По результатам эпидемиологических исследований, в Китае растет число травм спинного мозга, достигая 23,7 случаев на миллион человек в год [1]. По последним данным, это значение колеблется от 9,2 до 246 случаев на миллион [2]. Почти половина случаев приводит к полной потере проведения нервного импульса в области ниже уровня травмы. Расходы на медицинское обслуживание в течение первого года для пациентов с тетраплегией и параплегией оставляют более чем 800 000 и 300 000 долларов США соответственно [3]. В последнее время уровень смертности в первый год после травмы неуклонно снижается. Тем не менее ТСМ по-прежнему относится к неизлечимым состояниям [4].

Патофизиологию ТСМ можно определить как двухфазный процесс: 1) первичная фаза включает начальное механическое повреждение; 2) отсроченная вторичная фаза характеризуется активацией воспаления, разрушением сосудов, ишемией, окислительным стрессом и экситотоксичностью [5–6]. Вторичная фаза подразделяется на немедленную, острую, промежуточную и хроническую стадии ТСМ [5]. Основными признаками хронической ТСМ служат глиальный рубец и формирование полости после потери функции [7–8].

Трансплантация стволовых клеток на сегодняшний день является распространенным методом лечения ТСМ. Первое описание применения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) было опубликовано в 1991 г. [9] и постепенно MSC стали одним из наиболее используемых методов клеточной терапии в хирургии. Был проведен ряд исследований по трансплантации МСК при ТСМ [11–16]. Растущее число клинических испытаний использования МСК для лечения ТСМ указывает на быстрое внедрение данной технологии в клиническую практику, несмотря на ряд нерешенных вопросов, требующих прояснения как на фундаментальном, так и на доклиническом уровнях исследований [10].

Для успешного внедрения МСК в клиническую практику необходимо ответить на следующие вопросы: каковы оптимальные сроки трансплантации, какой метод трансплантации наиболее эффективен и какое количество стволовых клеток оптимально. Наше предыдущее исследование было сосредоточено на выяснении преимуществ использования МСК в острой и подострой фазах травмы на модели контузионных крыс [17]. Существующие данные указывают на то, что даже хроническую фазу можно рассматривать как адекватный период для применения клеточной терапии [11–16]. Авторы приводят две основные причины для скорейшего внедрения клеточной терапии: 1) на данный момент не найдено сколько-нибудь эффективного метода лечения хронической ТСМ; 2) микросреда постоянно меняется во время острой/подострой фазы заболевания, в то время как при хронической стадии она относительно стабильна, что позволяет адекватно оценить выживание или дифференцировку трансплантированных клеток. Принимая во внимание выживаемость, миграцию и безопасность трансплантированных клеток, более предпочтительным подходом можно считать интралесальную трансплантацию (в сравнении с интратекальной и внутривенной видами трансплантации) [18–19]. Результаты текущих исследований и клинических испытаний показывают значительный разброс количества используемых МСК: от 4 • 10⁵ до 1 • 10⁶ в исследованиях на животных [19–22] и от 7 • 10⁵ до 2 • 10⁷ в клинических испытаниях [12, 14, 15, 23].

Целью данного исследования было проверить ранее предложенную стратегию точной трансплантации МСК и определить оптимальный для лечения хронической ТСМ объем МСК в диапазоне от 4 • 10⁵ до 1 • 10⁶ кл.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Инъекция НЧ

Описанными ранее способами получали НЧ [24] и проводили трансплантацию под контролем МРТ [25]. Как правило, крыс анестезировали в течение всей процедуры с помощью E–Z-системы анестезии EZ-7000 330 (PA; США). Мех над зоной T10 тщательно выбривали, а открытую кожу стерилизовали йодом. Кожу и поверхностную фасцию вскрывали вдоль начального разреза ламинэктомии. Две серебряные иглы для акупунктуры (ОАО «Казанский завод медицинских инструментов»; Россия) вводили через позвоночник. Иглы располагали параллельно поверхности и под углом 40° к позвоночнику, по одной игле с каждой стороны. Кончики игл проходили через мышцы и пересекались друг с другом, создавая крестообразную форму.
По результатам МРТ рассчитывали объем посттравматического свища (ПТС) и его пространственные (3D) координаты с использованием скрещенных игл в качестве контрольной точки. Как поперечное, так и продольное расстояния между ПТС и скрещенными иглами измеряли с помощью программного обеспечения MultiVox Dicom Viewer (верс. R3.0 SP13; США). Рассчитывали глубину ПТС.

Группы исследования

Чтобы доказать точность внутрисвищевой трансплантации, хроническую стадию ТСМ моделировали на взрослых крысах Sprague-Dawley (n = 3) весом 180–220 г. Для оценки эффекта от трансплантации МСК хроническую стадию ТСМ моделировали на другой группе крыс Sprague-Dawley (n = 24) весом 180–220 г. Этих крыс случайным образом разделили на четыре подгруппы по 6 особей:
1) подгруппа DMEM (по названию среды для культивирования клеток);
2) подгруппа с инъекцией 4 • 10⁵ кл.;
3) подгруппа с инъекцией 8 • 10⁵ кл.;
4) подгруппа с инъекцией 1 • 10⁶ кл.
Эксперимент проводили в соответствии с принципами и требованиями Международной лаборатории по уходу за животными и Директивой совета европейских сообществ (86/609/EEC) от 24 ноября 1986 г. Были использованы все возможности для сведения к минимуму количества задействованных в эксперименте животных и их страданий.

Получение, культивирование и характеристика стромальных клеток костного мозга

МСК собирали из костного мозга 4–6-месячных крыс Sprague-Dawley. Биоптат центрифугировали при режиме 300 об./мин 30 мин в градиенте плотности фиколла 1,077 г/мл (Sigma-Aldrich; США) для выделения фракции мононуклеарных клеток. Клетки культивировали в RPMI 1640 (Gibco; США) с добавлением 2 мМ глютамина, 100 ед./мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина (Gibco; США) и 15% FBS (Biowest; США) при 37 °C, 5% CO₂. Далее использовали МСК второго–четвертого пассажей. Наличие специфичных маркеров МСК (CD105, CD90 и CD44) и гематопоэтических маркеров (CD45, CD34) подтверждали методом проточной цитометрии с помощью клеточного сортера MoFlo (Beckman Coulter; США) с соответствующими первично-меченными антителами (Miltenyi Biotec GmbH; Германия).
Клетки МСК трипсинизировали c помощью 0,25%-го трипсин-ЭДТА (Invitrogen; Россия) и подсчитывали. Затем готовили 4 аликвоты бессывороточной среды DMEM (Gibco; США), дополненной 2 мМ глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина (Gibco; США). Три из них случайным образом отбирали для приготовления клеточной суспензии в различных концентрациях: 1 • 10⁵, 2 • 10⁵ и 2,5 • 10⁵ кл./мкл.

Модель хронической стадии травмы спинного мозга

Операцию по воссозданию хронической стадии ТСМ выполняли как описано ранее [17]. После внутрибрюшинной анестезии кетамином (50 мг/кг) животных помещали на теплую подкладку в положении лежа и брили мех с дорсальной стороны. Хирургический участок стерилизовали. Чтобы обнажить спинной мозг, выполняли ламинэктомию в сегменте T9–10. Затем производили ударную нагрузку в 200 килодин на спинной мозг с использованием Impactor PSI-IH, оснащенным датчиками для точного измерения силы удара (Precision Systems and Instrumentation LLC, Fairfax, VA; США). После промывания раны холодным физраствором место операции зашивали. Крысам делали подкожную инъекцию Байтрила в дозировке 2,5 мг/кг/сутки (Bayer; США). После операции животных возвращали в их домашние клетки и дважды в день проводили ручное опорожнение мочевого пузыря до восстановления спонтанной функции мочеиспускания.

Стереотактическая трансплантация МСК

Трансплантацию клеток проводили через 4 ч после травмы [11] под общей анестезией через кожу под контролем МРТ. Для определения местоположения поврежденной области до процедуры трансплантации тоже проводили МРТ. С помощью шприца Гамильтона и иглы № 33 с углом наклона 45° (Hamilton, Reno; США) 4 мкл жидкости трансплантировали в область травмы в течение 2 мин с помощью блока микроинъекции и шприцевого насоса Razel NE-1002X (Razel Scientific; США). Затем иглу удерживали в месте инъекции в течение еще 2 мин и медленно извлекали в течение еще 1 мин.

Проведение МРТ и DTI

Всех крыс анестезировали в течение всей процедуры путем ингаляции изофлурана (5DG9621, BAXTER; США) при помощи системы анестезии E-Z (EZ-7000 330, PA; США). В первую и четвертую недели после ТСМ (для оценки зоны повреждения) и на восьмой неделе после ТСМ (для определения эффекта трансплантации МСК) выполняли МРТ и DTI-сканирование с использованием семитесловых МРТ-сканеров для животных (ClinScan, Bruker BioSpin; США). Для корональных изображений T2-взвешенные изображения в корональной плоскости были получены с помощью Turbo Spin Echo со следующими параметрами: FOV 120 • 59,2 мм, базовое разрешение 320 • 158, TR = 3850 мс, TE = 39 мс, толщина среза 1 мм, количество съемок — 1, длина эхо-последовательности — 9. Для сагиттальных изображений T2-взвешенные изображения в сагиттальной плоскости были получены с помощью последовательности Turbo Spin Echo со следующими параметрами: FOV 100 • 49,2 мм, базовое разрешение 256 • 126, TR = 3850 мс, TE = 42 мс, толщина среза 1 мм, номер сбора — 3, длина эхосигнала — 9.
Изображения DTI были получены с такой же геометрией, что и анатомические изображения, с использованием одноэтапной последовательности плоских изображений (EPI) (спиновый эхо-сигнал TR/TE — 4000 мс/88 мс, толщина среза — 3 мм,
фактор b — 1000 с/мм², ширина полосы пропускания — 200 кГц, 25 направлений кодирования градиента, матрица сбора данных — 64 • 64 и поле зрения — 10 • 10 мм). Для расчета индексов DTI собранные изображения анализировали на независимой рабочей станции. DTT спинного мозга генерировали с использованием алгоритма FACT, реализованного в программном обеспечении Volume-One, в качестве параметров использовали порог дробной анизотропии (FA) < 0,2 и угол остановки > 25°.

Макроскопическая оценка зоны поражения

Макроскопическую оценку проводили через 8 ч после трансплантации клеток каждой крысе. Все животные были гуманно умерщвлены как описано выше. Для удаления возможных компонентов крови из образца проводили внутрисердечную перфузию физиологическим раствором, а затем 4% параформальдегидом. В качестве биообразцов собирали спинной мозг в области повреждения. Изображения спинного мозга из каждой группы были получены с помощью цифровой камеры (Leica Co.; Германия). С помощью программного обеспечения Image J (Basics 1.38; США) были выбраны участки макроповреждения на поверхности спинного мозга, после чего участки повреждения были рассчитаны автоматически. В каждой группе оценивали и количественно сопоставляли среднюю площадь поражения.

Окрашивание гематоксилин-эозином

После макроскопической оценки крыс глубоко анестезировали кетамином и ксилазином и перфузировали физиологическим раствором и 4%-м параформальдегидом в 0,1 М фосфатном буфере. Три образца спинного мозга из каждой группы выбирали случайным образом. Образцы постепенно обезвоживали в 70%-м, 80%-м, 90%-м, 100%-м этаноле и помещали в ксилол и парафин. Продольные срезы толщиной 10 мкм делали на микротоме роторного типа (Microm HM 650V; США).
Для окрашивания гематоксилин-эозином срезы гидратировали в 100%-м, 90%-м, 80%-м, 70%-м этаноле (водный раствор), окрашивали в гематоксилине в течение 1 мин, промывали в воде в течение 5 мин с последующим окрашиванием в эозине в течение 1 мин. После покрытия срезов энтеланом оценивали поврежденный участок под световым микроскопом. Среднюю площадь поражения рассчитывали для трех срезов из каждой группы. С помощью программного обеспечения Image J выбирали места повреждения и автоматически рассчитывали зоны поражения. В каждой группе оценивали и количественно сопоставляли среднюю площадь поражения.

Иммуногистохимическое исследование

Из каждой группы выбирали случайным образом по три образца спинного мозга. Образцы помещали в буфер PBS, продольные срезы толщиной 50 мкм делали на микротоме HM 650V (Thermo Scientific; США). Срезы инкубировали с антителами против белка, ассоциированного с микротрубочками 2 (MAP2; мышь анти-крыса; 1 : 400) (Abcam; Великобритания), анти-β3-тубулином (β3-тубулин; кролик анти-крыса; 1 : 400) (Sigma; США), антителами против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP; кролик анти-крыса; 1 : 500) (Abcam; Великобритания), нестином (1 : 400, кролик анти-крыса) (Abcam; Великобритания), нейротрофическим фактором (BDNF; мышь анти-крыса; 1 : 400) (Abcam; Великобритания) и фактором роста эндотелия сосудов (VEGF; мышь анти-крыса; 1 : 200) (Abcam; Великобритания) в течение ночи при 4 °C, после чего добавляли TRITC-конъюгированные козьи анти-мышиные или FITC-конъюгированные анти-кроличьи IgG (1 : 200; ZSGB-BIO) и инкубировали в течение часа при 37 °C. Срезы исследовали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1 + MP (Nikon; Япония).
Трехмерный график поверхности использовали для полуколичественной оценки флуоресцентных измерений. Теплоую карту образца каждого среза генерировали на основе интенсивности флуоресценции в разных каналах флуоресценции. Тепловая карта образца представляет собой матрицу из трех столбцов, окрашенных от светло- голубого до ярко-красного, и иллюстрирует различные уровни наработки белков.

Анализ поведения

Локомоторный тест Бассо, Битти и Бреснахана (BBB) проводили двойным слепым методом до моделирования травмы и еженедельно посттравматически для оценки восстановления двигательного поведения задних конечностей. Для оценки координации движений проводили тестирование с вращающимся стержнем до того, как крысы были убиты (через 8 ч после трансплантации). Всех крыс помещали на стандартный Ротарод (Med Associates, Inc.; США) для определения их моторных характеристик. Испытание не проводили в течение всего экспериментального периода, поскольку падение со стержня могло привести к дальнейшим травмам. Каждое животное помещали на стержень диаметром 10 см и длиной 15 см, вращающийся с постоянной скоростью. Нарушение координации движений определяли как неспособность крыс оставаться на вращающемся стержне в течение 60 с испытательного периода. Животные были предварительно обучены на вращающейся дорожке до травмы и повторно обучены за 24 ч до испытания. Протокол испытаний состоял из одного 60-секундного периода испытаний каждые 24 ч в течение 72 ч. В эти непрерывные дни испытывали при 4, 8 и 12 об./мин на 1-й, 2-й и 3-й день соответственно с 10-минутным интервалом между каждым испытанием.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью программного пакета SPSS 17.0 (SPSS Inc.; США). Результаты считали статистически значимыми с р < 0,05. Все данные представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM); использовали повторные измерения ANOVA (RANOVA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Точная трансплантация в ПТС

НЧ показали низкое изменение сигнала при T2-взвешенном МРТ-сканировании (рис. 1). Трансплантацию НЧ крысам с ПТС проводили в несколько приемов. Как показано на рисунке, зона ПТС значительно сократилась в размерах (с 5,71 ± 0,21 мм³ до 3,23 ± 0,364 мм³) после первой же трансплантации (р < 0,05), повторная трансплантация привела к еще большему уменьшению зоны поражения
(с 3,23 ± 0,364 мм³ до 1,48 ± 0,722 мм³) (p < 0,05). Таким образом, с помощью НЧ удалось продемонстрировать точность предложенного варианта трансплантации.

Общее состояние животных и восстановление моторики

Ни у одного экспериментального животного не было выявлено признаков осложнений или неожиданной гибели в течение всей процедуры.
До операции показатель ВВВ для всех крыс составлял 21 балл. Сразу после ТСМ все животные продемонстрировали значительную потерю двигательной функции задних конечностей и показатели BBB были снижены до 0 баллов (рис. 2). Постепенно показатель BBB увеличился во всех группах и через четыре недели после травмы достиг 4,85 ± 0,83 (группа DMEM), 5,94 ± 0,74 (группа 4 • 10⁵ кл.), 6,08 ± 0,75 (группа 8 • 10⁵ кл.) и 6,02 ± 0,84 (группа 1 • 10⁶ кл.). Различия в показателях BBB между четырьмя группами не были статистически значимыми до трансплантации клеток.
Через неделю после трансплантации по сравнению с группой DMEM различия были статистически значимыми в группах с трансплантированными клетками (рис. 2 М). По сравнению с группой DMEM, поведенческая способность также демонстрировала лучший результат в группах с клеточной терапией. Среди всех групп группа с 1 • 10⁶ кл. показала наилучший результат (рис. 2 М). Через восемь недель после трансплантации показатель BBB достиг 7,02 ± 1,36 (группа DMEM), 8,14 ± 1,12 (группа 4 • 10⁵ кл.), 10,25 ± 1,02 (группа 8 • 10⁵ кл) и 11,07 ± 1,44 (группа 1 • 10⁶ кл.). Крысы демонстрировали различные поведенческие способности в отношении поддержки веса, размещения подошв и подошвенному шаганию (рис. 2 A–M).

Уменьшение объема ПТС

МРТ выполняли на первой и четвертой неделях после травмы, а также на восьмой неделе после трансплантации стволовых клеток костного мозга, при этом оценивали формирование ПТС. В табл. 1 показано число случаев формирования ПТС на разных сроках после травмы.
На основе МРТ были рассчитаны объемы ПТС (рис. 4). Размеры ПТС уменьшились в группах после клеточной терапии при оценке через 8 ч после трансплантации. Среди всех групп группа 1 • 10⁶ кл. показала наилучшие результаты (рис. 3 У–Щ).
Для оценки влияния МСК на предотвращение образования рубцов после хронической стадии ТСМ была рассчитана видимая область повреждения. По сравнению с группой DMEM, различия были статистически значимы в группах после клеточной терапии (рис. 4 Г). Из всех групп группа 1 • 10⁶ кл. показала наилучший результат (рис. 4 A–Д).

Оценка восстановительного эффекта для нервной системы

Чтобы оценить влияние МСК на стимуляцию регенерации и рост нервной ткани, на восьмой неделе после трансплантации клеток были проведены DTI и DTT. В каждой группе были оценены участки дорсальных стволов места поражения (рис. 4 и табл. 2). По сравнению с группой DMEM непрерывность и плотность нервных волокон продемонстрировали улучшение в группах с трансплантированными клетками (рис. 4 Б–Г). В группе 1 • 10⁶ кл. выявлены наилучшие нервные волокна с полной непрерывностью и высокой плотностью
(рис. 4 Г). Как показано в табл. 2, для группы 1 • 10⁶ кл. коэффициент диффузии поверхности (apparent diffusion coefficient, ADC) показал значительное снижение, а величина дробной анизотропии (fractional anisotropy, FA) — значительное увеличение. Таким образом, выявлен эффект зависимости степени регенерации от дозы клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На основании литературных данных, а также результатов нашего исследования, можно предположить, что положительный эффект от трансплантации МСК зависит от дозы клеток [26]. В данном исследовании была предпринята попытка определить оптимальное для трансплантации количество клеток в диапазоне от 4 • 10⁵ до 1 • 10⁶ кл. Чтобы избежать дополнительного повреждения спинного мозга, использовали высокие концентрации клеток. В ряде работ использовали 1 • 10⁵, 2 • 10⁵ и 2,5 • 10⁵ кл./мкл [19–22]. Ранее было отмечено, что 2,5 • 10⁵ кл./мкл — это максимальная концентрация для приготовления МСК. Более высокие значения оказывали негативное влияние на выживаемость клеток и требовал большего калибра инъекционной иглы, что приводило к дополнительному повреждению тканей. Вследствие небольшого объема спинного мозга крысы и необходимости применения среды клеточной суспензии для выживания клеток, в этих работах использовали наименьший возможный объем клеточной суспензии, равный 4 мкл [19–22].

Были разработаны различные стратегии трансплантации клеток в спинной мозг, включая доставку в очаг поражения, доставку в одну точку с различными интервалами, доставку в несколько мишеней и доставку последовательно в два подхода [26–28]. При планировании пути введения следует учитывать четыре фактора: 1) в область поражения, как правило, можно ввести больший объем клеток, тогда как в нормальные ткани обычно входит меньше клеток; 2) более высокие показатели выживаемости клеток; 3) подход, который можно точно повторить для каждой особи; 4) минимизацию урона. Таким образом, основываясь на наших предыдущих публикациях, в настоящем исследовании мы использовали локальное поражение места доставки клеток [25].

В нескольких исследованиях показано, что трансплантация МСК улучшала результат после ТСМ [19–22]. По нашим результатам, трансплантация МСК может стимулировать регенерацию и прорастание аксонов, улучшать восстановление двигательной функции, уменьшать образование ПТС и глиального рубца, способствовать васкуляризации и экспрессии нейротрофического фактора. Нами установлено, что группа 1 • 10⁶ кл. показала наилучший результат среди всех групп. Можно предположить, что чем больше задействованных клеток, тем лучше получаемый эффект. Сообщалось также, что одним из основных механизмов трансплантации МСК при лечении хронической стадии ТСМ является паракринный эффект МСК [11]. Поэтому мы предположили, что чем больше клеточная доза, тем больше привнесено трофических факторов. Как продемонстрировано в настоящем исследовании методами иммуногистохимии, уровни экспрессии BDNF и VEGF в месте поражения среди всех групп были наивысшими после трансплантации 1 • 10⁶ кл., тогда как после трансплантации 4 • 10⁵ и 8 • 10⁵ кл. экспрессия BDNF и VEGF возрастала (относительно группы DMEM) в меньшей степени. До настоящего времени не было проведено количественной оценки изменения трофических факторов после хронической стадии ТСМ или детального количества желаемых трофических факторов для лечения ТСМ. Данное исследование показало, что чем больше задействованных клеток и чем выше трофические факторы экспрессии, тем быстрее и лучше достигается восстановление поведения. Тем не менее при увеличении объема и/или концентрации клеток следует соблюдать осторожность, чтобы избежать дополнительного ущерба.
К недостаткам настоящего исследования можно отнести то, что мы не оценивали показатели выживаемости трансплантированных МСК, в связи с чем запланированы дальнейшие исследования по оценке выживаемости и клеточного апоптоза.

ВЫВОДЫ

Клеточная терапия с помощью МСК при хронической стадии ТСМ является безопасной стратегией в пределах концентраций 1 • 10⁵, 2 • 10⁵ и 2,5 • 10⁵ кл./мкл и с общим числом клеток 4 • 10⁵, 8 • 10⁵ и 1 • 10⁶ на зону поражения. В настоящем исследовании МСК in vivo могут восстанавливать функцию после ТСМ в хронической стадии посредством стимуляции регенерации и прорастания аксонов, улучшения восстановления двигательной функции, уменьшения образования ПТС и глиального рубца, стимуляции васкуляризации и экспрессии нейротрофического фактора. Выявленный эффект зависел от количества клеток, причем наилучшей дозой оказалось 1 • 10⁶ кл. В то же время комбинированное применение DTI и DTT могло бы стать стратегией для количественной оценки ситуации с ПТС после хронической стадии ТСМ.