Муковисцидоз (МВ), или кистозный фиброз, — наследственное заболевание, характеризующееся системным поражением экзокринных желез организма, проявляющееся тяжелыми нарушениями функций органов дыхания и пищеварительного тракта. МВ наследуется по аутосомно-рецессивному типу и обусловлен патогенными мутациями в гене трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) [1]. Наиболее частая причина возникновения МВ — мутация F508del (rs113993960), приводящая к делеции фенилаланина в 508 положении [1–3]. В настоящее время МВ неизлечим и требует проведения комплексных терапевтических мер на протяжении всей жизни пациента.

МВ входит в число наиболее частых наследственных заболеваний. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, в среднем в мире МВ встречается с частотой 1:2500–3000 новорожденных [3].

В национальном регистре за 2015 г. в Российской Федерации официально зарегистрировано 2916 больных муковисцидозом [4]. В 2016 г. частота встречаемости МВ у новорожденных РФ составила 1:8788 [5].

Крайне важно диагностировать МВ еще на доклиническом этапе заболевания — своевременно начатое лечение существенно снижает риск развития необратимых изменений органов дыхательной системы и ЖКТ ребенка, что, несомненно, отражается на качестве жизни самого больного и его близких [6].

Инструментом ранней диагностики МВ служит неонатальный скрининг (проводится в РФ с 2006 г.). В РФ он включает комплекс диагностических исследований, выполняемых последовательно: тест на содержание иммунореактивного трипсина (ИРТ) в крови, повторный тест на ИРТ, потовый тест на содержание ионов хлора (назначается при превышении пороговых значений ИРТ) [7].

Молекулярно-генетическая диагностика, или ДНКдиагностика (определение мутаций в гене CFTR), при МВ проводится в несколько этапов. В первую очередь, осуществляется поиск частых мутаций с использованием специфических диагностических панелей [3, 7, 8]. Если частые мутации CFTR идентифицированы не были, проводят секвенирование гена [3, 9], затем при необходимости специальными методами осуществляется поиск крупных структурных вариаций гена CFTR [3].

В настоящее время ДНК-диагностика МВ не является строго обязательной, чаще выполняется при получении неоднозначного результата исследования или невозможности проведения потовой пробы. Тем не менее характер мутаций является одним из факторов, предопределяющих тяжесть течения заболевания [3], а подтверждение генотипа позволяет рекомендовать пациентам прицельную фармакогенетическую терапию [2, 3]. Одно из преимуществ ДНК-диагностики состоит в точности метода (в отличие от потовой пробы, результат исследования последовательности гена не зависит от физиологических особенностей пациента).

На сегодняшний день в РФ можно констатировать недостаточную доступность генетической диагностики муковисцидоза. Однако за последние годы был накоплен существенный объем данных по генетической эпидемиологии МВ в России. Определены наиболее распространенные варианты мутаций гена CFTR [3, 8], установлены особенности генетики МВ у различных этнических групп, а также описаны межрегиональные различия частот встречаемости патогенных аллелей [8, 10, 11] (например, мутация E92K (rs121908751), которая наиболее часто встречается среди представителей популяции Чувашии). С 2011 г. В национальном регистре больных МВ ведется учет данных о мутациях гена CFTR [12]. На платформе открытой международной базы данных генетических вариантов LOVD v.3.0 (Leiden Open Variation Database) создан и дополняется реестр аллельных вариантов гена CFTR, представленных у жителей РФ, под названием «SeqDB-LOVD»/«Консенсус по клиническим эффектам генетических вариантов» [13]. В «SeqDB-LOVD» представлена информация по клинической значимости различных вариантов гена, в том числе популяционно редких. Последнее стало возможным за счет активного внедрения в исследовательскую практику технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS).

Согласно данным «SeqDB-LOVD» на текущий момент в РФ зарегистрировано более 220 клинически значимых мутаций гена CFTR, при этом новые неописанные аллельные варианты регистрируются в сравнительно малочисленных выборках [9]. Учитывая данное наблюдение, можно предполагать, что действительное разнообразие патогенных мутаций CFTR существенно выше.

В отделении педиатрии Российской детской клинической больницы имени Н. И. Пирогова ежегодно проходят наблюдение около 500 детей из разных регионов РФ, в том числе до 100 пациентов с диагнозом МВ. С 2014 по 2017 г. в отделение поступило более 200 детей с клинической картиной МВ, в большинстве случаев с неполными данными генотипирования (молекулярно-генетическая диагностика не была проведена, либо у пациента была известна мутация в одном из аллелей гена CFTR). Целью настоящей работы стало определение спектра патогенных вариантов гена CFTR в выборке из 191 пациента со смешанной формой МВ и тяжелым течением.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Для проведения ретроспективного исследования отобраны образцы крови 191 ребенка с диагнозом муковисцидоз, с тяжелым или среднетяжелым течением заболевания, проходивших лечение в Российской детской клинической больнице РНИМУ им. Н. И. Пирогова в период с 2014 г. по начало 2017 г. В большинстве случаев пациенты не имели подтвержденного генетического диагноза. В исследованную группу вошли дети обоих полов из 57 субъектов РФ (Московская область и Ставропольский край были представлены в выборке 15 пациентами, другие регионы РФ — 1–9 пациентами). Критерии включения: клинически установленный диагноз муковисцидоз смешанная форма, тяжелое течение (E 84.8). Критерии исключения: клинически установленный диагноз муковисцидоз, преимущественно легочная форма (Е 84.0) и пациенты с легкими или пограничными клиническими проявлениями кистозного фиброза. Основную часть выборки составили неродственные пациенты, в 4 случаях исследованы пары сибсов. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава России (протокол № 172 от 19.02.18).

Забор биоматериала пациентов (периферическая кровь) проводили на базе детской клинической больницы им. Н. И. Пирогова. Геномную ДНК пациентов выделяли из образцов цельной крови, архивированной в Биобанке Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова, с помощью комплекта реагентов «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» (ДНК-Технология, Россия) согласно инструкции производителя.

Для определения наиболее распространенных мутаций в гене CFTR использовали комплекты реагентов «Генетика наследственных заболеваний. Муковисцидоз Скрин» и «Генетика наследственных заболеваний. Муковисцидоз — редкие мутации» (ДНК-Технология, Россия). Комплекты реагентов разработаны для определения 8 (F508del, dele 2,3 (21kb), 2143delT, 1677delTA, N1303K, 3849+10kbC>T, E92K, W1282X) и 16 (2184insA G542X, S1196X, R334W, 394delTT, 3944delGT, 3821delT, 2789+5G>A, 621+1G>T, 2183AA>G, L138ins, R117H, 604insA, 3667insTCAA, R553X, K598ins) вариантов мутаций в гене CFTR соответственно (здесь и далее приведены тривиальные названия мутаций, определяемых в составе панелей). Принцип работы наборов основан на методе «примыкающих проб» (kissing probes) [14] и включает: ПЦР-амплификацию целевого участка гена, гибридизацию последовательность-специфичных зондов с продуктами амплификации и регистрацию кривых плавления зондов в ходе температурной денатурации (рисунок) [15, 16]. ПЦР и определение температуры плавления зондов проводили при помощи детектирующего амплификатора DTprime (ДНК-Технология, Россия).

Поиск редких и новых вариантов CFTR проводили методом высокопроизводительного секвенирования на платформе Ion TorrentTM (Thermo Fisher Scientific, США). Целевые участки включали в себя кодирующие области (27 экзонов гена CFTR), интрон-экзонные границы и область промотера гена. Дополнительно в панель включен фрагмент для идентификации интронного варианта 3849+10kbC>T (rs75039782) патогенного значения. Для определения распространенной у представителей российской популяции делеции 2–3 экзонов CFTR — dele 2,3 (21 kb) в панель мишеней были добавлены области, охватывающие ее границы (табл. 1).

Обогащение целевых фрагментов перед секвенированием проводили методом ПЦР. В ПЦР брали не менее 10 нг геномной ДНК. Лигирование адаптеров к ПЦР-продуктам проводили с использованием T4 ДНК-лигазы (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции производителя. Качество библиотек фрагментов ДНК определяли с помощью системы Agilent 2100 Bioanalyzer и набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, США). Для постановки высокопроизводительного секвенирования использовали платформу Ion PGM Next-Generation Sequencing Systems (Ion Torrent™, США), набор Ion PGM™ Template OT2 400 Kit (Ion Torrent™, США). Высокопроизводительное секвенирование выполняли на базе лаборатории молекулярногенетических методов Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова.

Первичный анализ данных осуществляли с помощью программного обеспечения Torrent server 4.4.3. Выравнивание на референсный геном версии GRCh37/hg19 выполняли с помощью программного модуля TMAP (в референсный геном был внесен фрагмент, соответствующий «fusionампликону», маркирующему наличие делеции CFTRdele 2,3 (21 kb), для идентификации генетических вариантов был использован программный модуль Torrent Variant Caller 5.4.0.46. Последующий анализ проводили с помощью программных модулей, разработанных авторами. Медиана покрытия целевых участков составила 4500 прочтений, минимальное покрытие — 500. Для определения патогенности использовали базу данных dbSNP Build 147, локус-специфичные базы данных «CFTR1» [17], «CFTR2» [18], «SeqDB-LOVD» [13], а также данные литературы. Подтверждение генетических вариантов проводили методом секвенирования ДНК по Сэнгеру (по обеим цепям) на секвенаторе ABI 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США) с оригинальными реагентами, согласно рекомендациям производителя. Во всех случаях были получены идентичные результаты генотипирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате ПЦР-генотипирования в выборке было выявлено 18 мутаций гена CFTR (табл. 2). В гомозиготном состоянии определены следующие мутации: F508del — 70 случаев; E92K, 1677delTA и dele 2,3 (21kb) — в 3 случаях каждая, W1282Х — 1 случай. У 144 пациентов (75,4%) удалось определить две патогенные мутации CFTR, у 41 пациента — 1 мутацию (21,5%), не было выявлено мутаций у 6 пациентов (3,1%). У 112 пациентов (58,6%) две патогенные мутации были выявлены с помощью панели для определения 8 наиболее частых мутаций CFTR (см. Пациенты и методы).

В 99% случаев по каждой мутации панели был получен однозначный результат типирования. В двух образцах (1% случаев) при определении одного из вариантов кривые плавления не соответствовали стандартным. В результате секвенирования прямым методом в данных образцах на участках гибридизации аллель-специфичных зондов были выявлены нецелевые однонуклеотидные замены (SNP) (рисунок). В 47 случаях, для которых патогенные мутации не были определены ПЦР-методом, было проведено исследование гена CFTR методом NGS. В итоге секвенирования у пациентов суммарно выявлено более 300 генетических вариантов, 24 из которых имеют потенциальное клиническое значение (учтены варианты, описанные в локус-специфичных базах данных как патогенные, либо нонсенс, либо варианты сдвига рамки считывания (табл. 2). Несколько вариантов отмечено более одного раза, наиболее часто (у 5 неродственных пациентов) зарегистрирована патогенная мутация p.Ser466Ter (rs121908805) в составе сложного аллеля (табл. 3).

Были выявлены четыре ранее не описанные мутации CFTR: c.4093delA/p.Lys1365Argfs и c.4078delG/p.Val1360Phefs (мутации сдвига рамки считывания), c.1132C>T/p.Gln378Ter и c.2455G>T/p.Glu819Ter (нонсенс-мутации) патогенного значения (табл. 4). Новые варианты выявлены в гетерозиготном состоянии в сочетании с одной из частых мутаций гена (табл. 3). Данные варианты CFTR зарегистрированы нами в аллель-специфичной базе данных платформы LOVD.

В двух образцах при верификации результатов высокопроизводительного секвенирования методом Сэнгера в экзоне 24 выявлена делеция, приводящая к сдвигу рамки считывания p.Ile1214Phefs (rs397508630).

В результате проведения расширенной ДНК-диагностики две и одна патогенные мутации определены у 178 пациентов и у 13 пациентов соответственно. Отметим, что наиболее часто встречающаяся в РФ мутация F508del (rs113993960) была выявлена у 139 пациентов из 49 регионов РФ. У четырех неродственных пациентов из Ингушетии и Чечни выявлена мутация 1677delTA (rs121908776). У трех из четырех пациентов из Чувашии в гомозиготном состоянии выявлена мутация E92K.

Доля пациентов с двумя «тяжелыми» мутациями CFTR (I–III классы CFTR [19]) составила 69,6%. Доля пациентов с одной или двумя «мягкими» мутациями (IV–V классы CFTR [19]) составила 8,4%, с одной или двумя мутациями «неопределенной клинической тяжести» — 22%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В исследованной группе пациентов выявлено 36 различных патогенных мутаций гена CFTR, большинство из них относится к распространенным в РФ вариантам [:lit_4, 8;]. F508del (rs113993960) — наиболее частый вариант в выборке как в целом, так и в группах пациентов из регионов с преобладанием русского населения. Частоты остальных мутаций выборки соответствуют данным по российской популяции больных муковисцидозом [4, 8]. 10 наиболее частых мутации выборки соответствует списку национально регистра [4]. Было отмечено преобладание мутации 1677delTA (rs121908776) у группы детей из регионов Северного Кавказа. У детей из Чувашии зарегистрирована характерная этническая мутация E92K (rs121908751). На основании полученных результатов исследованная группа детей может быть рассмотрена как репрезентативная выборка жителей РФ, больных МВ, результаты генотипирования которой позволяют пополнить информацию о генетическом разнообразии МВ в России.

Методами секвенирования выявлено 24 клинически значимых варианта CFTR (22 из которых минорные), из них 8 ранее не отмечены у пациентов российского регистра: p.Gln39Ter (rs397508168), p.Phe1286Ser (rs121909028), p.Ile1214Phefs (rs397508630), p.Trp1063Terfs, p.Glu819Ter, p.Gln378Ter, p.Val1360Phefs и p.Lys1365Argfs. Обнаруженные мутации согласно предсказательным программам in silico обусловливают образование укороченного белка МВТР и являются патогенными (класс мутаций I).

Эффективность выявления патогенных аллелей CFTR методом ПЦР для исследованной выборки составила 86,1% (при этом 1 или 2 патогенных мутации было выявлено в 96,9% случаев), показатель удовлетворяет требованиям, предъявляемым к эффективности диагностических панелей [19]. Однако принимая во внимание данные по генетической эпидемиологии МВ последних лет [4, 13], а также результаты расширенной диагностики исследованной выборки, диагностическая эффективность панели может быть повышена за счет включения вариантов p.Ser466Ter (rs121908805), p.Trp1282Arg (rs397508616) и p.Leu15Phefs (rs397508715). Технологическое решение, используемое для определения известных мутаций гена CFTR на основе метода ПЦР с «примыкающими зондами», при сравнении с альтернативными подходами (MLPA, RFLP) демонстрирует ряд преимуществ: все этапы исследования, включая анализ графиков кривых плавления, выполняются в одном приборе, не требуется постановка электрофореза. Программное обеспечение автоматически осуществляет трактовку полученных результатов. В то же время возможен визуальный контроль результатов по графикам кривых плавления, что позволяет регистрировать наличие полиморфизмов, расположенных близко к целевой мутации. Учитывая относительную простоту, возможности для оптимизации (сокращение набора пробирок с индивидуальными тестами при реализации варианта мультиплексной ПЦР) и автоматизации процесса, в технологии заключен потенциал высокопропускного метода ДНК-диагностики/скрининга частых наследственных заболеваний.

Эффективность расширенной ДНК-диагностики с применением методов секвенирования составила 95,4% (во всех случаях была выявлена хотя бы одна мутация патогенного значения). Причины невыявления мутаций могут быть связаны с ограничениями технологии NGS, кроме того, для повышения эффективности диагностики обычно требуется доработка панели, а также оптимизация алгоритмов анализа [20]. В частности, технология Ion Torrent не позволяет достоверно распознавать мутации внутри гомополимерных участков, например не могут быть установлены мутации CFTR по типу 2184insA (rs121908786). В нашей работе делеция аденина внутри участка TATTT[A/-] TTTTTTCT (мутация p.Ile1214Phefs (rs397508630)) была установлена после секвенирования данного фрагмента по Сэнгеру. Существенной проблемой для технологии являются также протяженные делеции и дупликации, распознавание гетерозиготного носительства которых требует применения специальных биоинформатических алгоритмов обсчета данных, а в случае крупных делеций — введения в панель дополнительных мишеней, захватывающих границы делеций [9], либо серий дополнительных мишеней, учитывающих популяционно частые варианты гена. На данный момент у больных МВ жителей РФ выявлено несколько вариантов крупных делеций, из которых наиболее распространенная CFTRdele 2,3 встречается с частотой 1,4–8% [8]. Достоверное определение гетерозиготного носительства делеции CFTRdele 2,3 с помощью метода NGS в нашем исследовании было возможно при добавлении дополнительных пар праймеров на границы делеции, в то время как оценка представленности прочтений при сравнении результатов секвенирования гомо-, гетерозигот и нормы по CFTRdele 2,3 оказалась ненадежным решением.

ВЫВОДЫ

По данным национального регистра больных МВ 30–35 мутаций CFTR представлены у пациентов с аллельной частотой не более 1%, в то же время, в сумме распространенные патогенные варианты составляют около 20% от всего аллельного разнообразия. Эффективная молекулярногенетическая диагностика МВ на практике может быть обеспечена при условии сочетания различных технологических подходов, например определения отдельных полиморфизмов методом ПЦР с последующим NGS негативных образцов. В настоящем исследовании 86,1% патогенных аллелей CFTR было выявлено с использованием панели для определения 24 генетических вариантов, ассоциированных с МВ, 10% идентифицировано методами секвенирования. Выявлено 8 минорных вариантов CFTR, до этого не отмеченных у жителей РФ, включая 4 новых патогенных мутации — p.Glu819Ter, p.Gln378Ter, p.Val1360Phefs и p.Lys1365Argfs.