитрат Na pH 7,0, 0,5 % N-лауроилсаркозин Na, 0,1 М β-меркаптоэтанол (добавлять перед использованием),
5. натрий-фосфатный буфер PBS,
6. вода, чистая от РНКаз.

Необходимое оборудование:

1. генератор ультразвука,
2. центрифуга с охлаждением,
3. камера для электрофореза.

Ниже представлен полный протокол [44, 45] выделения РНК из культур клеток.

1. Достать пробирки, охладить их (на ледяной бане), подписать.
2. Адгезионные клетки в лунках отмыть от среды (насосом убрать среду, аккуратно залить холодным PBS, так же убрать PBS). Суспензионные клетки ресуспендировать в каждой лунке, далее центрифугировать на 1,5 krpm 1 мин, отобрать среду, промыть раствором PBS.
3. Залить клетки 1 мл ГТБ, полученный лизат как можно быстрее перенести в охлажденные пробирки. Интенсивно провортексировать.
4. Провести гомогенизацию клеток. Примечание. Гомогенизацию можно проводить пропусканием лизата через стерильную иглу шприца, однако этот метод не является достаточно эффективным. Более качественным методом является ультразвуковая гомогенизация на холоде. Мы используем ультразвук мощностью 130 Вт в течение 30 с для гомогенизации [46].
5. После гомогенизации еще раз провортексировать образцы.
6. Центрифугировать лизаты при 10 000 g при 4 ^°С 5–20 мин для осаждения дебриса, который может мешать выделению РНК.
7. Супернатант перенести в чистые пробирки (переносить следует аккуратно, т. к. осадок не закреплен на дне пробирки).
8. Для каждого образца объем лизата разделить на две равные части: одна — для непосредственно выделения, вторая — запасная (убирается на хранение при –70 ^°С).
9. К 500 мкл лизата добавить 1/10 объема (50 мкл), 2 М ацетата натрия pH 4,2. Мягко перемешать.
10. Далее к лизатам добавить равный объем (500 мкл) кислого фенола, мягко смешать, инкубировать 5 мин при комнатной температуре (для полного растворения нуклеобелковых комплексов).
11. Добавить 1/5 объема хлороформа (100 мкл), интенсивно провортексировать.
12. Центрифугировать 20 мин при 10 000 g.
13. Аккуратно отобрать верхнюю фазу в чистую пробирку, стараясь не задеть и не забрать интерфазное кольцо.
14. Дополнительно, при наличии большого белкового интерфазного кольца, повторить фенол-хлороформную экстракцию несколько раз, пока интерфазное кольцо совсем не исчезнет. Примечание. Объем верхней фазы уменьшается с каждым центрифугированием, поэтому к нему следует добавлять недостающее до 500 мкл количество ГТБ.
15. К верхней фазе добавить равный объем смеси кислого раствора фенол : хлороформ (1 : 1, заранее смешать, т. к. при смешивании выделяется вода и объем меняется, 500 мкл). Интенсивно вортексировать, центрифугировать 10 мин при 10 000 g.
16. Аккуратно отобрать верхнюю фазу в чистую пробирку.
17. К верхней фазе добавить один объем хлороформа (500 мкл), интенсивно вортексировать, центрифугировать 10 мин при 10 000 g. Аккуратно отобрать верхнюю фазу в чистую пробирку.
18. К верхней фазе добавить 2,5 объема 96 % этилового спирта (1 250 мкл). Также для лучшей визуализации осадка после центрифугирования можно добавить соосадители (например, гликоген).
19. Инкубировать при –20 ^°С не менее 1 ч, затем можно оставить на ночь при –20 ^°С (осаждение нуклеиновых кислот).
20. Центрифугировать 20 мин при 10 000 g при +4 ^°С.
21. Супернатант слить, осадок промыть холодным 70 % этиловым спиртом. Постараться, чтобы спирт протек по стенке пробирки со всех сторон для очистки от солей, которые могут ингибировать ферментативные реакции. Центрифугировать 10 мин при 10 000 g при +4 °С.
22. Осадок подсушить на воздухе под ламинаром (оставить открытые пробирки на несколько минут, пока не исчезнут последние капли и осадок, если он виден, не станет прозрачным), растворить в воде, не содержащей нуклеаз.
23. Проверить качество выделения РНК с помощью электрофореза. Если осадок был достаточно хорошо виден, то лучше наносить на электрофорез один образец дважды в разных количествах, например 1 и 5 мкл.
24. После электрофореза в 1 % агарозном геле цельная РНК должна выглядеть на геле как две мажорные полосы, соответствующие 18S и 28S рРНК, причем 28S бенд должен быть интенсивнее 18S примерно в 2 раза (рис. 3). На протяжении всей дорожки, от самого верха до самого низа, должен быть виден слабый шмер — это и есть высокомолекулярная мРНК. Важно, чтобы внизу геля не было бенда, который свидетельствует о деградации РНК. Если внизу присутствует бенд сильной интенсивности, то лучше выделить РНК заново, еще раз уделив внимание всем выше перечисленным шагам. Другой важной особенностью хорошего выделения является отсутствие геномной ДНК, которая «бежит» чуть выше полосы ДНК-маркера, соответствующей длине 10 тыс. п. н. При ее наличии также лучше выделить РНК заново, обращая внимание на буферизацию фенола и аккуратный отбор водной фазы.

Качество и количество полученной РНК можно оценить инструментально на спектрофотометре. Количество РНК определяется значением поглощения при 260 нм. Дополнительные измерения при 240 и 280 нм дадут исследователю представление о чистоте образца от белков. Она определяется подсчетом отношения значений полглощений 260/280, которое может колебаться от 0,5 до 2,0. Чем чище РНК от белков, тем ближе показатель к 2,0. Отношение значений 260/230 показывает чистоту РНК от органических примесей, в частности, от фенола, его солей и других солей, используемых при выделении РНК. В идеальном случае это значение также должно быть около 2,0. Если все же при выделении образец РНК оказался недостаточно чистым, его можно попробовать очистить дополнительным осаждением РНК спиртом.

Выделенную РНК необходимо хранить при –70 ^°С и перед использованием размораживать на ледяной бане.

2. Обработка образцов РНК ДНКазой I 

Контаминация ДНК в образцах РНК часто приводит к различным проблемам на этапе проведения ПЦР в режиме «реального времени»: образованию неспецифичных продуктов. Также необходимо подбирать разноэкзонные праймеры для амплификации таргетных генов, дабы избежать вклада геномной ДНК в результат реакции при амплификации кДНК. Поэтому оптимально использование РНК без примесей геномной ДНК. Практика показывает, что даже коммерческие наборы реагентов для выделения РНК не гарантируют получения РНК, свободной от ДНК. Для очистки РНК от нее образцы обрабатываются ДНКазой I.

Важно отметить, что на данном этапе мы советуем не обрабатывать ДНКазой I весь образец РНК, а работать с его частью. Таким образом, в случае ошибок или непредвиденных обстоятельств всегда можно вернуться на шаг назад.

Проведение реакции с ДНКазой I — несложная операция [47]: к аликвоте РНК необходимо добавить реакционный буфер и непосредственно фермент того же производителя. ДНКазу I нельзя вортексировать, иначе она теряет свою активность. Инкубация с ферментом длится минимум 1 ч. Этого времени в большинстве случаев достаточно, чтобы хорошо очистить РНК от ДНК. Инактивация ДНКазы I происходит посредством добавления в смесь ЭДТА для хелатирования ионов Mg²⁺ и нагревания смеси до 60 ^°С.

Необходимые реагенты:

1. буфер для работы ДНКазы I cMg²⁺,
2. ЭДТА 50 мМ,
3. вода, чистая от РНКаз.

Необходимое оборудование: термостат.

Нами используется следующий протокол.

1. РНК разморозить на ледяной бане.
2. Отбрать аликвоту РНК (2–3 мкг) и довести ее объем до 8 мкл водой, чистой от РНКаз.
3. Добавить 1 мкл 10x реакционного буфера для ДНКазы I, провортексировать.
4. Добавить 1 мкл фермента, сбросить капли вниз (не вортексировать).
5. Инкубировать 1 ч при 37 ^°С.
6. Добавить 1 мкл 50 mM ЭДТА и инкубировать 10 мин при 60 ^°С.

3. Контроль очистки образцов РНК от примесей ДНК

Для проверки успешности работы ДНКазы необходимо оценить оставшееся количество ДНК в образце. Для этого проводится реакция ПЦР в  режиме «реального времени» с парой праймеров, отжигающихся на геномной ДНК. В качестве контрольного образца в реакцию также нужно взять образец РНК до обработки ДНКазой I и геномную ДНК. Получаемое значение Сt с образца, обработанного ферментом, должно быть больше значений Ct, полученных с образцов РНК до обработки ДНКазой I и геномной ДНК. Если значение Ct меньше 36 циклов, то можно считать обработку успешной. При таком значении геномная ДНК не будет вносить значимого вклада в экспрессионный анализ.

Необходимые реагенты:

1. вода, чистая от РНКаз,
2. ПЦР-смесь (5х): рабочий буфер для полимеразы (5х), MgCl₂ (12,5 mM), смесь 4 дезоксинуклеотидов (1 mM каждого),
3. Taq-полимераза,
4. краситель ЕvaGreen,
5. для ПЦР-участка гена HPRT1 использовали следующие праймеры:

HPRT f3 — ACCACCGTGTGTTAGAAAAGTA,
HPRT r3 — AGGGAACTGCTGACAAAGATT.

Необходимое оборудование:

1. амплификатор для проведения ПЦР в режиме «реального времени»,
2. камера для электрофореза.

Для постановки контрольной ПЦР мы используем праймеры к гену HPRT1, амплифицирующие фрагмент геномной ДНК, по следующему протоколу:

1. На каждый образец готовится ПЦР-смесь:

• ПЦР-смесь (5х) — 4 мкл,
• праймеры (2,5 µМ) — 2 мкл каждого,
• EvaGreen (20х) — 1 мкл,
• Taq-полимераза (5 ед./мкл) — 0,25 мкл,
• вода — 9,75 мкл,
• матрица — 1 мкл.

2. Амплификация проходит по следующему температурному профилю: 95 ^°С — 1 мин; 40 циклов: 95 ^°C— 10 с, 60 ^°C — 10 с, 72 ^°C — 10 с; флуоресценция снимается одновременно с элонгацией; кривая плавления — с 60 до 95 ^°С с шагом в 0,3 ^°С.
3. Анализ полученных кривых амплификаций, получение значений Ct.

Также важно отметить, что после обработки образцов РНК ДНКазой необходимо проконтролировать качество РНК с помощью электрофореза, как было описано выше.

4. Получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции

Данный этап также является несложным по исполнению, однако он очень важен для последующего анализа, поскольку при неэффективном прохождении обратной транскрипции при экспрессионном анализе могут быть получены данные, не соответствующие реальному ответу клеток на воздействие.

На сегодняшний день существует два основных способа получения кДНК — с помощью случайных гексануклеотидов и с помощью так называемого oligo-dT-праймера. Случайные гексануклеотиды могут отжигаться в любых местах на молекулах РНК, поэтому в результате получается библиотека фрагментов кДНК, соответствующих всем последовательностям РНК. Oligo-dT-праймер отжигается на поли-А-хвост мРНК, поэтому в результате получается библиотека полиаденилированных РНК. Выбор праймеров для обратной транскрипции (ОТ) зависит от природы изучаемого гена и имеющихся праймеров для его амплификации. Использование случайных гексануклеотидов позволяет получить кДНК, в которой представлены все участки РНК, что позволит использовать праймеры, подобранные на любую часть транскрипта. Хотя 5’-концы у таких библиотек представлены большим числом фрагментов синтезированных кДНК. И напротив, oligo-dT-праймер позволяет более эффективно получать фрагменты кДНК, соответствующие 3'-концам РНК [48]. Кроме того, библиотека будет обогащена полиаденилированными мРНК. Поэтому в зависимости от длины мРНК гена и того места, куда подобраны праймеры для дальнейшей амплификации, экспериментатор сам выбирает подходящий для него вариант.

Протокол обратной транскрипции включает 3 этапа: двух- или трехстадийный отжиг праймеров на РНК, саму реакцию обратной транскрипции и ее инактивацию.

Необходимые реагенты:

1. обратная транскриптаза,
2. буфер для работы обратной транскриптазы,
3. дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTPs),
4. MgCl₂ 25 mM,
5. вода, чистая от нуклеаз.

Необходимое оборудование: термостат и ледяная баня.

Прот