Кожа служит физическим барьером и первой линией защиты организма от окружающих патогенов. При повреждении кожного покрова в ране может развиться инфекция и остановить процесс заживления раны, приведя к увеличению риска заболеваемости и даже смертности. Открытие антибиотиков произвело революцию в лечении инфекций, но наблюдающееся в последнее время увеличение резистентности к антибиотикам среди патогенных бактерий диктует необходимость поиска новых альтернативных методов лечения локализованных инфекций. Одним из таких методов стала ФДТ, которая ранее успешно применялась в лечении онкологии [1–3], а недавно была предложена для лечения бактериальных инфекций [4–7]. Суть антимикробной ФДТ заключается в местном применении в инфицированной ткани нетоксичного красителя — фотосенсибилизатора (ФС) с последующим воздействием монохроматическим светом с длинной волны, к которой чувствителен ФС [8–9]. Под действием света ФС активируется, генерируя свободные радикалы и/или синглетный кислород, губительные для инфекционных агентов.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении влияния ФДТ с использованием анионного ФС МЦ540 в модели раневой инфекции на животных на бактериальную инактивацию и на процесс заживления ран. Мыши линии BALB/c были инфицированы полирезистентным клиническим штаммом Pseudomonas aeruginosa PA21. Инактивацию бактерий оценивали путем определения бактериологической нагрузки в ранах, процесс заживление ран контролировали прямым измерением штангенциркулем в двух проекциях, а также проведением патоморфологических исследований послойных срезов инфицированных ран.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Фотосенсибилизатор

Маточный раствор МЦ540 (Sigma-Aldrich, Швейцария) в концентрации 1×10–3 M готовили в 96% этаноле в день проведения опыта. Концентрацию МЦ540 определяли спектрофотометрически с использованием коэффициента экстинкции ε500 = 63 000 М–1см–1 в воде. В рабочих растворах концентрация МЦ540 составляла 25 мкМ, которую получали путем разведения маточного раствора МЦ540 (1×10–3 M) водой или 0,25 М раствором NaCl (ACROS, США).

Культуры клеток микроорганизмов

В работе использовали полирезистентный клинический штамм Pseudomonas aeruginosa PA21 из коллекции микроорганизмов ФГБУ ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи. P. aeruginosa инкубировали в течение ночи при 37 °C в питательном бульоне Brain Heart Infusion (BHI «Difco», США), разводили в свежей питательной среде 1:100, растили до оптической плотности (OD600), равной 1, что соответствует концентрации 109 КОЕ/мл. Далее культуру дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (pH = 7,4) (Экосервис, Россия) и аликвотами по 50 мкл наносили на рану.

Бактериальная нагрузка ран

Отбор материала производили по следующей методике: при помощи ватных тампонов получали мазок непосредственно с поверхности раны. Далее тампон помещали в пробирку с 0,9 мл физиологического раствора, из которого в последующем готовили серийные разведения 1:10, 1:100, 1:1000. Каждое разведение высевали на две чашки с агаризованной средой (BHI «Difco», США), подсчет колоний проводили через 24 ч, результаты выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ), а именно в десятичном логарифме, взятом от количества КОЕ.

Антимикробная фотодинамическая терапия

Манипуляции во время проведения экспериментов выполняли с соблюдением правил асептики и антисептики с использованием щадящей методики обезболивания. Все исследования проводили с соблюдением правил биоэтики и международных принципов и требований «Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, март 1986 г.) и Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. В исследовании использовали мышей BALB/c 6–8 недель и весом 17–21 г. За сутки до проведения ФДТ на спине животных выбривали участок кожи площадью 2 см2 и затем перманентным маркером намечали контур будущей раны. Перед формированием раны животным давали ингаляционный наркоз (изофлуран). Поверхность кожи дважды обрабатывали антисептиком, наносили рану округлой формы 1,5 см в диаметре, иссекали кожу, подкожную клетчатку и фасцию до мышц. Далее на рану наносили аликвоту объемом 50 мкл, содержащую суспензию бактерий (P. aeruginosa) в концентрации 107  КОЕ/мл. Через 6 ч после инокуляции бактерий проводили ФДТ.

Животных разделили на 4 группы (табл. 1). Мыши из группы А (n = 18) служили в качестве абсолютного контроля, не получая никакого лечения; мыши из группы Б (n = 18) служили в качестве светового контроля и для лечения инфицированной раны облучались монохроматическим светом с длиной волны 530 нм и временем экспозиции 5 мин; мыши группы В (n = 18) получали ФДТ в присутствии 25 мкМ водного раствора МЦ540 с облучением монохроматическим светом с длиной волны 530 нм и временем экспозиции 5 мин; мыши группы Г (n = 18) получали ФДТ в 25 мкМ водном растворе МЦ540 в присутствии 0,25 М NaCl с облучением монохроматическим светом с длиной волны 530 нм и временем экспозиции 5 мин. Из каждой группы было оставлено по 3 животных для наблюдения за долгосрочными эффектами (36 сут.).

Мышей обрабатывали локально 50 мкл раствора 25 мкМ в 0,25 M NaCl, с экспозицией без облучения в течение 5 мин. Обработанные очаги были освещены светом с длиной волны 530 нм, обеспечивающим 2 мВт/см2 в течение 5 мин, что соответствует общей дозе 6 Дж/см2.

Гистология

Биологический материал фиксировали в буферном растворе 10%-го формалина. Фиксированные образцы заключали в парафин. Срезы толщиной 3–7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и использовали для микроструктурного анализа и морфометрических наблюдаемых процессов. Морфометрические данные были получены с помощью микроскопа-анализатора AxioimagerA-2 (Carl Zeiss, Германия).

Заживление раневого дефекта

При наблюдении за состоянием раневых дефектов оценивали наличие признаков воспаления, характер и количество раневого отделяемого и т. д. Измерение ран с помощью линейки и штангенциркуля в двух проекциях осуществляли за 1 ч до проведения ФДТ на 2-е, 4-е, 7-е и 14-е сут. Для выявления характера течения репаративных процессов в исследуемых группах животных вычисляли следующие показатели динамики заживления экспериментальных ран:

1. Показатель изменения площади раневой поверхности в динамике (ΔS, %) : форм. 1
   где S₀ — исходная площадь раны, S_n — площадь раны на n-е сутки.
2. Относительная скорость уменьшения площади раневого дефекта (ν_заж., %/сутки): форм. 2
   где S₀ — исходная площадь раны, S_n — площадь раны на n-е сутки, n — порядковый номер суток эксперимента.
3. Показатель скорости эпителизации раны (ν_эпит., мм2 / сутки): форм. 3 ,
   где S₀ — исходная площадь раны, S_n — площадь раны на n-е сутки, Т — число суток между измерениями.

Все цифровые данные обрабатывали с использованием компьютерной программы Universlab DeskTer River V3.3.3269.

Статистика

Рассчитывали средние значения определяемых величин и стандартную ошибку среднего по форм. 4 где s — выборочное среднее квадратичное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На следующие сутки после моделирования ран и проведения ФДТ общее состояние животных можно было оценить как удовлетворительное. Животные были активны, слизистые оболочки без видимых изменений, шерстный покров гладкий. Раны у всех животных имели признаки развивающегося нагноения. Наиболее выраженное нагноение наблюдалось в контрольных группах.

Бактериальная нагрузка

Одним из значимых критериев оценки эффективности проведенного лечения гнойных ран мягких тканей является микробиологическое исследование. Определение бактериальной нагрузки производилось до начала проведения лечения, через 48, 96 и 168 ч после ФДТ. Количественные показатели бактериальной нагрузки ран представлены в табл. 2.

Через 6 ч после инфицирования перед ФДТ исходная контаминация ран во всех группах животных была одинаковой и составила 5,03 ± 0,04×106 КОЕ/мл. В опытных группах В (ФДТ индуцированная МЦ540 в воде) и Г (ФДТ индуцированная МЦ540 в растворе натрия хлорида) через 48 ч после проведения ФДТ количество P. aeruginosa уменьшилось на 10² и 10³ КОЕ/мл соответственно.

Сравнительная характеристика течения инфицированных раневых дефектов

Сравнительный анализ результатов наблюдения характеристик течения раневых дефектов в экспериментальных группах позволил установить межгрупповые различия динамики заживления раневых дефектов по показателю ΔS (табл. 3).

Анализ полученных данных показал, что значения ΔS контрольных групп А и Б достоверно меньше (p < 0,05) соответствующих показателей опытных групп В и Г на всех этапах проведения эксперимента (исключение составило отсутствие значимых различий с результатом группы Б и В на 7-е сут.).

Сравнительный анализ скоростей заживления раневых дефектов в динамике выявил значимые внутригрупповые различия показателей ν_заж. (см. табл. 3). Из полученных данных видно, что наибольшая скорость заживления наблюдается в группе Г, а в остальных группах на протяжении 14 сут., показатели ν_заж. находились на достаточно стабильном уровне (p > 0,05). Отметим, что скорость заживления к 14 сут. снижается и становится практически одинаковой для всех групп.

Нами выявлены существенные изменения, а также межгрупповые различия показателей скорости эпителизации раневых дефектов (ν_эпит.) в процессе проведения эксперимента (табл. 4).

Максимальные значения скорости эпителизации (ν_эпит.) в интервале 4–7 сутки были отмечены в группе Г (p < 0,05 во всех случаях), к 14 сут. скорость эпителизации во всех группах снижалась.

В первые 48 ч в ране происходят изменения, характеризующиеся формированием кровяного сгустка. В основе сгустка лежит фибрин, который формирует струп с выпотом экссудата и клеточных элементов с преобладанием нейтрофилов. Наступает лизис форменных элементов крови с формированием всех признаков гнойного воспаления (рисунок 1А).

Под лизирующимся струпом бурно разрастается молодая соединительная ткань в основе которой выявляются многочисленные тонкостенные капилляры, синусы, лакуны, заполненные большим количеством крови (рисунок 1Б). Со временем (4–7 сут.) вновь образованная соединительная ткань превращается в рубцовую, порой гиализированную и даже петрифицированную (рисунок 1Е). Даже неглубоко расположенные такие инфильтраты вызывают контрактуры, и, следовательно, приводят к неподвижности кожи.

В это же время в гистологических препаратах выявлялось медленное (24–48 ч), а затем бурное размножение базальных клеток эпидермиса с нарастающей его кератинизацией. Разрастаясь и дифференцируясь, эпидермис постепенно закрывает дефект кожи (табл. 4, рисунок 1Д). Синтетические процессы в ране проходят равнонаправленно, но с определенным сдвигом во времени. На эти процессы влияет много факторов, в том числе заданные экспериментом (табл. 3 и табл. 4, рисунок 1). Обилие крови, усиленная оксигенация и обилие ферментативных процессов в ране, возникающие со временем, усиливают процесс неполной репаративной регенерации. Протекающий процесс вызывает даже внутриклеточную регенерацию миосателлитов (табл. 3 и табл. 4, рисунок 1Г).

Таким образом, микроструктурный анализ хорошо коррелирует с полученными данными (табл. 2 – табл. 4, рисунок 1) и указывает на бурное заживление ран за счет активного роста, дифференцировки и созревания микрососудистого русла с формированием грануляционной ткани, а также усиленной эпителизации раневого дефекта.

ОБСУЖДЕНИЕ

В исследованиях in vitro ранее нами было показано, что в случае ФДТ МЦ540 в присутствии 0,25 М NaCl инактивация P. aeruginosa возрастает в 10 раз по сравнению с ФДТ МЦ540 в воде [10]. Наблюдаемый эффект был объяснен разной степенью агрегации МЦ540 в воде и в присутствии соли. В воде МЦ540 находится как в мономерной, так и димерной формах [11], из которых только мономерная форма способна генерировать активные формы кислорода, в первую очередь — синглетный кислород [12, 13]. В солевых растворах МЦ540 образует крупные кристаллоподобные агрегаты, способные к генерации свободных радикалов [14–17].

Представленные в настоящем исследовании данные на животных моделях убедительно подтвердили ранее полученные данные in vitro по следующим показателям: гибель бактерий, препятствование их восстановлению и ускорение процесса заживления ран.

Действительно, согласно представленным в табл. 2 данным, после проведенной ФДТ с МЦ540 в растворе натрия хлорида полное очищение раны от полирезистентного штамма P. aeruginosa происходит к 4 сут., тогда как при проведении ФДТ с МЦ540 в воде аналогичные изменения наблюдались лишь на 7-е сут.

Морфометрические данные (табл. 3) подтверждают лучшую эффективность агрегатов МЦ540 по сравнению с его мономерами и димерами в отношении скорости заживления раневого дефекта и уменьшения его площади. Так, к 4 сут. площадь раневого дефекта у животных из группы Г уменьшилась на 45%, в то время как для группы В эта величина составляет 60%, что близко к показателям группы Б (68%).

Наблюдаемые изменения относительной скорости уменьшения дефекта (табл. 3) в случае группы А имеют практически линейную зависимость (с учетом среднеквадратичного отклонения), для групп Б–В — параболическую с максимумом на 4-е сут., а для группы Г — экспоненциальную. Для животных всех исследованных групп на 14-е сутки наблюдалось снижение скорости заживления. Полученные данные согласуются с описанным ранее изменением показателя площади раневой поверхности (табл. 3).

Регенерация эпителиального покрова ран происходит значительно быстрее, и становиться ярко выраженной уже на 4-е сут. в группе Г (см. табл. 4), в отличии не только от контроля, но и группы, получившей лечение на основе ФДТ с МЦ540 в воде.

Микроструктурный анализ хорошо коррелирует с полученными данными (табл. 2– табл. 4, рисунок) и указывает на бурное заживление ран за счет активного роста, дифференцировки и созревания микрососудистого русла с формированием грануляционной ткани, а также усиленной эпителизации раневого дефекта. Однако, хотя процессы заживления, а также очищения раны от патогенных бактерий происходили намного быстрее в случае применения ФДТ с МЦ540 в растворе хлорида натрия, сам процесс происходит «жестче» с расплавлением фибрина и образованием фибриноида. Для ФДТ с МЦ540 в воде процесс заживления проходит медленнее, «мягче» и без активного образования фибриноида.

ВЫВОДЫ

Согласно данным, полученным в модели раневой инфекции на мышах, ФДТ с МЦ540 в растворе хлорида натрия способна намного эффективнее вызывать гибель бактерий, препятствовать их последующему восстановлению и значительно ускорять процесс заживления ран, по сравнению с контрольными группами и ФДТ с МЦ540 в воде.