Детекция бактериального обсеменения и токсинов, вырабатываемых патогенной флорой, в жидкой пробе чрезвычайно важна для оценки качества пищевых продуктов, воды и других сред. Общепризнанным методом детекции патогенов является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая, обладая высокой чувствительностью, представляет собой довольно длительную, трудоемкую и материалоемкую процедуру. Кроме того, зачастую важно определение в пробе не самих бактериальных клеток, а их метаболитов, в частности токсинов белковой природы, являющихся основным фактором патогенности. Поскольку с помощью ПЦР проводят детекцию нуклеиновых кислот, данный метод неприменим как для детекции бактериальных токсинов, так и для обнаружения некоторых специфических патогенов, например прионов.

В настоящее время используют классические методы детекции белков (в частности, токсинов) в жидкой пробе. Традиционные подходы, такие как вестерн-блот и иммунофлюоресцентный анализ (ИФА), сравнительно просты и имеют невысокую стоимость, но обладают низкой производительностью и требуют длительного времени. Они подходят для клинико-диагностических работ, но после дополнительной подготовки образца и использования ферментативных или флуоресцентных меток для амплификации специфического сигнала, что увеличивает материальные затраты и трудоемкость анализа.

Кроме того, разрабатываются более современные методы детекции, включающие электрохимический иммуноанализ [1–2], хемилюминесцентную визуализацию [3], флуоресцентную детекцию в потоке с помощью активированных микросфер из диоксида кремния [4] и электрохимический анализ на основе полимерных псевдоантител [5]. Важным преимуществом этих методов является многопараметричность анализа, т. е. возможность одновременной детекции различных аналитов в одном образце. В отличие от традиционных методов, данные подходы высокопроизводительны, но дорогостоящи и сложны в интерпретации, что делает их неподходящими для рутинной практики. Большая часть этих методов требует использования дополнительных меток, за исключением безметочного электрохимического анализа — чувствительного и элегантного подхода, который, однако, неприменим для многопараметрического исследования [6].

Чрезвычайно перспективен метод детекции с помощью поверхностного плазмонного резонанса [7], основанный на возбуждении падающим светом поверхностных плазмон-поляритонов на границе раздела «металл– диэлектрик». Этот чувствительный быстрый и безметочный метод не требует сложной предварительной подготовки образца. Антитела, специфичные к целевому белку, конъюгируются с поверхностью тонкой золотой пленки, и массоперенос, связанный со взаимодействием этих антител с растворимым антигеном, присутствующим в жидкой пробе, регистрируется как изменение показателя преломления поверхностного слоя жидкости вблизи поверхности золотой пленки.

I. Дизайн эксперимента

В настоящей работе предложен новый подход к выявлению бактериального обсеменения, основанный на детекции поверхностных волн на фотонном кристалле (ПВФК). ФК представляет собой материал, характеризующийся периодической модуляцией показателей преломления (ПП) в масштабе длины световой волны. Такие структуры поддерживают дальнодействующее распространение поверхностных оптических волн вдоль своей внешней поверхности. ПВФК используют в многочисленных оптических сенсорах [8–10]. Есть данные о том, что сенсоры, основанные на ПВФК, превосходят по чувствительности сенсоры на основе принципа поверхностного плазмонного резонанса [9]. С использованием ПВФК возможна детекция обоих видов поляризации (параллельной и перпендикулярной) световой волны, позволяющая регистрировать отдельно толщину поверхностного слоя и показатель преломления жидкой фазы, так что результат изменения параметров отраженного сигнала несет в себе информацию о факте взаимодействия (массопереноса) растворимого аналита с функционализированной поверхностью ФК вне зависимости от изменений показателя преломления вблизи этой поверхности.

Кроме того, важным преимуществом метода детекции с использованием ПВФК является возможность простой регенерации поверхности используемых подложек плазменной очисткой и последующей активации и конъюгации с новым распознающим белком. Эта возможность позволяет использовать одну и ту же подложку ФК бесконечное количество раз, а также готовить заранее активированные подложки ФК для конкретного эксперимента.

В настоящей работе проведено исследование взаимодействия полимерных микросфер, покрытых слоем полиэлектролита (отрицательно заряженной поли(акриловой) кислоты), с поверхностью ПВФК-биосенсора, покрытой положительно заряженным
поли(4-стиренсульфонатом) натрия. Поскольку микросферы диаметром 4,08 мкм можно рассматривать как модель бактериальной клетки, проведенные эксперименты демонстрируют принципиальную возможность детекции бактериальных клеток в жидкой пробе с помощью ПВФК-биосенсора.

Кроме этого, показана возможность детекции с помощью ПВФК-биосенсора бактериальных токсинов в жидкой пробе. В качества объектов для количественного анализа были выбраны экзотоксин A бактерии Pseudomonas aeruginosa и термолабильный токсин LT бактерии Escherichia coli.
Рассмотрим подробнее основные этапы разработки аналитического метода многопараметрической детекции биомаркеров и его использование для определения бактериальных токсинов.

II. Подготовительные этапы

1. Реагенты

В работе использовали следующие реагенты: хлорид натрия, > 99% (Sigma-Aldrich, S6191; США); этанол, 99,5% (Acros Organics, AC615090010; Бельгия); ацетон для ВЖХ, 99,8% (Acros Organics, 268310010; Бельгия); (3-аминопропил)триэтоксисилан (АПТЭС), 99% (Sigma- Aldrich, 440140; США); глутаровый альдегид, grade I, 25% в H2O (Sigma-Aldrich, G5882; США); натрия фосфат двухосновный гептагидрат, 98–102% (Sigma-Aldrich, S9390; США); натрия фосфат одноосновный моногидрат, ≥ 98% (Sigma-Aldrich, S9638; США); фосфатно-солевой буфер (PBS) в таблетках (Sigma-Aldrich, P4417; США); белок A, United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (Sigma-Aldrich, 1578805; США); поли(4-стиренсульфонат) натрия (PSS), средняя мол. масса 70 000 (Sigma-Aldrich, 243051; США); поли(аллиламин)гидрохлорид (PAH), средняя мол. масса 50 000 (Sigma-Aldrich, 283223; США); поли(акриловая) кислота (PAA), средняя мол. масса 130000 (Sigma-Aldrich, 181293; США); антитело против экзотоксина A бактерии Pseudomonas aeruginosa, кроличье, цельная антисыворотка (Sigma-Aldrich, P2318; США); экзотоксин A бактерии Pseudomonas aeruginosa, лиофилизованный порошок (Sigma-Aldrich, P0184; США); термолабильный токсин LT бактерии Escherichia coli, субъединица B, рекомбинантный, > 90%, лиофилизованный порошок (Sigma-Aldrich, E8656; США); бычий сывороточный альбумин (БСА), лиофилизованный порошок, кристаллический, ≥ 98,0% (GE) (Sigma-Aldrich, 05470; США).

Кроличьи антитела против термолабильного токсина LT были любезно предоставлены заведующим лабораторией трансляционной биомедицины ФГБУ НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, А. П. Ткачуком.

2. Биосенсор на основе детекции поверхностных волн в фотонном кристалле

В работе использовали ПВФК-биосенсор EVA 2.0 [10]. В биосенсоре использовали следующую структуру одномерного ФК: субстрат/(LH)₃L'/вода, где L — слой SiO₂ толщиной d₁ = 186,4 нм, H — слой Ta₂O₅ с толщиной d₂ = 115,2 нм и L' — слой SiO₂ с толщиной d3 = 776,8 нм.
Семислойную структуру (начинающуюся и заканчивающуюся слоями SiO₂) создавали методом магнетронного напыления. Призма и стеклянная пластина были изготовлены из стекла BK-7. Показатели преломления субстрата, SiO₂, Ta₂O₅ и воды при λ = 632,8 нм составляли n₀ = 1,515; n₁ = n₃ = 1,47; n₂ = 2,07 и n_e = 1,332 соответственно.
Данные, полученные с использованием биосенсора, обрабатывали в программе Origin 8.1 (OriginLab; США).

3. Микросферы

Латексные микросферы диаметром 4,08 мкм (MF-COOH-AR421 Carboxyl-modified Melamine Resin-Research Particles, 10 мл 10% w/v aq. suspension (microParticles GmbH; Германия)) покрывали чередующимися слоями противоположно-заряженных полиэлектролитов PAH и PSS путем послойного осаждения [11] по схеме PAH/PSS/ PAH/PSS/PAH, после чего нанесли завершающий слой PAA.

4. Подготовка кремниевой подложки фотонного кристалла для эксперимента с микросферами

Кремниевую подложку ФК перед экспериментом выдерживали в ультрафиолетовом очистителе не менее 30 мин.
К подготовленной подложке присоединяли измерительную микрофлюидную ячейку. Для прокачивания жидкости через измерительную ячейку использовали перистальтический насос. После сборки измерительной ячейки для активирования поверхности подложки ФК аминогруппами через нее пропускали водный раствор АПТЭС (1%) в течение 5 мин, при скорости потока 100 мкл/мин. После этого через измерительную ячейку пропускали поочередно, в течение 5 мин каждый, растворы PSS и PAH в 0,5 М NaCl с концентрациями 100 мг/мл. При смене растворов ячейку промывали 0,5 M NaCl. Для равномерного покрытия поверхности подложки последовательно наносили три бислоя PSS/PAH. После нанесения последнего слоя PAH, среду поменяли на натрий-фосфатный буфер концентрацией 100 мМ (pH 8,0), содержащий 0,5 М NaCl., Описанные выше микросферы суспендировали в том же буфере в концентрации 10⁶ микросфер на 1 мл. Суспензию микросфер пропускали через измерительную ячейку при скорости 100 мкл/мин в течение 10 мин.

5. Подготовка кремниевой подложки фотонного кристалла для экспериментов с белками

Фотонно-кристаллическую подложку выдерживали в ультрафиолетовом очистителе по 30 мин для очистки каждой стороны ФК и затем обрабатывали по 5 мин ультразвуком последовательно в ацетоне, этаноле и трижды в воде milliQ, после чего сушили при 70 °C. Очищенную подложку инкубировали в 1% растворе АПТЭС в ацетоне в течение 16 ч, чтобы функционализировать поверхность подложки аминогруппами, после чего прокаливали при 120 °С в течение 90 мин. Полученные аминированные подложки могут храниться не менее месяца без потери своих свойств. Перед измерением подложку обрабатывали 2,5% раствором глутарового альдегида в натрий-фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 30 мин при слабом перемешивании. При подготовке подложек не использовали декстран или какой-либо другой каркасный полимер.

К подготовленной подложке присоединяли проточную ячейку. Скорость потока составляла 30 мкл/мин. Чтобы функционализировать поверхность подложки специфическими распознающими антителами, сначала через проточную ячейку пропускали раствор белка А (50 мкг/мл) в PBS до стабилизации сигнала, а затем промывали ячейку раствором PBS в течение 2 мин. После образования химически связанного с поверхностью монослоя белка A, через проточную ячейку пропускали раствор антител (50 мкг/мл) до достижения стабилизации сигнала. Наличие на поверхности подложки белка А, связывающего Fc-фрагмент иммуноглобулина, обеспечивало единообразную ориентацию связанных с ним молекул антител. Затем непрореагировавшие участки поверхности подложки блокировали 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS-буфере. После этого проточную ячейку промывали раствором PBS до выхода сигнала на плато. На последнем этапе, исследуемый образец пропускали через ячейку со скоростью 30 мкл/мин.

III. Осаждение микросфер, покрытых слоем полиэлектролита, на подложку, покрытую слоем противоположно заряженного полиэлектролита

Последовательное осаждение слоев полиэлектролитов на активированную АПТЭС поверхность подложки вызывает ступенчатое увеличение толщины поверхностного слоя (рис. 1А). Наблюдаемые значения толщины первых слоев PSS и PAH меньше последующих, что свидетельствует о неполном покрытии поверхности первыми слоями полиэлектролитов.
Связывание на поверхности ФК микросфер, покрытых PAA, вызывает медленное увеличение наблюдаемой толщины поверхностного слоя, отсутствующее при пропускании буферного раствора, не содержащего микросфер.
Отметим, что кинетика связывания микросфер имеет линейный характер (R2 = 0,996), а не зависимость типа «доза–ответ» (рис. 1Б). Это можно объяснить низкой концентрацией микросфер, далекой от насыщения поверхности подложки (площадь поверхности подложки, взаимодействующая с раствором, в соответствии с конструкцией измерительной ячейки, равна 1 см²). Площадь, занимаемая одной микросферой на поверхности подложки, не превышает 13 мкм², т. е. для полного покрытия поверхности необходимо ~10⁷ микросфер. Можно предположить, что толщина монослоя микросфер должна быть равна диаметру микросферы, т. е. 4,08 мкм. Соответственно, связывание 106 микросфер должно соответствовать наблюдаемой толщине поверхностного слоя в 400 нм. Однако при малых значениях толщины можно измерить только оптическую толщину слоя, т. е. физическую толщину, умноженную на показатель преломления. Приняв показатель преломления равным 1,56 [10], получим ожидаемую толщину в 624 нм, которая соответствует наблюдаемой. Зная скорость потока, скорость увеличения толщины поверхностного слоя и концентрацию микросфер, можно приблизительно оценить количество связанных микросфер. За 10 мин пропускания 10⁶ микросфер поверхностный слой увеличивается на 0,57 нм, что соответствует связыванию приблизительно 1 × 10³ микросфер. Таким образом, наблюдается связывание около 0,001 части от общего количества прокачиваемых микросфер.

IV. Детекция бактериальных токсинов

Для демонстрации детекции белковых токсинов в растворе с помощью ПВФК-биосенсора выбрали два токсина — экзотоксин бактерии Pseudomonas aeruginosa и термолабильный токсин бактерии Escherichia coli.
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) — грамотрицательная подвижная палочковидная бактерия размерами 1–5 мкм на 0,5–1 мкм, обитает в воде и почве, условно патогенна для человека и является возбудителем нозокомиальных инфекций. Экзотоксин A бактерии состоит из трех доменов: связывающего, транспортного и катализирующего. Его цитотоксическое действие обусловлено катализирующим доменом, который ингибирует синтез белков путем АДФ-рибозилирования фактора элонгации EF-2 [12–13]. Детекция экзотоксина A является важной диагностической задачей, для решения которой применяют ПЦР (определение соответствующего гена) [14], ИФА (детекция присутствия экзотоксина) и другие аналитические методы.
Escherichia coli (кишечная палочка) — грамотрицательная палочковидная бактерия, обитающая в нижних отделах кишечника теплокровных животных. Энтеротоксигенные штаммы Escherichia coli способны вызывать диарею за счет продукции токсинов, в частности термолабильного токсина LT. Токсин состоит из двух субъединиц: каталитически активной субъединицы A и субъединицы B, отвечающей за связывание с клеткой [15]. Экспрессия LT не только стимулирует секрецию, но и способствует связыванию бактерий с клетками эпителия [16].

Для детекции токсинов была разработана специальная система измерительных ячеек с одним, двумя или четырьмя каналами. Стеклянная камера с одной, двумя или четырьмя полостями присоединяется к чувствительной поверхности подложки из оксида кремния, которую после химической активации функционализируют распознающими молекулами. Амплитуда сигнала, регистрируемого при взаимодействии антиген–антитело на поверхности сенсора, прямо пропорциональна количеству связывающих сайтов на поверхности. Непрореагировавшую поверхность сенсора покрывают БСА, чтобы избежать неспецифического сигнала.
У ячеек с двумя или четырьмя каналами можно использовать один из каналов в качестве отрицательного контроля; его поверхность вместо антител покрывают БСА.

Раствор экзотоксина А бактерии Pseudomonas aeruginosa с концентрацией 50 мкг/мл в буфере PBS пропускали через измерительную ячейку со скоростью 100 мкл/мин (рис. 2). Полученная кривая аналогична сенсограмме поверхностного плазмонного резонанса и следует той же кинетике [17]. Связывание белка с поверхностью сенсора вызывает стремительный рост толщины поверхностного слоя, который через некоторое время достигает плато. Плато соответствует стационарному состоянию, когда скорости адсорбции и десорбции равны. Кинетическая кривая может быть аппроксимирована моделью адсорбции Лэнгмюра. Теоретически предсказано, что массовый предел детекции с помощью ПВФК составляет 70 фг/мм2 зондируемого участка поверхности сенсора, что существенно превышает чувствительность метода поверхностного плазмонного резонанса [18]. На практике, однако, несмотря на небольшой уровень шума, минимальная концентрация экзотоксина А, которая могла быть определена в эксперименте, составила 30 мкг/мл.
На сенсограмме детекции термолабильного токсина LT (50 мкг/мл в PBS) массовый предел детекции составил 10 мкг/мл (рис. 3).

Следует отметить, что в эксперименте работали с цельной антисывороткой. Использование аффинно- очищенных антител, безусловно, позволит достичь предела чувствительности, близкого к рассчитанному [18] и существенно превышающего чувствительность метода поверхностного плазмонного резонанса.

V. Кинетика связывания бактериальных клеток c поверхностью сенсора, функционализированной антителами

Верхний предел скорости связывания микросфер по формуле Смолуховского–Левича [19] составляет 3,46 частиц/см2; так как рабочая площадь поверхности сенсора в данном случае составляет 1 см2, этот результат соответствует связыванию около 2000 частиц за 10 мин. Можно сделать вывод, что скорость связывания микросфер, покрытых полиэлектролитом, с поверхностью биосенсора, покрытого слоем противоположно заряженного полиэлектролита, в данной системе близка к предельно возможной. Вероятно, значение скорости не достигает максимума, так как связывание микросферы с поверхностью не происходит мгновенно, и в реальных условиях кинетика определяется не только диффузией микрочастиц, но и их взаимодействием с поверхностью. Поэтому можно предположить, что кинетика связывания бактериальных клеток c поверхностью сенсора, функционализированной антителами, может отличаться от продемонстрированной на микросферах.
Следует отметить, что изменение состава раствора, содержащего микросферы, не вызывает принципиальных изменений в кинетике связывания.

VI. Оптимизация детекции бактериальных токсинов

Полученные результаты показывают принципиальную возможность проведения многопараметрической детекции бактериальных токсинов с помощью ПВФК-биосенсора. Предел детекции токсинов можно снижать: (1) использованием аффинно-очищенных антител к токсинам; сродство антител к антигенам крайне важно, так как каждая неаффинная молекула уменьшает полезную площадь чувствительной поверхности сенсора; (2) изменением параметров измерительной ячейки [20]; (3) усилением сигнала с помощью золотых наночастиц: поскольку интенсивность сигнала от ПВФК зависит от массопереноса, использование в качестве дополнительной метки специфических антител, распознающих стерически удаленный эпитоп целевого белка и конъюгированных с коллоидным золотом, позволит значительно усилить ответ при той же концентрации детектируемого аналита [21–22].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показана принципиальная возможность детекции в жидкой пробе микрочастиц, соответствующих по размерам бактериальной клетке, с помощью детекции ПВФК. Полученные результаты могут быть полезны для разработки протоколов детекции бактериальных клеток в реальном времени в проточном режиме. Продемонстрирована возможность многопараметрической детекции бактериальных токсинов белковой природы — экзотоксина A бактерии Pseudomonas aeruginosa и термолабильного токсина LT бактерии Escherichia coli. Полученные результаты позволят разработать быстрые и доступные по стоимости методы детекции бактериального обсеменения пищевых продуктов и воды, а также диагностики бактериальных инфекций путем обнаружения бактерий и их метаболитов в образцах биологических жидкостей.