Явление гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), заключающееся в значительном усилении интенсивности полос в спектрах комбинационного рассеяния (КР) при нахождении интересующих молекул вблизи наноструктурированной поверхности металла, в течение последних десятилетий привлекает внимание исследователей, разрабатывающих биоаналитические платформы и методики. Интерес к данному методу детектирования обусловлен простотой его аппаратного оформления, экспрессностью, возможностью локального анализа, потенциальной мультиплексностью и возможностью достижения высокой чувствительности. Используемые металлические наноструктуры, называемые ГКР-субстратами, разделяют на два основных класса: наноструктуры на твердых поверхностях и коллоидные растворы (золи) металлических наночастиц.

Первые ГКР-спектры бактерий с использованием возбуждающего лазера с длиной волны 514,5 нм наблюдали на примере Escherichia coli и Bacillus megaterium [1]. Вскоре было выявлено, что при использовании длин волн возбуждения (ДВВ) 488 и 514,5 нм ГКР-спектры различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также выделенных клеточных мембран практически не отличаются друг от друга и представляют собой ГКР- спектр рибофлавина в восстановленной или окисленной форме [2–4]. Благодаря перекрыванию этих ДВВ с полосой поглощения рибофлавина реализуются условия резонансного усиления его спектра [3]. Рибофлавин в форме различных кофакторов окислительно- восстановительных ферментов и электрон-транспортных белков локализован в мембранах бактериальных клеток, что обеспечивает его близость к поверхности металла как в случае адсорбции клеток на твердых ГКР-субстратах, так и при адсорбции или синтезе металлических наночастиц на поверхности клеток [3, 4]. С биоаналитической точки зрения это означает, что использование коротковолновых лазеров (488 и 514,5 нм) не позволяет проводить дискриминацию/идентификацию бактерий.

В то же время при использовании длинноволновых источников возбуждения, прежде всего 785 нм, в ГКР- спектрах бактериальных клеток отсутствуют характерные полосы рибофлавина. Более того, спектры разных видов, а в ряде случаев и штаммов бактерий различаются между собой, а также между нативными и инактивированными препаратами одного штамма [5–7]. Этот факт позволил уже в середине 2000-х гг. выдвинуть гипотезу о возможности детектирования и дискриминации бактериальных видов/штаммов на основе их ГКР-спектров при данной ДВВ. Такой подход можно было бы с успехом применять для быстрого обнаружения и типирования патогенных бактерий в клинических образцах, пищевых продуктах, объектах окружающей среды. Однако молекулярная природа регистрируемых спектров на протяжении длительного времени оставалась неясной. По аналогии с коротковолновыми лазерами, предполагалось, что источниками полос служат молекулы, локализованные в клеточной оболочке бактерий: слизистом слое, капсуле, клеточной стенке или мембране. Предложения считать источником полос N-ацетил-D-глюкозамин [6], аминокислотные остатки, пептиды, простетические группы белков, фосфолипиды, метаболиты (например, глюкозу или ацетоуксусную кислоту), ДНК и ее компоненты аденин и гуанин [5, 7–13] были несостоятельны, так как ограничивались интерпретацией отдельных полос, но не всего спектра в целом, что вызывало сомнения в корректности таких предположений. В отсутствие четкой молекулярной интерпретации в данной научной области в течение длительного времени главенствовал формальный математический подход, основанный на снижении размерности экспериментальных данных (спектров) при помощи метода главных компонент с последующим использованием различных модификаций дискриминантного и кластерного анализа с целью демонстрации возможности различать бактерии разных родов, видов или штаммов на основании их ГКР-спектров [6, 12–15].

В 2016 г. было убедительно показано, что источником ГКР-спектров всех 10 исследованных бактериальных препаратов при ДВВ 785 нм являются 6 пуриновых производных (аденин, гуанин, аденозинмонофосфат, гипоксантин, ксантин и мочевая кислота), выделяемых бактериями во внеклеточную среду [16]. Такая интерпретация кардинально сужает применимость ГКР- спектров бактерий для их идентификации/дискриминации, поскольку различия в спектрах вызваны не широким разнообразием молекул на поверхности клеток, а всего лишь 6 секретируемыми клетками пуриновыми производными. Было, например, показано, что ГКР-спектр мутанта E. coli с неактивным геном аденозиндезаминазы и, как следствие, не содержащего гипоксантин, гораздо ближе к спектру Staphylococcus aureus, нежели к спектру родительского штамма E. coli. Такие результаты были получены для ДВВ 785 нм и ГКР-субстратов в виде агрегированных золотых наночастиц, нанесенных на твердую поверхность и покрытых тонким слоем диоксида кремния. Целью нашей работы было проверить данные выводы, во-первых, на принципиально ином типе ГКР- субстратов, а именно золях серебряных наночастиц, и, во-вторых, изучить молекулярную природу ГКР-спектров бактерий при ДВВ 532 нм, являющейся промежуточной между областью доминирования рибофлавина (488, 514.5 нм) и инфракрасной областью (785, 1064 нм).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве модельного штамма использовали E. coli DH5α (Thermo Fisher Scientific; США). Культивирование клеток проводили на жидкой питательной среде, состоящей из 10,0 г/л триптона (Difco; США), 5,0 г/л дрожжевого экстракта (Difco; США), 10,0 г/л NaCl х. ч. (Химмед; Россия) с рН 6,8, при 37 °C в течение 14–16 ч до начала стационарной фазы роста. В литературе подчеркивается важность тщательной отмывки клеток от компонентов культуральной среды [17], поэтому использовали следующую процедуру: клетки осаждали при 8000 об./мин в течение 7 мин с использованием центрифуги Beckman J-2-21 (Beckman Coulter; США). Осадок отмывали равным объемом 0,9% раствора NaСl. Процедуру осаждения-промывки повторяли 2 раза. Полученную биомассу разбавляли 0,9% раствором NaСl в объеме, необходимом для получения суспензии с концентрацией клеток 1 • 10⁸ кл./мл. Концентрацию определяли по мутности суспензии клеток при длине волны 540 нм.

Частичную инактивацию бактерий проводили путем нагрева суспензий клеток при 70 °С или 90 °С в течение 1 ч на водяной бане. В качестве показателя степени инактивации измеряли концентрацию внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом с использованием набора реагентов и калибровочных стандартов (Люмтек; Россия).
В качестве ГКР-субстрата использовали золь наночастиц серебра (НЧС), получаемый путем восстановления нитрата серебра гидрохлоридом гидроксиламина с использованием AgNO₃ ч. д. а. (Sigma-Aldrich; США), NH2OH•HCl ч (Prime Chemicals Group; Россия), NaOH ч. д. а. (Мосреактив; Россия). В соответствии с рекомендациями авторов оригинальной методики [18] раствор нитрата серебра приливали к щелочному раствору гидроксиламина, конечные концентрации реагентов в смеси составляли 1 мМ AgNO₃, 1,5 мМ NH₂OH•HCl, 3 мМ NaOH. Полученные золи использовали не более 3 дней с момента получения.
Характеризацию НЧС проводили при помощи регистрации спектров поглощения в УФ-видимой области (300–750 нм) на кюветном спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu; Япония), а также с использованием метода анализа траекторий наночастиц на приборе Nanosight LM10 HS-BF (Nanosight Ltd; Великобритания).

Для всех бактериальных препаратов, как нативных, так и инактивированных, ГКР-спектры регистрировали в день получения препарата. До измерения препараты хранили при +4 °С. Непосредственно перед измерением аликвоту препарата дважды центрифугировали при 3700 об./мин в течение 5 мин на центрифуге Biofuge A (Heraeus Sepatech; Германия) и промывали равным объемом деионизированной воды. Полученную суспензию клеток в воде смешивали с золем НЧС в соотношении 1 : 1, инкубировали 1 мин и добавляли раствор NaCl в конечной концентрации 40 мМ для агрегации наночастиц и усиления ГКР-сигнала. Полученный образец в количестве 260 мкл переносили в лунку алюминиевого планшета, использовавшегося для минимизации фонового сигнала и улучшения теплоотвода от измеряемого образца. С каждого образца регистрировали 3–4 повторных спектра, перемешивая образец в лунке пипетированием между измерениями.

При изучении динамики изменения спектров ГКР суспензии E. coli со временем 5 мл препарата были однократно переведены в воду по описанной выше методике. Полученный препарат хранили при +4 °С и в течение 4 ч отбирали аликвоты для регистрации ГКР-спектров.
Для получения фильтрата суспензии клеток использовали медленное фильтрование через шприцевую фильтрующую насадку SFNY030022S (Membrane Solutions; США) диаметром 30 мм и размером пор 0,22 мкм.

Для регистрации спектров КР при ДВВ 785 нм использовали КР-спектрометр innoRam BWS445(B)-785S (BWTek; США) с диапазоном измерения 64–3011 см^-1, разрешением 4 см^-1, диодным лазером 785 нм, объективом ×20 PL L 20/0.40. Условия получения спектров: мощность луча на образце — 42 мВт, время накопления сигнала — 5 с, количество автоматически усредняемых повторов — 20.
Для регистрации спектров при ДВВ 532 нм использовали КР-спектрометр iRaman BWS415-532S (BWTek; США) с диапазоном измерения 174–4001 см^-1, разрешением 4 см^-1, диодным лазером 532 нм, объективом ×20 PL L 20/0.40. Условия получения спектров: мощность луча на образце — 20 мВт, время накопления сигнала — 5 с, количество автоматически усредняемых повторов — 20.

Обработку полученных спектров проводили с использованием программы OPUS 7.0 (Bruker Optik GmbH; Германия). Обработка включала в себя: выделение области спектра в диапазоне 500–1800 см^-1, вычитание базовой линии с использованием встроенного в программу инструмента Background correction. Определение положения и интенсивности полос проводили без дополнительного сглаживания спектров. При графическом представлении спектров их сглаживали инструментом Smooth с использованием рамки шириной 9 см^-1. При необходимости графической демонстрации качественных различий в серии спектров проводили их векторную нормировку, при необходимости сравнения интенсивностей спектров нормировку не использовали.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Золи НЧС, получаемые гидроксиламиновым методом [18], завоевали широкую популярность в качестве ГКР- субстрата благодаря простоте и воспроизводимости получения, а также высокой интенсивности регистрируемых с их помощью ГКР-спектров различных аналитов, в том числе бактериальных клеток [19–21]. Полученные нами препараты золей НЧС имеют желто-коричневый цвет, прозрачны и не содержат осадка. Они демонстрируют интенсивную широкую полосу поглощения в ближней УФ — синей области, соответствующую локализованному плазмонному резонансу НЧС с максимумом при 407–409 нм и поглощением в максимуме, меняющемся в пределах от 16,5 до 18 (с учетом разведения деионизованной водой в 30 раз при измерении). Среднечисловой гидродинамический диаметр частиц, измеренный методом анализа траекторий наночастиц для трех независимых партий НЧС, составил 43 ± 2 нм; суммарная концентрация частиц равна (8,0 ± 1,7) • 10¹¹ частиц/мл. Полученные золи НЧС при агрегации раствором 40 мМ NaCl не имеют собственного ГКР- спектра при обоих значениях ДВВ, за исключением широкой низкоинтенсивной полосы материала планшета (алюминия) в области 1200–1700 см^-1. Эту полосу можно полностью удалить в виде базовой линии при обработке спектров.

Для изучения повторяемости ГКР-спектров нативных E. coli при ДВВ 785 нм были проведены: а) повторные измерения одного и того же образца, подготовленного для ГКР из одной аликвоты суспензии бактерий; б) измерения разных аликвот одного и того же препарата бактерий как с одним и тем же препаратом НЧС, так и с разными; в) измерения независимо культивированных и выделенных препаратов E. coli с одним и тем же препаратом наночастиц. В целом, измерения одного и того же бактериального препарата демонстрируют хорошую повторяемость (рис. 1А). В то же время ГКР-спектры независимых бактериальных препаратов подвержены значительным вариациям (рис. 1 Б). Наибольшие различия наблюдаются в областях: 508–532, 655, 730–734, 958, 1450, 1570–1576 см^-1.

При исследовании динамики изменения ГКР-спектров E. coli при хранении в воде при +4 °С на временном интервале 4 ч (рис. 1 В) с течением времени наблюдали медленный рост общей интенсивности спектра с изменением соотношения интенсивностей отдельных полос. Например, отношение I₇₃₀ / I₆₅₅ = 1,2 оставалось постоянным для всех значений времен, а отношение I₁₃₂₅ / I₆₅₅ монотонно снижалось от начального значения, равного 1,6, до 1,0 при 4 ч хранения.

С целью изучения локализации молекул, ответственных за формирование ГКР-спектров, было проведено сравнение ГКР-спектра нативного препарата E. coli в воде с фильтратом (0,22 мкм) того же препарата (рис. 1 Г). Учитывая продемонстрированные ранее медленные изменения, спектры аликвот исходной суспензии клеток были зарегистрированы по времени как до, так и после проведения фильтрования и регистрации спектров фильтрата. Все полосы спектра клеточной суспензии присутствовали и в спектре фильтрата. Более того, общая интенсивность спектра фильтрата была значимо выше.

Для ответа на вопрос, являются ли наблюдаемые ГКР-спектры признаком наличия жизнеспособных клеток E. coli или для их появления достаточно инактивированной бактериальной биомассы, было проведено сравнение ГКР-спектров нативных клеток и инактивированных нагреванием при 70 °С или 90 °С в течение 60 мин (рис. 2). Для всех трех препаратов была также измерена остаточная концентрация внутриклеточного АТФ, отражающая уровень жизнеспособности клеток. Она составила 1 • 10^-9, 5,6 • 10^-12 и 4,1 • 10^-12 моль на 1 мл суспензии клеток (для исходного препарата, 70 °С и 90 °С соответственно). В целом, как и для разных партий бактерий, наблюдались значительные вариации числа и положения полос. Однако можно отметить тенденцию к снижению общей интенсивности спектра. Для практически полностью инактивированного препарата (90 °C) в спектре присутствовали лишь четыре полосы нативных E. coli крайне низкой интенсивности при 730, 1002, 1325 и 1450 см^-1, а также появлялись две низкоинтенсивные полосы амид III (1230–1270 см^-1) и амид I (1640–1680 см^-1).

Эксперименты по изучению повторяемости регистрации ГКР-спектров нативных препаратов E. coli были также проведены с использованием ДВВ, равной 532 нм. Необходимо отметить примерно в 2 раза более высокую интенсивность спектров при ДВВ 532 нм по сравнению с ДВВ 785 нм, что приводит к увеличению числа информативных полос и точности определения их положения. Так же как и в случае с ДВВ 785 нм, при 532 нм наблюдается высокая повторяемость спектров одной и той же аликвоты и одного и того же препарата бактерий (рис. 3 А). Но ГКР-спектры независимо культивированных и выделенных партий бактерий тоже демонстрируют значительную вариативность (рис. 3 Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты экспериментов при ДВВ 785 нм по повторяемости и динамике изменения ГКР-спектров E. coli при хранении в воде свидетельствуют о том, что формирование спектров определяет не индивидуальное соединение, а смесь небольшого числа компонентов, так как вся совокупность зарегистрированных спектров содержит лишь фиксированный набор полос (см. таблица). Соотношения компонентов в данной смеси медленно меняются при хранении клеток в воде (рис. 1 В) и значительно различаются для независимо культивированных нативных препаратов (рис. 1 Б). Сравнение спектров нативного препарата и его фильтрата (рис. 1 Г) свидетельствует о том, что данная смесь соединений не связана с поверхностью клеток, а присутствует в растворе. Более того, значимое повышение общей интенсивности спектра фильтрата по сравнению со спектром суспензии клеток позволяет предположить, что с точки зрения ГКР-регистрации клетки являются мешающим компонентом, например, за счет адсорбции доли частиц на их поверхности.

Эксперименты по инактивации клеток демонстрируют, что данная смесь соединений связана с уровнем жизнеспособности клеток (рис. 2), не являясь продуктом пассивной десорбции веществ с поверхности инактивированных клеток.

В таблице представлен перечень полос, наблюдавшихся во всех ГКР-спектрах нативных препаратов E. coli, включая эксперименты по фильтрованию клеток. Проанализировав различные варианты отнесения полос, описанные в литературе, мы пришли к выводу, что при ДВВ 785 нм практически все полосы можно приписать суперпозиции спектров 4 пуриновых производных (аденина, гуанина, гипоксантина и ксантина) в полном соответствии с выводами, сделанными в более ранней работе [16]. Кроме того, каждый отдельный ГКР-спектр соответствует суперпозиции сигналов этих соединений как по положению полос, так и по их интенсивности (рис. 4 А). С учетом возможных небольших различий в относительных интенсивностях полос, связанных с различием ГКР-субстратов (в настоящей работе спектры получены с использованием золей НЧС, в референсной работе [16] — на агрегированных золотых наночастицах), а также сложения интенсивности при наложении полос отдельных соединений, качество описания является высоким. Не отнесенными остаются лишь три полосы низкой интенсивности: 838–842, 1002–1008 и 1508 см^-1. С одной стороны, можно предположить, что низкоинтенсивные полосы были потеряны при оцифровке спектров из литературных источников. С другой стороны, если данные полосы действительно не присутствуют в спектрах пуриновых производных, можно выдвинуть два предположения относительно их природы. Во-первых, полосы могут появляться вследствие взаимодействий между компонентами смеси. Например, известен ГКР-спектр смеси аденина, гипоксантина и ксантина, содержащий полосы при 1000 и 1510 см^-1, отсутствующие в спектрах индивидуальных соединений [22]. Кроме того, наличие полос при 838–842 и 1002 см^-1 можно объяснить наличием минорных количеств тирозина (наиболее интенсивные полосы 824, 847, 928, 1046, 1389 и 1583 см^-1 [23]) и фенилаланина (наиболее интенсивные полосы 930, 1002, 1031, 1394 и 1602 см^-1 [23]).

Отнесение полос к смеси пуриновых производных объясняет экспериментально наблюдаемую значительную вариацию в положении максимума некоторых полос в спектрах E. coli. Вариация положения максимума широкой многокомпонентной полосы при 502–574 см^-1 может быть объяснена наложением полос 508 см^-1 ксантина, 526 см^-1 гуанина, 550 см^-1 гипоксантина, 558 см^-1 аденина и 577 см^-1 гуанина; полосы при 653–667 см^-1 — наложением полос 652 см^-1 аденина, 657 см^-1 ксантина и 667 см^-1 гуанина; полосы при 724–735 см^-1 — наложением полос 725 см^-1 гипоксантина и 734 см^-1 аденина; широкой двойной полосы с максимумами при 1444–1452 см^-1 и 1464–1473 см^-1 — наложением полос 1447 см^-1 гуанина, 1455 см^-1 аденина, 1456 см^-1 гипоксантина, 1466 см^-1 гуанина и 1478 см^-1 ксантина.

Спектры E. coli при ДВВ 532 нм демонстрируют значительное сходство со спектрами при ДВВ 785 нм (рис. 4 А, рис. 4 Б). В них наблюдаются вариации положения и интенсивности тех же полос, что и при ДВВ 785 нм (рис. 1 Б, рис. 3 Б). В связи с этим мы опробовали вариант описания их в виде смеси тех же четырех пуриновых производных (аденина, гуанина, гипоксантина и ксантина). Учитывая, что в данном случае их референсные спектры, описанные ранее [16], отличаются от спектров E. coli не только типом ГКР-субстрата, но и ДВВ, что зачастую приводит к небольшим сдвигам положения полос, качество описания экспериментальных спектров E. coli можно назвать высоким.

Нами была также изучена возможность отнесения полос в спектрах E. coli при ДВВ 532 нм к окисленной или восстановленной формам рибофлавина или ФАД, референсные спектры которых были взяты из более ранних работ [4, 24, 25] (рис. 4 В). В спектрах рибофлавина отсутствует ряд полос высокой и средней интенсивности спектров E. coli: 650, 725–733, 955, 1365 см^-1, а в спектрах E. coli отсутствует или имеет значительно отличающуюся относительную интенсивность ряд полос рибофлавина: 528–529, 834–839, 1149–1156, 1279–1289, 1491–1502, 1523–1527 см^-1 для окисленной формы и 528, 1251, 1501 и 1530 см^-1 для восстановленной формы. Нельзя полностью исключать наличие небольшого вклада спектра рибофлавина в спектры E. coli при ДВВ 532 нм, это могло бы дополнительно повысить интенсивность широкой полосы при 1300–1350 см^-1 по сравнению со смесью пуриновых производных. Однако рибофлавин однозначно не является доминирующим соединением в спектре. Это в некоторой степени противоречит сделанным ранее выводам о том, что в спектрах бактерий Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis и Geobacillus stearothermophilus при ДВВ 532 нм доминируют полосы рибофлавина [25]. Данное несоответствие может быть объяснено различиями в используемых видах бактерий.

Таким образом, и при ДВВ 532 нм ГКР-спектры E. coli наилучшим образом можно описать суперпозицией спектров пуриновых производных. Аналогично ДВВ 785 нм, вариативность спектров между бактериальными препаратами разных партий объясняется различными соотношениями концентраций этих соединений, выделяемых клетками в раствор.

ВЫВОДЫ

При использовании в качестве ГКР-субстратов золей наночастиц серебра, полученных гидроксиламиновым методом, источником ГКР-спектров E. coli при ДВВ 785 и 532 нм является смесь пуриновых производных, выделяемых клетками в раствор. Наилучшее описание спектра соответствует четырем соединениям (аденин, гуанин, гипоксантин и ксантин), при ДВВ 532 нм мы не исключаем возможность наличия небольшого вклада рибофлавина. Спектры такого типа проявляются только в присутствии живых бактериальных клеток; им присуща значительная вариативность, обусловленная различиями в соотношениях перечисленных компонентов. Такая молекулярная природа ГКР-спектров бактерий в значительной мере сужает перспективы использования ГКР для целей их дискриминации/идентификации.