Используемые на сегодняшний день традиционные методы терапии злокачественных новообразований, такие как хирургия, радио- и химиотерапия, не отвечают требуемой эффективности лечения опухолей на поздних стадиях развития, а также рецидивирующих опухолей. Недостаточная эффективность традиционных методов лечения стимулировала появление новых направлений, значительная часть которых основана на использовании механизмов иммунного ответа [1]. Одно из таких направлений — адоптивная иммунотерапия на основе химерных Т-клеточных рецепторов. Она включает введение в организм пациента аутологичных Т-лимфоцитов, модифицированных ex vivo методами генной инженерии и несущих на своей поверхности искусственный рецептор заданной специфичности (chimeric antigen receptor, CAR). CAR представляет собой белок слияния и состоит из внеклеточного одноцепочечного вариабельного фрагмента иммуноглобулина scFv (single-chain Fv) и внутриклеточных сигнальных доменов Т-лимфоцитов [2]. В отличие от Т-клеточных рецепторов, которые узнают процессированные антигены в составе главного комплекса гистосовместимости, химерные Т-клеточные рецепторы нацелены на распознавание поверхностных нативных (непроцессированных) антигенов, ассоциированных со злокачественной трансформацией клеток [3]. Несмотря на успешность CAR-терапии в лечении гемобластозов [4], ее применение для лечения солидных опухолей сталкивается с рядом проблем, одна из которых — присутствие опухолеассоциированных антигенов на поверхности клеток здоровой ткани и связанное с этим развитие нежелательных цитотоксических эффектов [5, 6].
Другая проблема состоит в том, что злокачественные опухоли гетерогенны и могут изменяться под воздействием иммунотерапии в результате селекции, которая приводит к отбору клеток со сниженной экспрессией таргетных антигенов. Кроме того, попав в опухоль, CAR-T-клетки оказываются в иммуносупрессивном опухолевом микроокружении, которое создают иммуносупрессивные клетки (регуляторные Т-клетки, опухолеассоциированные макрофаги, миелоидные супрессорные клетки), повышенная экспрессия ряда иммуносупрессивных молекул (среди которых можно выделить PD-L1, PD-L2, CD80, CD86), гипоксия, некроз, недостаток питательных веществ [7].
Для решения перечисленных проблем были предложены различные генно-инженерные подходы к модификации техники получения CAR-Т-клеток [7–9]. Наиболее перспективны, на наш взгляд, два из них: 1) создание универсальных CAR, способных в ходе иммунотерапии переключаться и атаковать различные таргетные антигены; 2) повышение функциональной активности CAR-Т-клеток в условиях иммуносупрессивного микроокружения. Данный обзор посвящен обсуждению генно-инженерных конструкций универсальных CAR и возможности модулирования противоопухолевой активности CAR- Т-клеток путем подавления экспрессии ингибирующих рецепторов и повышения продукции цитокинов.

Универсальные CAR с переключаемым адаптерным модулем

Поскольку классические (применяемые в настоящее время в клинической практике) CAR моноспецифичны, одной из важнейших проблем терапии с их применением является утрата опухолью в ходе лечения таргетных антигенов, узнаваемых CAR-Т-клетками. Чтобы обойти трудоемкий и затратный процесс получения новых CAR-Т- клеток другой специфичности, а также расширить число одновременно или последовательно атакуемых опухолевых антигенов-мишеней, был разработан новый модульный подход, особенностью которого является разобщение антигенраспознающего и сигнального доменов классического CAR. Антигенраспознающий адаптерный модуль представляет собой отдельную молекулу, узнаваемую эктодоменом CAR. Только при наличии трех составляющих — мишени, адаптерного модуля и эффекторной CAR-T-клетки — эта система будет работать. В результате такого разделения, во-первых, возможен контролируемый запуск СAR-T-клеток, во-вторых, их быстрое выключение в случае появления токсических побочных эффектов (например, синдром высвобождения цитокинов). И в-третьих, возможно более оперативное переключение CAR-терапии с одной мишени на другую, без необходимости привлечения генной инженерии и производства CAR-T-клеток с новой специфичностью. Такая модульная система может служить в качестве универсальной CAR-системы (UniCAR). В рамках обзора мы рассмотрим наиболее перспективные на сегодняшний день разработки универсальных CAR-систем.

Модульная CAR-система с использованием биотинсвязывающих иммунорецепторов

Этот тип UniCAR-T-клеток в качестве универсального эктодомена использует авидин или стрептавидин (рис. 1А), который связывается с биотинилированными антигенспецифичными молекулами (МАТ, ScFv и другими специфичными лигандами, распознающими таргетный антиген). Первая универсальная CAR-система была основана на использовании взаимодействия биотин– авидин [10]. Ее авторы показали, что Т-клетки, несущие биотинсвязывающий иммунный рецептор (biotin-binding immunoreceptor, BBIR), использующий в качестве эктодомена димер модифицированного авидина, способны связываться с опухолевыми клетками, предварительно обработанными биотинилированными антителами, активироваться и лизировать клетки-мишени. Поскольку биотин присутствует в плазме крови человека, авторами системы было также продемонстрировано, что даже сверхфизиологические концентрации биотина не вызывают антигеннезависимой активации модифицированных CAR- Т-клеток и не ингибируют их активность. Еще один подход, использующий в качестве адапторов биотинилированные антитела, был описан в другой работе [11]. В качестве эктодомена ее авторы применили высокоаффинный мономер стрептавидина mSA2. Используя биотинилированный ритуксимаб (анти-CD20 мАТ) в качестве CAR-адаптора, они показали in vitro, что модифицированные Т-клетки активируются и лизируют клетки-мишени дозозависимым образом. Однако вопрос о возможной иммуногенности авидина и стрептавидина остается открытым и может ограничить терапевтическое применение UniCAR-T-клеток, использующих BBIR [10, 11].

Модульная CAR-система с использованием флуоресцеина изотиоцианата

В данной системе (:media_1Б) универсальный эктодомен CAR-T-клеток содержит вариабельный фрагмент scFv, направленный против синтетического флуорохрома флуоресцеина изотиоцианата (fluorescein isothiocyanate, FITC). FITC, широко используемый в качестве флуоресцентной метки для антител, в данном случае коньюгирован с моноклональными антителами (мАТ), либо рецепторным лигандом, который взаимодействует с таргетным антигеном на поверхности опухолевых клеток. В результате происходит формирование псевдоиммунологического синапса между анти-FITC-CAR-T-клеткой и опухолевой клеткой, экспрессирующей таргетный антиген. Т-клетки активируются и лизируют опухолевые клетки. В экспериментах на мышах линии NSG данная конструкция CAR-T-клеток была успешно использована против опухолей, экспрессирующих HER2 (рак молочной железы), СD20 (B-клеточная лимфома) и EGFR (рак поджелудочной железы) в сочетании с коньюгатами FITC с соответствующими мАТ (trastuzumab, rituximab и cetuximab) [12]. Как и в случае с UniCAR-T-клетками, использующими BBIR, вопрос об иммуногенности FITC остается открытым [12].

Модульные CAR-системы с использованием неоэпитопа

В данной системе адапторный модуль содержит неоэпитоп, который связан с антигенспецифичным scFv или Fab, а CAR состоит из эктодомена scFv, распознающего неоэпитоп, и внутриклеточного домена. Неоэпитопы являются экзогенными пептидами, которые отсутствуют у человека. В настоящее время разработаны две модульные системы, использующие неоэпитопы 5B9 и PNE (рис. 1В).
5B9 является неиммуногенным пептидом длиной 10 аминокислотных остатков. Его последовательность представляет пептидный мотив, обнаруживаемый в ядерном аутоантигене La/SS-B, характерном для синдрома Шегрена и системной красной волчанки [13]. Первоначально разработанная 5B9-сецифичная UniCAR-система [14] была направлена против антигенов CD33 и CD123 клеток острого миелобластного лейкоза. Причем авторами были сконструированы как моно-, так и биспецифичные антигенраспознающие модули, соединенные с эпитопом 5B9. Тестирование показало высокую эффективность лизиса клеток-мишеней при применении как двух независимых мономодулей (scFv) одновременно, так и биспецифичного модуля (bis-scFv), причем последний оказался даже более эффективным. Было установлено, что антигенраспознающие модули могут эффективно индуцировать лизис даже при очень низких концентрациях, независимо от плотности антигена на клетках-мишенях [14]. Позднее, эффективность 5B9-сецифичной UniCAR- системы была исследована в отношении солидных опухолей, с использованием клеточной и животной моделей рака простаты [15]. В данном случае неоэпитоп 5B9 был связан с scFv, направленным против PSCA (prostate stem cell antigen) — антигена стволовой клетки простаты. На мышах линии NSG с высокой и низкой опухолевыми нагрузками применение 5B9-сецифичной UniCAR-системы значительно отсрочило рост опухоли и повысило выживаемость. Интересно, что проведенный авторами анализ клеток после добавления адапторного модуля к сокультивируемым опухолевым клеткам и 5B9- сецифичным UniCAR-Т-клеткам выявил достоверное повышение экспрессии иммуносупрессирующих молекул PD-L1 и PD-L2 на опухолевых клетках и их рецептора PD-1 на эффекторных лимфоцитах по сравнению с контролем (без добавления адаптора) [15]. Позднее та же группа авторов [16] представила данные доклинических исследований об успешном совместном применении PSСA- и PSMA-специфичных (prostate specific membrane antigen) 5B9-модулей.

Второй пептид, использованный для создания UniCAR, содержащих неоэпитоп (рис. 1В), получен из траскрипционного фактора дрожжей GCN4 и назван PNE (peptide neo-epitope). PNE содержит 14 аминокислотных остатков, отсутствует в организме человека и, как можно ожидать на основе анализа in silico, должен обладать низкой иммуногенностью. Разработанные в одном из исследований адапторные модули содержали PNE, связанный с Fab-фрагментом терапевтических антител, специфичных к СD19 или СD20 [17]. Универсальный эктодомен CAR содержал scFv высокоспецифичных мАТ 52SR4, узнающих PNE. Используя мышиную модель ксенотрансплантата В-клеточной лейкемии, авторы показали дозозависимый контроль активности UniCAR-T-клеток и их тканевой локализации в местах скопления опухолевых клеток, а также секреции цитокинов [17]. Интересно, что применение высоких доз адапторных модулей приводило к экспансии клеток с фенотипом CD45RA+CD62L– (TEMRA, terminal effector memory expressing CD45RA+), в то время как при применении низких доз превалировал фенотип CD45RA–CD62L+ (central memory cells). Последний, как известно, ассоциирован с пролонгированной персистенцией CAR-T-клеток и коррелирует со стойкой ремиссией у пациентов с острым лимфобластным лейкозом и хронической лимфоцитарной лейкемией [18]. Эта же группа разработала UniCAR-систему с использованием PNE, направленную против HER2- экспрессирующих клеток опухоли молочной железы [19]. В качестве антигенраспознающей части адапторного модуля использовали Fab-фрагмент мАТ trastuzumab (clone 4D5). Был продемонстрирован дозозависимый цитотоксический эффект in vitro и полное исчезновение опухолевых очагов у мышей линии NSG, подкожно привитых клеточными линиями опухоли молочной железы с разной степенью экспрессии HER2 [19].

SUPRA CAR — модульная CAR-система с использованием мотива лейциновой молнии

Одна из наиболее перспективных разработок универсальных CAR [20] (media_1;Г) носит название SUPRA CAR (split, universal and programmable — разделяемая, универсальная и программируемая). Эта двухкомпонентная система использует для взаимодействия своих компонентов белковый мотив лейциновой молнии (leucine zipper). Она состоит из универсального рецептора (zipCAR), экспрессируемого на поверхности Т-клеток, и противоопухолевого scFv-адаптора (zipFv). Универсальный рецептор zipCAR образован путем слияния внутриклеточных сигнальных доменов (CD28, 4-1BB и CD3z) и эктодомена, содержащего мотив лейциновой молнии. Адапторный модуль zipFv состоит из антигенспецифичного scFv и тоже содержит мотив лейциновой молнии, что обеспечивает его взаимодействие с zipCAR и последующую активацию Т-клетки. Такая конструкция, в отличие от обычных CAR со строго заданной специфичностью, позволяет выбрать в качестве мишени разные антигены без дополнительных манипуляций с иммунными клетками пациента. Уникальным свойством SUPRA CAR является также возможность настройки многих параметров, способных модулировать ответ Т-клеток и, в частности, предотвратить их чрезмерную активацию. Показано, что, варьируя такие параметры, как: 1) аффинность между мотивами лейциновой молнии, 2) аффинность между опухолевым антигеном и scFv, 3) концентрация zipFv и 4) уровень экспрессии zipCAR, можно влиять на функциональную активность Т-клеток (в частности, на продукцию интерферона гамма) [20]. В случае развития у пациента такого побочного эффекта CAR- терапии как «цитокиновый шторм», активность SUPRA-CAR-T-клеток может быть снижена или полностью подавлена добавлением конкурентного низко- или высокоаффинного адаптора zipFv. Адаптер может димеризоваться с доменом лейциновой молнии специфичного zipFv, уже введенного в организм пациента, и, таким образом, препятствовать его связыванию с zipCAR. Кроме того, с помощью данной системы можно реализовать такие логические операции, как «А или В», «А и не В». Первую используют в случае необходимости атаки CAR-Т-клетками опухолевых клеток, несущих два таргетных антигена и реализуют простым добавлением двух zipFv-адаптеров, специфичных для двух мишеней и связывающихся с zipCAR. Реализация второй логической операции позволяет ослабить нежелательное цитотоксическое действие против нормальных клеток, экспрессирующих опухолевый антиген. На примере двух опухолевых антигенов авторами показана принципиальная возможность сохранить живыми клетки, несущие два таргетных антигена, один из которых опухолевый, а второй — неопухолевый [20]. Это можно реализовать путем добавления адаптера zipFv, специфичного к неопухолевому антигену, но конкурирующего с zipCAR за связывание с доменом лейциновой молнии адаптера zipFv, специфичного к опухолевому антигену. Связываясь с клеткой-мишенью, адаптеры формируют димеры, и zipFv, специфичный к опухолевому антигену, уже не может взаимодействовать с zipCAR. В результате формируется слабый цитоксический ответ Т-клеток в отношении нормальных клеток. Было показано, что использование SUPRA-CAR-Т-клеток позволяет контролировать рост опухоли в мышах линии NSG как при внутрибрюшинном введении клеток опухоли молочной железы SK-BR-3, так и при внутривенном введении клеток линии Jurkat [20]. С целью снижения иммуногенности данной системы авторы гуманизировали лейциновые молнии, используя соответствующие последовательности факторов транскрипции человека [20].

Модулирование противоопухолевой активности CAR-Т-клеток в условиях иммуносупрессивного микроокружения

Иммуносупрессивное микроокружение солидных опухолей является одним из основных факторов, препятствующих эффективной CAR-терапии. Вкупе с экспрессией ингибирующих рецепторов на поверхности CAR-Т-клеток оно негативно сказывается на эффективности последних [21]. Среди ингибирующих рецепторов можно особо выделить PD-1 (рецептор программируемой клеточной гибели) и CTLA-4 (ассоциированный с цитотоксическим Т-лимфоцитом антиген 4). На сегодняшний день их рассматривают в качестве ведущих иммунных регуляторов, с помощью которых можно осуществлять контроль активации Т-клеток и поддерживать периферическую толерантность [7, 22]. CTLA-4, взаимодействуя с CD80/86, ингибирует потенциально аутореактивные Т-клетки на начальной стадии активации наивных Т-клеток, чаще всего в лимфоузлах [23], тогда как PD1, связываясь с PD-L1/2, участвует в регуляции уже ранее активированных клеток на более поздних этапах иммунного ответа, действуя прежде всего в периферических тканях [24]. Опухолевые клетки, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие лиганды, могут использовать эти рецепторы для инактивации опухолеспецифичных лимфоцитов, в том числе CAR-T-лимфоцитов, в результате чего приобретают устойчивость к воздействию иммунной системы [22, 25]. Следует особо отметить, что при адоптивной иммунотерапии используют активированные Т-лимфоциты. Активация Т-лимфоцитов приводит к повышению экспрессии рецепторов PD-1 и CTLA-4, что делает клетки еще более чувствительными к иммуносупрессивному эффекту опухоли [25].

Одним из подходов к блокировке нежелательного взаимодействия рецептор–лиганд является использование мАТ, специфичных к рецептору или лиганду [26]. С 2011 г. в США в клинической практике для терапии метастазирующей меланомы используют ипилимумаб — мАТ, блокирующие CTLA-4 [27]. Данные клинических испытаний показали также эффективность иммунотерапии ингибиторами PD-1 и PD-L1 у пациентов с меланомой [28]. Следует отметить, что комбинированное использование препаратов анти- PD-1 (ниволумаб) и анти-CTLA-4 (ипилимумаб) у пациентов с меланомой, не получавших ранее лечение, повышало выживаемость без прогрессирования заболевания и частоту объективного ответа, по сравнению с монотерапией [29]. К настоящему времени зарегистрирован целый ряд анти-мАТ (ниволумаб, пембролизумаб, атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб), применяющихся при меланоме, немелкоклеточном раке легкого, раке мочевого пузыря и других нозологиях [27]. Однако использование данных препаратов привело к появлению целого класса новых побочных эффектов — иммуноопосредованных побочных эффектов (immune-related adverse events), к которым относят иммунный тиреоидит, гепатит, колит, миокардит и ряд других [30]. Очевидно, что иммуноопосредованные побочные эффекты обусловлены неспецифической активацией иммунокомпетентных клеток, что серьезно ограничивает возможности применения этих препаратов [30].

Альтернативным подходом к модификации функциональной активности CAR-Т-лимфоцитов является снижение экспрессии на Т-лимфоцитах ингибирующих рецепторов с помощью генетической модификации клеток ex vivo в дополнение к введению антиген-специфичного CAR-рецептора. Это может быть сделано либо с помощью трансфекции siRNA (small interfering RNA) в Т-клетки (рис. 2А) одновременно с введением ДНК- или РНК- конструкции, кодирующей антиген-специфичный рецептор [22], либо используя методы геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9 [31] (рис. 2Б). Так, было показано, что экспрессию мРНК CTLA-4 можно успешно подавить с помощью siRNA-технологии в лимфоцитах периферической крови больных хроническим гепатитом В [32]. Следует, однако, отметить, что специфичных CAR- рецепторов в клетки при этом не вводили. Недавно было показано, что трансфекция Т-клеток мРНК, кодирующей CAR-рецептор второго поколения, специфичный к антигену CSPG4 меланомы, и двумя siRNA, ингибирующими PD-1 и CTLA-4, приводила к снижению уровня поверхностного PD-1 и внутриклеточного CTLA-4 Т-лимфоцитов [25]. Авторы наблюдали статистически достоверное увеличение цитотоксического эффекта модифицированных Т-лимфоцитов в сравнении с контролем в отношении модельной клеточной линии меланомы (трансфецированной плазмидами, кодирующими PD-L1 и СD80) [25]. Метод геномного редактирования с использованием технологии CRISPR/Cas9 также был недавно применен для подавления экспрессии PD-1 и CTLA-4 [31, 33]. Технологию CRISPR/ Cas9 можно успешно использовать для инактивации гена, кодирующего PD-1, в CAR-T-лимфоцитах, что проявлялось в значительном усилении их противоопухолевой активности in vitro и in vivo [33]. Было показано, что три гена (включая PD-1) [31] и четыре гена (включая PD-1 и CTLA-4) [34] могут быть одновременно инактивированы в CAR-T-лимфоцитах с помощью технологии CRISPR/Cas9.

Другим подходом к преодолению иммуносупрессивности опухолевого микроокружения, а также для атаки опухолевых клеток, утративших таргетный антиген на своей поверхности, является придание CAR-T-лимфоцитам способности к повышенной продукции цитокинов непосредственно в тканях-мишенях (при их активации через взаимодействие CAR c клетками-мишенями). Такие модифицированные цитокин-продуцирующие CAR-T-клетки, получившие название «TRUCK» (T cells redirected for universal cytokine killing) [35] (рис. 2В), показали высокую эффективность при доставке цитокинов в опухолевое микроокружение. В доклинических исследованиях на мышиных моделях при адоптивном переносе опухолеспецифичных клеток, секретирующих IL12, показано, что накопление его в ткани опухоли улучшает Т-клеточную цитолитическую активность [36] и способствует привлечению и активации клеток врожденного иммунитета [37]. Показано также, что секреция IL12 локально влияет на миелоидные супрессорные клетки, дисфункциональные дендритные клетки, альтернативно активированные макрофаги и перепрограммирует их в функционально активные антигенпрезентирующие клетки, способные представлять опухолеассоциированные антигены Т-клеткам, инфильтрирующим опухоль, или TIL (tumor-infiltrating lymphocytes), что приводит к регрессии больших опухолевых очагов [38]. Клинические испытания по введению пациентам с метастатической меланомой аутологичных TIL, экспрессирующих IL12 под контролем NFAT-регуляторных элементов (nuclear factor of activated T-cells, ядерный фактор активированных Т-клеток), показали объективный клинический эффект у 10 из 16 пациентов при более низкой дозе клеток по сравнению со стандартным протоколом [39]. Однако у многих из пациентов наблюдали серьезные побочные эффекты (тяжелую гепатотоксичность, гемодинамическую нестабильность), вследствие чего испытания были остановлены [39]. Выраженная цитотоксичность TCR-Т- клеток с NFAT-регулируемой экспрессией IL12 выявлена in vivo в экспериментах на мышиной модели [40]. Положительного результата (отсутствия токсичности in vivo) удалось добиться другим авторам [41], поставившим экспрессию IL12 под контроль TET-On-промотора, чувствительного к доксициклину. Временной экспрессии IL12 было достаточно, чтобы ингибировать рост меланомы B16F10, не вызывая системной цитотоксичности.

Наряду с IL12 исследовали влияние повышенной секреции интерлейкинов IL15 и IL18 на противоопухолевую активность CAR-T- и TCR-T-лимфоцитов. Показано, что продукция IL15 способствует выживанию и пролиферации модифицированных ex vivo CAR-T-клеток, специфичных к таким мишеням, как CD19 (при лейкемии/лимфоме) [42] и IL13Rα2 (при глиобластоме) [43]. В экспериментах на мышиной модели меланомы введение модифицированных TCR-Т-клеток с NFAT-регулируемой экспрессией IL18 показало их безопасность (отсутствовали какие-либо побочные токсические эффекты), а также привело к повышению числа CD8-клеток в опухолевом очаге и усилению противоопухолевой активности [40]. Показано, что CD4-CAR-T-клетки, секретирующие IL18, активируют СD8-Т-клетки, которые пролиферируют и усиливают противоопухолевый ответ у мышей с меланомой B16F10 [44]. Кроме того показано, что CAR-T-клетки, секретирующие IL18, индуцируют в опухоли острую фазу иммунного ответа по Th1-типу, что приводит к повышению выживаемости мышей с опухолями поджелудочной железы и легких [45].

ВЫВОДЫ

На сегодняшний день CAR-терапию успешно применяют в клинической практике для лечения гематологических онкозаболеваний. Однако простая экстраполяция опыта использования CAR в терапии гемобластозов на солидные опухоли невозможна в связи с вероятностью возникновения неприемлемых побочных эффектов из-за токсичности CAR-T-лимфоцитов в отношении нормальных клеток, а также ослаблением функциональной активности CAR-T-клеток в условиях иммуносупрессивного микроокружения солидных опухолей. В настоящее время наметились пути решения этих проблем, такие как создание универсальных CAR, способных быстро переключаться и атаковать различные таргетные антигены, и придание CAR-T-клеткам устойчивости к иммуносупресивному влиянию путем их дальнейшей модификации генно-инженерными методами. Интенсивные исследования, проводимые в этих двух направлениях, показывают обнадеживающие результаты, что позволяет надеяться на появление арсенала CAR- Т-клеток, способного обеспечить эффективную и безопасную для пациентов клеточную терапию солидных злокачественных новообразований.