По данным Всемирной организации здравоохранения, инсульт находится на втором месте в числе заболеваний, приводящий к летальному исходу. Более 15 млн людей во всем мире ежегодно становятся жертвами этой болезни, 6 млн из них погибает, 5 млн становятся нетрудоспособными [1]. Ишемический инсульт возникает вследствие стеноза или закупорки сосудов головного мозга, что приводит к нарушению кровоснабжения и быстрому повреждению тканей [2].
Исследования последних лет выявили изменения биохимии клеток мозга, происходящих при развитии инсульта. В частности, состояние гипоксии ткани способствует возрастанию внеклеточной концентрации важного нейромедиатора глутамата и его связыванию с глутаматными рецепторами [3], что приводит к резкому увеличению концентрации внутриклеточного кальция. Неконтролируемая регуляция кальция приводит к активации кальций-зависимых белков и глобальному нарушению регуляции клеточных каскадов [4]. Одновременно с этими происходят другие биохимические процессы, которые приводят к истощению энергетических запасов клетки, изменяют внутриклеточный ионный состав, снижают pH цитоплазмы [5, 6]. На более поздних стадиях патогенеза происходит повреждение ДНК, изменение белкового и липидного состава [7]. Все описанные выше процессы приводят к дисфункции митохондрий и массовой клеточной гибели [8].

Липиды составляют около половины сухой массы мозговой ткани и выполняют важные структурные и метаболические функции. Глицерофосфолипиды и сфинголипиды составляют основную часть клеточных мембран; холестерин входит в состав липидных рафтов — структур, которые влияют на текучесть мембраны, регулируют синаптическую передачу. Поскольку липиды не проходят через гемато-энцефалический барьер, их биосинтез в нервных клетках происходит de novo. Одним из ключевых участников синтеза является НАДФ(Н) — основной донор восстановительных эквивалентов в реакциях анаболизма.
При ишемии-реперфузии ткани образуются активные формы кислорода (АФК) [9], которые приводят к окислению липидного состава, что обусловливает увеличение в клетке продуктов перекисного окисления липидов, например, малонового диальдегида, 4-гидроксиноненала [10]. Эти соединения могут быть использованы в качестве маркеров окислительного стресса.
В ответ на внутриклеточное повышение АФК активируются антиоксидантные системы защиты. Глутатион играет ключевую роль в реакциях тиол- дисульфидного обмена клетки [11, 12]. При этом поддержание определенного редокс-состояния пула глутатиона опосредовано НАДФ(Н) зависимыми системами [12]. Таким образом, оба эти параметра играют первостепенную роль в регуляции процессов, направленных против окислительного стресса в условиях ишемического повреждения ткани [13].

Целью настоящего исследования стало определение наиболее важных биохимических параметров, касающихся липидного обмена, в тканях мозга крыс через разные промежутки времени с момента начала развития ишемического повреждения. Оценку уровней метаболитов производили с помощью коммерческих наборов и по стандартным протоколам (МДА, НАДФ(Н)) [14, 15].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и хирургические манипуляции

Работу проводили на самцах крыс линии Wistar из питомника лабораторных животных «Пущино» весом 280–330 г. Крыс содержали в виварии ИБХ РАН по три особи в пластмассовых клетках со свободным доступом к воде и пище. Экспериментальная работа (хирургические операции и биохимические тесты) была проведена в течение месяца (июнь 2018 г.).
Окклюзию средней мозговой артерии проводили по ранее описанному протоколу [16]. Использовали ингаляционный наркоз: смесь воздуха с изофлураном (Аерран, Baxter; США). Используемые концентрации: 5% — введение в наркоз; 2% — поддержание во время хирургической операции.
Для обезболивания использовали кетопрофен 5 мг/кг подкожно (Ketonal, Sandoz; Швейцария), местное обезболивание проводили с помощью 2%-го новокаина.
В работе использовали готовые окклюдеры диаметром 0,185 мм (Doccol; США; кат. No 403756PK10Re).

Подготовка ткани

Для проведения биохимических тестов животные случайным образом были поделены на пять экспериментальных групп по четыре особи в каждой. Контрольная группа включала в себя интактных животных. В остальных четырех группах животным было проведено моделирование перманентной ишемии левого полушария мозга путем окклюзии средней мозговой артерии. После этого биохимический анализ ткани проводили через 1 ч с момента окклюзии сосуда (2-я группа), 3 ч (3-я группа), 6 ч (4-я группа) и через 24 ч (5-я группа).
Для анализа мозг каждого животного был извлечен с последующим удалением мозжечка и обонятельных луковиц. Ткань помещали в предварительно охлажденную фарфоровую ступку и добавляли жидкий азот, после чего тщательно растирали пестиком. Полученный материал взвешивали и хранили при температуре –70 °С.

Измерение концентрации свободных жирных кислот

Содержание свободных жирных кислот в образцах мозга определяли при помощи коммерческого набора согласно инструкции производителя (Free Fatty Acid Quantification Assay Kit; Abcam, Англия). Общая схема анализа устроена следующим образом. Сначала свободные жирные кислоты переводят в ацил-KoA под действием ацил-KoA синтетазы. Затем специфичный фермент окисляет полученные тиоэфиры, что сопровождается восстановлением бесцветной пробы с образованием флуоресцирующего соединения (Ex. 535 нм; Em. 587 нм).
Ткань размораживали на льду, после чего перетирали в 200 мкл 1% Triton X-100 в чистом хлороформе при помощи ручного гомогенизатора Поттера. Полученный гомогенат инкубировали на льду в течение 30 мин для увеличения эффективности экстракции. Далее образцы центрифугировали в течение 10 мин на максимальной скорости, после чего отбирали органическую фазу. Для избавления от хлороформа препараты сначала сушили при +50 °С в вытяжном шкафу в течение часа, после чего помещали их в вакуумную сушку еще на один час. 
Полученную липидную фракцию растворяли в 200 мкл Fatty Acid Assay Buffer, активно перемешивая.
Для анализа использовали аликвоты объемом от 10 до 40 мкл. Общий объем пробы доводили до 50 мкл раствором Fatty Acid Assay Buffer. Параллельно готовили ряд стандартных растворов с известными концентрациями пальмитиновой кислоты для последующего построения калибровочного графика. В каждую пробу реакционной смеси добавляли по 2 мкл ACS Reagent (препарат с ацил-KoA синтетазной активностью), после чего инкубировали при +37 °С в течение 30 мин. По окончании данного времени ко всем образцам добавляли по 50 мкл смеси следующего состава: 45,6 мкл Assay Buffer; 0,4 мкл Fatty Acid Probe; 2 мкл Enzyme Mix; 2 мкл Enchancer. Образцы перемешивали и вновь инкубировали при +37 °С в течение 30 мин.
Флуоресцентный сигнал каждой пробы регистрировали с помощью прибора Tecan Reader Infinite® 200 PRO (Tecan; Швейцария). Параметры измерения: Em. 587 нм, Ex. 535 нм. По показаниям образцов стандартного ряда определяли зависимость интенсивности флуоресценции от количества свободных жирных кислот в пробе. После этого рассчитывали значения в каждой экспериментальной пробе. Полученные значения нормировали на массу ткани.

Измерение концентрации холестерина

Содержание общего уровня холестерина (как свободного, так и в составе эфиров) в образцах мозга определяли с помощью коммерческого набора согласно инструкции производителя (Cholesterol/Cholesteryl Ester Detection Kit; Abcam, Англия). Принцип анализа основан на окислении холестерина специфическим ферментом холестерин-дегидрогеназой, которое сопровождается восстановлением НАДН. Последний в свою очередь реагирует с чувствительным красителем с образованием продукта, характеризующегося поглощением в области 450 нм.
Ткань размораживали на льду, после чего перетирали ее при помощи ручного гомогенизатора Поттера в 200 мкл смеси следующего состава: 7 частей хлороформа, 11 частей изопропилового спирта, 0,1 часть 10% NP-40 в воде. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 10 мин на максимальной скорости, после чего отбирали органическую фазу. Для того чтобы избавиться от хлороформа препараты сначала сушили при +50 °С в вытяжном шкафу в течение часа, после чего помещали их в вакуумную сушку еще на один час. Полученную липидную фракцию растворяли в 200 мкл Cholesterol Assay Buffer, интенсивно перемешивая.

Для анализа отбирали аликвоты объемом от 10 до 40 мкл. Общий объем доводили до 50 мкл раствором Cholesterol Assay Buffer. Параллельно готовили стандартный ряд растворов с известной концентрацией холестерина для построения калибровочного графика. Далее к реакционной смеси каждой пробы добавляли 2 мкл Esterase (препарат, гидролизующий эфиры холестерина), тщательно перемешивали и инкубировали при +37 °С в течение 30 мин. По окончании данного времени ко всем образцам добавляли по 48 мкл смеси следующего состава: 44 мкл Cholesterol Assay Buffer, 2 мкл Substrate Mix, 2 мкл Cholesterol Enzyme Mix. Образцы перемешивали и вновь оставляли инкубироваться при +37 °С в течение 30 мин для развития окраски.
Значения сигнала в каждой пробе регистрировали с помощью планшетного ридера Tecan Reader Infinite® 200 PRO (Tecan; Швейцария), измеряя поглощение образцов в области 450 нм. По образцам стандартного ряда определяли зависимость сигнала от количества холестерина в пробе. Все рассчитанные значения экспериментальных проб нормировали на исходную массу отобранной ткани.

Измерение концентрации общего пула НАДФ(Н)

Содержание НАДФ(Н) в образцах мозга определяли при помощи анализа, основанного на использовании нитросинего тетразолия (NBT) и феназинметасульфата (PMS). В данной системе НАДФН выступает в качестве донора электронов, восстанавливая PMS, который передает электроны NBT с образованием формазана. Формазан обладает поглощением при длине волны 620 нм.
Для визуализации окисленного НАДФ+ использовали ферментативную реакцию, в ходе которой глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа окисляет глюкозо-6-фосфат, что сопровождается восстановлением кофактора.
Около 300 мг ткани размораживали на льду, после чего перетирали ее при помощи ручного гомогенизатора Поттера в 1,5 мл предварительно охлажденного карбонатного буфера (100 мМ Na₂CO₃, 20 мМ NaHCO₃, 20 мМ никотинамид). Образцы центрифугировали при +4 °С в течение 5 мин на максимальной скорости. От супернатанта отбирали 10 мкл для определения концентрации белка в растворе, а оставшийся объем подвергали дополнительной очистке на колонках Amicon® Ultra 0,5 mL 10K (Merck Millipore; Германия) согласно протоколу производителя.
Для анализа в лунки 96-луночного планшета добавляли по 10 мкл каждого образца. Параллельно готовили стандартный ряд растворов с известным количеством НАДФН. Объем проб доводили до 100 мкл при помощи реакционной смеси следующего состава (из расчета на 10 реакций): 540 мкл MQ, 100 мкл 1 М TRIS-HCl буфера (pH 8,0), 50 мкл 10 мМ NBT, 150 мкл 10 мМ PMS, 50 мкл 100 мМ раствора ЭДТА, 10 мкл 100 мМ глюкозо-6-фосфата. Пробы инкубировали в термостате при +37 °С в течение 5 мин, после чего запускали реакцию добавлением 1 мкл 250 ед./мл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
Интенсивность поглощения при 620 нм в каждой пробе регистрировали с помощью планшетного ридера Tecan Reader Infinite® 200 PRO (Tecan; Швейцария) в течение 10 мин. Каждая проба была в двух повторах, в одном из случаев мы не добавляли фермент для определения фонового образования формазана под действием компонентов клеточных лизатов. По образцам стандартного ряда определяли зависимость скорости реакции от количества НАДФН в образце. Полученный калибровочный график использовали для определения общей концентрации НАДФ(Н) в экспериментальных пробах. Полученные значения нормировали на концентрацию белка.

Измерение концентрации малонового диальдегида как маркера перекисного окисления липидов

Для определения интенсивности перекисного окисления липидов в исследуемых образцах использовали классический TBARS-анализ с модификациями. В ходе данной процедуры малоновый диальдегид, являющийся одним из основных продуктов перекисного окисления липидов, взаимодействует с двумя молекулами 2-тиобарбитуровой кислоты (TBA) с образованием окрашенного соединения, интенсивно поглощающего свет при 532 нм.
Около 100 мг ткани размораживали на льду, после чего перетирали ее при помощи ручного гомогенизатора Поттера в 750 мкл предварительно охлажденной воды степени очистки MQ. В воду добавляли 5 мкл бутилированного гидрокситолуола, растворенного в метаноле в концентрации 10% (w/v), для предотвращения окисления образцов кислородом воздуха. Далее образцы центрифугировали при 3000 × g и +4 °С в течение 15 мин для получения растворимой фракции, содержащей клеточные мембраны. На этой стадии от супернатанта отбирали 10 мкл для определения концентрации белка, после чего к 350 мкл образца добавляли 250 мкл 40% трихлоруксусной кислоты для осаждения белков, интенсивно перемешивая пробу. Далее образцы повторно центрифугировали при
3000 × g и +4 °С в течение 15 мин.
Для анализа от образцов отбирали по 500 мкл супернатанта, после чего смешивали их с 500 мкл 0,67% TBA в 0,05 N NaOH. Для приготовления ряда стандартных растворов использовали 0,5 мМ 1,1,3,3,-тетраметоксипропан (TMP), последовательно растворенный в 1 мл 96% этилового спирта и 49 мл MQ. Стандартные растворы смешивали с 500 мкл 0,67% TBA в 0,05 N NaOH, после чего все образцы инкубировали в термостате при +100°С в течение 15 мин. После инкубации в 96-луночный планшет добавляли по 200 мкл каждого образца и регистрировали поглощение при 532 нм с помощью планшетного ридера Tecan Reader Infinite® 200 PRO (Tecan; Швейцария). По образцам стандартного ряда строили калибровочный график и определяли количество малонового диальдегида в каждой экспериментальной пробе. Полученные значения нормировали на концентрацию белка.

Измерение концентрации восстановленной формы глутатиона (GSH)

Содержание восстановленной (GSH) формы глутатиона в образцах мозга определяли при помощи коммерческого набора согласно инструкции производителя (GSH/GSSG Ratio Detection Assay Kit, Fluorometric-Green, Abcam, Англия). Принцип анализа основан на взаимодействии GSH с бесцветным красителем Thiol Green, в ходе чего последний приобретает флуоресцентные свойства (Ex. 490, Em. 520).
Ткань размораживали на льду, после чего перетирали ее при помощи ручного гомогенизатора Поттера в 400 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7,4), содержащего 0,5% NP-40. Полученные гомогенаты центрифугировали на максимальной скорости при +4 °С в течение 15 мин. На следующем этапе пробы депротеинизировали добавлением 1/5 объема 100% (w/v) трихлоруксусной кислоты (ТХУ). После интенсивного перемешивания и инкубации на льду в течение 10 мин образцы вновь центрифугировали при 12000 × g и +4 °С в течение 5 мин. ТХУ нейтрализовали путем добавления в образцы раствора NaHCO₃. Наконец, проводили последнее центрифугирование при
13 000 × g и +4 °С в течение 15 мин.
Для анализа супернатанты разводили в 10 раз раствором Assay Buffer, после чего в 96-луночный планшет вносили по 50 мкл раствора каждого образца. Параллельно готовили стандартный ряд растворов с заданными концентрациями GSH. Далее к пробам добавляли 50 мкл раствора Thiol Green, разбавленного в 100 раз Assay Buffer. После чего пробы инкубировали в темноте в течение часа.
Флуоресцентный сигнал проб регистрировали с помощью планшетного ридера Tecan Reader Infinite® 200 PRO (Tecan; Швейцария). По образцам стандартного ряда определяли зависимость интенсивности флуоресценции от количества глутатиона в пробе. По калибровочному графику определяли количество GSH в каждой пробе. Полученные значения нормировали на исходную массу отобранной ткани.

Измерение концентрации белка в препаратах тканей мозга

Для определения концентрации белка использовали коммерческий набор (Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit; Sigma-Aldrich, Германия). Для построения калибровочного графика в каждой серии экспериментов готовили стандартный ряд растворов с известной концентрацией белка бычьего сывороточного альбумина. В пробы добавляли смесь, содержащую 1 часть 4% (w/v) пентагидрата сульфата меди (II) и 50 частей раствора, содержащего бицинхониновую кислоту. Далее образцы инкубировали 30 мин при +37 °С.
С помощью прибора Tecan Reader Infinite® 200 PRO (Tecan; Швейцария) измеряли поглощение образцов в области 562 нм. По калибровочному графику определяли концентрацию белка в каждой анализируемой пробе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Были определены изменения общего уровня НАДФ(Н) в тканях больного полушария мозга крыс через разные промежутки времени с момента начала развития перманентной ишемии. Значительное изменение данного параметра наблюдается уже через 6 ч после окклюзии средней мозговой артерии. При норме 10,64+/–0,57 мкмоль/мг белка, измеренной в тканях здоровых животных, уровень НАДФ(Н) в области повреждения снизился до значения 4,45+/–0,79 мкмоль/мг белка. Через сутки этот параметр изменился примерно в 7 раз, составив 1,57+/–0,46 мкмоль/мг белка (рисунок А).
Поскольку НАДФ(Н) вовлечен во многие биосинтетические процессы клеток, в том числе связанные с метаболизмом липидов, мы ожидали зарегистрировать в тканях существенное падение холестерина и жирных кислот. Действительно, уровень общего холестерина (как свободного, так и в составе эфиров) начинал снижаться через 6 ч с момента начала развития патологии: значение 7,29+/–0,20 мкг/мг ткани здоровых животных изменялось до 6,85+/–0,1 мкг/мг ткани. Через сутки в клетках поврежденного полушария уровень холестерина продолжал снижаться до значения 5,95+/–0,4 мкг/мг ткани (рисунок Б). В первые 3 ч патогенеза разницы в уровне холестерина зафиксировано не было. Однако следует отметить, что наибольшая вариабельность значений была обнаружена в группе животных после 3 ч с момента окклюзии. Возможно, к данному моменту времени у некоторых животных в группе уровень холестерина в клетках поврежденной области начинал снижаться. При определении уровня свободных жирных кислот (СЖК) в тканях мозга нам удалось зафиксировать выраженную разницу лишь через сутки. Показатель 0,31+/–0,01 нмоль/мг, свойственный для здоровой ткани, через сутки снизился до значения 0,25+/–0,003 нмоль/мг (рисунок В).

Малоновый диальдегид (МДА) является одним из маркеров перекисного окисления липидов. Поэтому в клетках ткани мозга по мере снижения биосинтетических процессов должны накапливаться также продукты деградации, вызванные повреждением ткани. Однако выраженное увеличение концентрации МДА в тканях больного полушария крыс было зафиксировано лишь на следующие сутки. Уровень МДА определяли также в тканях здоровых животных (846,23+/–63,41 пмоль/мг белка), поскольку процессы деградации молекул происходят не только при развитии патологических процессов, но и при нормальном функционировании клеток. Патологическое состояние наступает, когда клетки не могут справиться с повреждением и восполнить нефункциональные молекулы синтезом новых. Через 24 ч ишемии в тканях мозга концентрация МДА увеличилась до 1272,61+/–124,47 пмоль/мг белка (рисунок Г). В это же время в поврежденной области происходила массовая гибель клеток, которую можно визуализировать прокрашиванием срезов мозга специальным красителем, например, 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым.

Пул глутатиона определяет общее редокс-состояние клеток. В частности, при окислительном повреждении белки антиоксидантных систем, например, глутатион пероксидазы, используют восстановленный глутатион для нейтрализации АФК. Поэтому поддержание редокс-статуса глутатиона является важнейшей задачей клетки. При этом поддержание уровня восстановленного глутатиона в реакции глутатионредуктазы требует наличия в системе восстановленного пула НАДФН. В течение первых 6 ч с момента наступления ишемии изменений уровня восстановленного глутатиона в тканях мозга крыс зафиксировано не было. Через сутки этот показатель уменьшался примерно в 3 раза по сравнению с тканью здоровых животных, со значения 35,1 мкг/кг до 11,8 мкг/кг ткани, соответственно (рисунок Д).
Таким образом, исследуемые нами биохимические параметры значительно изменялись лишь через сутки с момента начала развития патологии. Исключение составляет лишь общий уровень НАДФ(Н), который оказался наиболее чувствителен к ишемии ткани и существенно снижался уже через 6 ч.
По оси 0X представленных графиков указаны временные интервалы получения образцов тканей с момента окклюзии средней мозговой артерии животных. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего. В каждой группе по 4 особи.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ишемическое повреждение мозга представляет собой выраженный стресс, сопровождающийся повреждением биологических структур на молекулярном и клеточном уровнях. Защита тканей различных организмов от последствия ишемического повреждения реализуется на нескольких уровнях, а именно на стадиях предотвращения повреждений, репарации повреждений и полной замены структур, утративших функциональность.
Известно, что ишемический инсульт характеризуется избыточной и нерегулируемой продукцией АФК [9], которые представляют собой высокореакционные соединения, вступающие в широкий спектр взаимодействий с компонентами клетки. Так, одной из основных мишеней АФК в клетке являются липиды, находящиеся как в свободной форме, так и входящие в состав мембран. Перекисное окисление липидов является одним из распространенных процессов взаимодействия липидов с АФК. Данный процесс представляет собой радикальную цепную реакцию, конечными продуктами которой являются ковалентные агрегаты липидов, а также гидроперекиси липидов и эндопероксиды липидов, образующиеся в присутствии кислорода [10]. Последние, в свою очередь, вступают во внутримолекулярные перегруппировки с последующей фрагментацией углеводородных хвостов. Именно поэтому окислительный стресс в липидной фазе приводит к увеличению концентрации низкомолекулярных карбонильных соединений, таких как малоновый диальдегид (МДА). Большая часть методов, направленных на выявление окислительного стресса, так или иначе базируется на регистрации соединений данного класса [17, 18].

Взаимодействие липидов с активными формами кислорода может приводить к высвобождению свободных жирных кислот. Кроме того, гибель клеток в очагах ишемии сопровождается также гидролизом липидов [19]. Известно, что свободные жирные кислоты могут подвергаться автоокислению, кроме того, метаболизм арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути включает в себя гидропероксиды липидов и приводит непосредственно к образованию радикалов кислорода [10, 20]. В конечном счете, перечисленные факторы способствуют еще более выраженному процессу перекисного окисления.
На практике во многих исследованиях с участием пациентов или с использованием лабораторных животных детектируют уровень МДА в крови. Есть данные о том, что в первые 24 часа после ишемии уровень малонового диальдегида значительно повышается, и высокая концентрация сохраняется на протяжении 7 дней [21], показана корреляция данного параметра со смертностью пациентов, переживших инсульт. Оценка концентрации МДА в клетках головного мозга при ишемическом инсульте может дать ценную информацию о степени поражения тканей [22].

В нашей работе была использована модель перманентной окклюзии средней мозговой артерии крыс. В данных условиях зафиксировать детектируемое увеличение концентрации малонового диальдегида удалось лишь через 24 часа с момента окклюзии. Для получения полной картины происходящего в дальнейшем необходимо провести подобного рода исследования на модели ишемии-реперфузии, подразумевающей восстановление кровотока в поврежденной области. Считается, что именно реперфузия является основным мощным источником генерации АФК. Поэтому можно предположить, что гибель клеток при перманентной ишемии происходит главным образом не из-за перекисного окисления липидов. При этом очаг мертвой ткани в данной системе визуализируется уже через несколько часов с момента окклюзии сосуда. В то же время используемый нами подход TBARS- анализа крайне подвержен артефактам, вносимым на стадии пробоподготовки. Добавление антиоксидантов по типу бутилированного гидрокситолуола позволяет снизить образование малонового диальдегида под действием атмосферного кислорода, однако не предотвращает его полностью. Таким образом, зарегистрировать незначительное повышение концентрации МДА на фоне контроля становится крайне затруднительным.

В качестве одного из маркеров редокс-состояния клеток использовали концентрацию восстановленного глутатиона (GSH). Так же, как и в случае малонового диальдегида, мы не наблюдали изменения концентрации GSH в ходе активной фазы ишемического повреждения, однако его количество в ткани значительно падало спустя сутки после окклюзии. Поскольку восстановленный глутатион участвует в реакциях тиол-дисульфидного обмена, то при увеличении концентрации активных форм кислорода он переходит в окисленное состояние за счет активации ферментов антиоксидантной системы. Из этого следует, что заметное увеличение окисленных липидов и дальнейшая гибель клетки приводят к значительному уменьшению восстановленного глутатиона. Однако для однозначных выводов требуются дополнительные исследования, в том числе на модели ишемии-реперфузии. С одной стороны, продолжительное перекисное окисление может приводить к истощению пула GSH; с другой стороны, истощение пула GSH может приводить к тому, что перекисное окисление, которое до этого могло быть сдержано, начинает вызывать выраженный повреждающий эффект. Наконец, уменьшение концентрации GSH может происходить по причинам, не связанным с работой антиоксидантных систем в регионах мембран. Например, некротизация ткани в принципе будет сопровождаться неспособностью клетки поддерживать пул глутатиона в восстановленном состоянии из-за нарушения условий работы соответствующих ферментативных систем, а также недостатка восстанавливающих эквивалентов.

На исследуемой модели мы показали, что концентрация общего пула НАДФ(Н) снижается в 2 раза уже через 6 ч после окклюзии, а через 24 ч падение достигает 7 раз. Можно предположить, что снижение общего уровня НАДФ(Н) негативно сказывается на эффективности работы как антиоксидантных систем, так и анаболических процессов. Возможно, этот фактор вносит свой вклад в падение пула GSH и увеличение степени перекисного окисления липидов, о чем говорилось ранее.
Не все липиды, поврежденные в ходе перекисного окисления, могут быть подвержены репарации. Поэтому мы предполагаем, что в ходе ишемического повреждения мозга анаболические пути, направленные на синтез данных соединений, будут усилены для замены поврежденных компонентов новыми. Известно, что значение пула НАДФ(Н) напрямую связано с эффективностью биосинтеза жирных кислот и холестерина, поскольку данные метаболические пути требуют восстановительных эквивалентов. Как было сказано выше, на исследуемой модели мы наблюдали изменение общей концентрации пула НАДФ(Н), что может отразиться на эффективности обсуждаемых процессов.
Определению профиля изменения уровня свободных жирных кислот (СЖК) в плазме крови посвящено большое количество клинических и лабораторных исследований, поскольку данный параметр является потенциальным биомаркером раннего этапа ишемического инсульта. Во время инсульта происходит гидролиз фосфолипидов мозга, и в кровь высвобождаются СЖК, с чем, возможно, связано повышение их уровня в плазме в течение первых часов [23]. Также имеются данные, в которых показана корреляция уровня СЖК с тяжестью заболевания: чем выше значение параметра, тем тяжелее состояние пациента [24, 25]. В то же время изменения профиля жирных кислот в тканях головного мозга мало изучены, несмотря на их важную метаболическую роль.

В данной работе мы определяли уровень СЖК в тканях больного полушария крыс. Анализ образцов проводили через разные промежутки времени с момента окклюзии. Нам удалось зафиксировать значительное уменьшение параметра только через 24 ч после окклюзии; в острой фазе инсульта уровень СЖК совпадал с уровнем СЖК в контрольной группе. Таким образом, мы не обнаружили данных, которые бы очевидно свидетельствовали в пользу усиления синтеза жирных кислот для возмещения поврежденных компонентов мембран. Уменьшение концентрации свободных жирных кислот через сутки после окклюзии, по всей видимости, связано с гибелью клеток, которая сопровождается истощением пула НАДФ(Н), нарушением условий работы ферментов и другими факторами. На основе этого наблюдения можно предположить, что в модели перманентной ишемии крыс гидролизованные в ходе гибели клеток липиды не накапливаются в мозговой ткани.
Аналогичные данные получены и для концентрации холестерина, однако в этом случае наблюдаемое снижение значения параметра происходит раньше (уже через 6 ч с момента операции). Кроме того, концентрации холестерина и СЖК уменьшаются одинаково через 24 ч после окклюзии относительно исходного уровня метаболитов (в 1,24 раза для жирных кислот и в 1,27 раз для холестерина).

ВЫВОДЫ

На модели перманентной ишемии головного мозга были исследованы следующие параметры: концентрация общего холестерина, свободных жирных кислот (СЖК), малонового диальдегида (МДА), а также уровни восстановленного глутатиона (GSH) и общего НАДФ(Н). В результате данного исследования было выявлено, что уровени СЖК, холестерина и GSH существенно снижаются через 24 ч с момента начала развития ишемии, при этом увеличивается уровень МДА, являющегося маркером перекисного повреждения липидов. Уровень общего пула НАДФ(Н) снижается в 2 раза уже через 6 ч с момента окклюзии сосуда.