Рак молочной железы (РМЖ) представляет собой одну из наиболее распространенных форм злокачественных новообразований, уступая лишь раку легкого и колоректальному раку. Заболеваемость РМЖ имеет тенденцию к росту во многих странах мира [1–4]. По этой причине ведущими задачами являются раннее выявление патологии и скрининг РМЖ.
Гены-супрессоры BRCA1 и BRCA2 играют важную роль в регуляции сигнальных путей, связанных с функционированием систем репарации ДНК. Мутации в этих генах связаны с повышенным риском развития РМЖ и некоторых других форм злокачественных опухолей.
Значительное количество мутаций, возникающих в опухолях, является соматическим и играет важную роль как в патогенезе спорадического РМЖ, так и в развитии de novo резистентности к противоопухолевым лекарственным препаратам. Спорадические формы рака выявляют в среднем в 70–80% случаев, тогда как лишь 10% общего числа заболевших имеют наследуемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2 [5].
На сегодняшний день одной из актуальных задач онкогенетики являются разработка и совершенствование подходов для эффективного выбора противоопухолевых препаратов, учитывающих молекулярно-генетические особенности развития опухолей.
Целью работы было определение спектра мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при РМЖ с применением технологии высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Материал исследования. Клиническая характеристика больных

Для проведения исследования была собрана коллекция образцов опухолей 66 пациенток со злокачественными новообразованиями молочной железы, проходивших стационарное лечение в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н. Н. Блохина и ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» МЗ РФ (Москва). Средний возраст больных составил 52,5 ± 9,7 лет. Критерии включения в исследование: возраст от 18 до 70 лет, женский пол, наличие клинически верифицированного диагноза РМЖ. Критерии исключения: наличие других форм новообразований в анамнезе, беременность. Стадию РМЖ устанавливали согласно системе классификации TNM [6]. В исследовании принимали участие пациентки со стадиями T1–3N0– 3M0–1.

Работу проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности. Для проведения исследования было получено разрешение Комитета по медицинской этике при ООО «Генотек» (протокол № 5 от 17 января 2018 г.). От всех пациенток получены информированные согласия на проведение исследования. Основные клинические характеристики больных представлены в табл. 1.

Выделение ДНК и контроль качества. Секвенирование панели онкогенов

Геномную ДНК выделяли из образцов опухолевой ткани с использованием набора реагентов DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen; США) согласно протоколу производителя. Измерение концентрации полученных после выделения препаратов ДНК проводили на флуориметре Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific; США). Дополнительно качество образцов ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-м агарозном геле с добавлением этидиум бромида.
Библиотеки фрагментов ДНК готовили с использованием набора реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs; США). Баркодирование библиотек осуществляли с помощью ПЦР и двух наборов реагентов: NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina и NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1, New England Biolabs; США). Для контроля качества полученных ДНК-библиотек проводили измерения на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies; США), используя набор реагентов High Sensitivity Kit в соответствии с протоколом компании- производителя.
Для обогащения кодирующих регионов генома опухоли использовали набор MYbaits Onconome KL v1.5 Panel (Mycroarray; США). Анализ проводили на высокопроизводительном геномном секвенаторе HiSeq 2500 (Illumina; США) методом парных прочтений участков длиной 100 нуклеотидов. Подготовку образцов и запуск осуществляли согласно протоколам Illumina.

Биоинформатическая обработка NGS-данных

Для биоинформатической обработки полученных при секвенировании NGS-данных применяли ранее разработанный алгоритм [7, 8]. На начальном этапе проводили оценку качества ридов, полученных при секвенировании ДНК с помощью программного обеспечения Cutadapt и картировали на референсный геном hg19 (GRCh37.p13) с помощью инструмента BWA (Burrows-Wheeler Aligner). Парные риды удаляли, используя специализированную команду rmdup в составе пакета программ SAMtools. Для обнаружения мутаций в составе массива NGS-данных применяли MuTect, при этом в качестве значимых вариантов рассматривали последовательности ДНК, число покрытий которых при секвенировании было не менее 12.
Уровень представленности мутации в образце определяли как долю (%) ридов в точке, которые поддерживают мутацию. Функциональный эффект обнаруженных мутаций оценивали с помощью базы данных ActiveDriverDB [9]. Визуализацию мутаций, оказывающих влияние на кодируемый белок, выполняли с помощью программы ProteinPaint [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами был проведен анализ наличия мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в образцах ДНК опухолей РМЖ (n = 66) с применением технологии высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina. В результате биоинформатической обработки полученных NGS-данных мутации в генах BRCA1 и BRCA2 найдены у 39 (59,1%) из 66 пациентов с РМЖ. Всего в результате исследования было обнаружено 78 уникальных генетических вариантов, из них 30 мутаций в гене BRCA1 и 48 мутаций в гене BRCA2. Среди всех мутаций 70 обнаруженных вариантов идентифицированы как новые мутации (89,7%). Список всех обнаруженных генетических вариантов представлен в табл. 2.

По результатам анализа, наиболее высокая частота отмечена для мутаций 17:41246746:T>C в гене BRCA1 (52%) и 13:32914688:G>T в гене BRCA2 (47%). Среди всех образцов наиболее часто встречалась мутация 13:32910800:A>C в гене BRCA2, идентифицированная в 10,7% (n = 3/28) опухолей, несущих мутации BRCA2. Мутации в обоих генах BRCA1 и BRCA2 обнаружены у 11 пациентов с РМЖ (16,7%; n = 66).
На основе аннотации по базам данных обнаружено 33 мутации (42,3%), влияющие на последовательность кодируемого белка, из них 16 в гене BRCA1 и 17 в гене BRCA2. Мутации, оказывающие влияние на сайты посттрансляционной модификации белков (PMT-мутации), представлены на рисунок.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Персонализированная таргетная терапия находит все более широкое применение в современной онкологии. Поэтому разработка высокочувствительного и экономически эффективного подхода для доступной рутинной диагностики опухолей является одной из приоритетных задач.
В настоящее время золотым стандартом для обнаружения мутаций принято считать секвенирование методом Сенджера, однако его диагностические возможности ограничены по сравнению с более современными системами для высокопроизводительного генетического анализа. Опухолевые клетки гистологически и генетически гетерогенны, что также создает преимущества для применения технологий на основе NGS, позволяющих разрабатывать эффективные биоинформатические алгоритмы как для детекции генетических вариантов в составе парных образцов опухолей и нормальной ткани, так и в составе единичных биопсий, содержащих фракцию ДНК нормальных клеток.

Мутации ключевых онкогенов BRCA1 и BRCA2 при РМЖ — одни из наиболее частых и значимых молекулярных аберраций, анализ которых представляет интерес как для оценки риска развития опухоли, клинического прогноза при РМЖ, так и для предсказания эффективности применения противоопухолевых препаратов.

Ген BRCA1 был идентифицирован в 1994 г. методом позиционного клонирования на длинном плече 17-й хромосомы. Второй ген — BRCA2 был картирован и выделен на хромосоме 13q. Гены BRCA1 и BRCA2 являются супрессорными, характеризуются аутосомно-доминантным типом наследования и высокой пенетрантностью. Молекулярные исследования BRCA1 и BRCA2, проведенные в последние годы, продемонстрировали наличие широкого спектра мутаций этих генов [5].
Международная база данных COSMIC [11] содержит свыше 900 соматических кодирующих мутаций гена BRCA1 и свыше 1400 кодирующих мутаций гена BRCA2. Значительная их часть приводит к структурным перестройкам, изменяющим функцию белковых продуктов, что снижает способность систем репарации к эффективному восстановлению повреждений ДНК. Многие мутации BRCA1/BRCA2 относятся к миссенс-мутациям, изменяющим кодирующую последовательность и приводящим к замене одного функционального кодона на другой.

В результате проведенного нами биоинформатического анализа NGS-данных, полученных при исследовании опухолей РМЖ, было идентифицировано 78 уникальных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Большая часть мутаций обнаружена в гене BRCA2. По данным литературы, гены BRCA1 и BRCA2 значительно различаются по частоте мутаций [5].

Дальнейший анализ с применением базы данных ActiveDriveDB показал, что значительная часть генетических вариантов оказывает функциональный эффект на сайты посттрансляционной модификации кодируемых белков (см. рисунок). Всего в ходе исследования было обнаружено 33 таких мутации, значительная доля из них ранее не аннотирована в базах данных. Для подтверждения обнаруженных в работе патогенных вариантов и статуса мутаций необходима верификация результатов исследования с применением процедуры секвенирования по Сенджеру с использованием образцов нормальной ткани.

ВЫВОДЫ

Применение высокопроизводительного таргетного секвенирования является наиболее перспективным подходом для молекулярного профилирования опухолей с целью клинического применения. Комплексный анализ мутаций с применением NGS в генах BRCA1 и BRCA2 при РМЖ позволяет идентифицировать большее число мутаций, в том числе генетических вариантов с низкой частотой мутантного аллеля, а также генетических вариантов в образцах биопсии с низким содержанием опухолевых клеток. Подходы на основе NGS, позволяющие обнаруживать мутации в составе всей кодирующей последовательности BRCA1 и BRCA2, помогут эффективнее выявлять пациентов, которым может быть назначена адекватная терапия с применением таргетных противоопухолевых препаратов.