Герпесвирусы — большое семейство ДНК-содержащих вирусов, которые поражают человека и животных. Вирусы обладают протяженным геномом, кодирующим около 100– 200 генов, чья репликация происходит в ядре зараженной клетки. Сборка и выход новых вирусных частиц из клеток сопровождаются цитолизом. Особенностью вирусов семейства является способность к существованию в латентной форме. Полноразмерный геном герпесвируса при этом сохраняется в ядре клетки в форме эписом, реплицирующихся с той же скоростью, что и геном клетки-хозяина, и распределяющихся между дочерними клетками в процессе деления за счет ассоциации с центромерными участками хроматид. Латентная форма существования герпесвирусов сопровождается экспрессией небольшого числа специализированных генов и протекает бессимптомно [1]. Представители подсемейства гамма-герпесвирусов, обладающие тропизмом к лимфоидным клеткам, нередко обладают онкогенными свойствами: вирус Эпшнейна–Барр (ВЭБ) [2] и вирус саркомы Капоши (ВСК) [3] ассоциированы с лимфопролиферативными заболеваниями, в частности В-клеточными неоплазиями. ВЭБ часто является причиной спонтанной иммортализации В-клеток, полученных из крови здоровых людей [4].

Филогенетический родственник ВСК, гамма-герпесвирус из подсемейства радиновирусов Herpesvirus saimiri (HVS) поражает беличьих обезьянок Нового света. Инфекция чаще всего протекает бессимптомно, и большинство обезьян этого вида являются латентными носителями вируса. Примечательно, что заражение этим вирусом других видов обезьян Нового света приводит к стремительному развитию Т-клеточных лейкозов и быстрой гибели животных. В опытах с мононуклеарными клетками животных было показано, что вирус способен вызывать спонтанную иммортализацию Т-лимфоцитов [5]. Такое же действие обнаружено и при инфицировании штаммами С HVS человеческих лимфоцитов и натуральных киллеров [6]. Клетки приобретали способность к неограниченной IL2-зависимой пролиферации, не теряя фенотипических признаков зрелых Т-лимфоцитов и натуральных киллеров [7]. Экспрессия сохранялась у трех вирусных генов: ассоциированных с трансформацией STP и TIP [8], а также у ORF73 [9] — гомолога ассоциированного с латентностью антигена (LANA) ВСК, который необходим для распределения эписом между дочерними клетками в процессе митоза [10]. Геном вируса оставался в них в латентной форме, а попытки вызвать развитие литической инфекции либо иным способом зафиксировать появление вирулентных частиц в культурах иммортализованных лимфоидных клеток человека или обезьян Старого света оканчивались неудачей. В опытах на макаках было показано, что аутологичная реинфузия Т-лимфоцитов, иммортализованных наиболее агрессивным штаммом HVS C488, не приводит к развитию неоплазий. Вирусная ДНК могла быть обнаружена в образцах периферических мононуклеаров животных в течение как минимум 16 недель, а сами животные приобретали иммунитет к инфекции HVS [11].

Для создания модифицированных вариантов герпесвирусов, способных выступать в качестве векторов для экспрессии трансгенов, была успешно использована гомологичная рекомбинация участков вирусного генома в пермиссивных клеточных культурах, а также рекомбинирование в бактериальных хромосомах (bacterial artificial chromosome, BAC) [12]. В бактериальную хромосому клонировали геном HVS штамма A11-S4. Геном HVS содержит несколько гомологов клеточных генов, большинство из которых встречаются и у других вирусов подсемейства. В отличие от остальных, ген vCD59 не встречается в геноме других гамма-герпесвирусов, а рецептор, последовательность которого он кодирует, отвечает за подавление опосредованной комплементом цитотоксичности [13]. Этот ген экспрессируется только в литической фазе и не нужен для наработки вирусных частиц в условиях in vitro. В работах, посвященных созданию векторов на основе HVS, последовательность vCD59 успешно замещали экспрессионными кассетами [14].
Совокупность имеющихся данных позволяет сделать предположение, что HVS можно использовать для создания новых клеточных иммунотерапевтических агентов [15]. HVS-трансформированные Т-лимфоциты и НК-клетки сохраняют свои эффекторные функции и могут быть таргентированы против опухолевых антигенов за счет экспрессии химерных рецепторов. Основное преимущество такого подхода в возможности получения неограниченного количества эффекторных клеток из относительно небольших обьемов периферической крови пациента либо проведения аллогенных трансплантаций клеточных препаратов. Большой размер генома HVS и его высокая емкость как вектора [14] делают возможным проведение иммортализации и трансдукции экспрессионной кассетой в один этап. Целью настоящей работы было создание быстрого способа получения рекомбинантных вариантов HVS на основе штамма С488, которые могут быть использованы для введения в геном вируса разнообразных трансгенов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток и наработка вирусных препаратов

Использованные в работе линии клеток HEK-293Т (культура человеческих трансформированных клеток), OMK (культура клеток почки ночной обезьяны Aotus trivirgatus), A549 (культура клеток легочной карциномы) были получены из Американской коллекции типовых клеточных культур (ATCC; США). Их культивировали в среде DMEM-F12 (PAA; Австрия), в которую добавляли 10%-ю эмбриональную сыворотку теленка, 2 мМ аланилглутамина (ПанЭко; Россия), 20 мМ HEPES и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (ПанЭко; Россия).
Периферические мононуклеарные клетки (PBMC) культивировали в среде RPMI-1640 (PAA; Австрия) с добавлением 10%-й эмбриональной сыворотки теленка, 2 мМ аланилглутамина (ПанЭко; Россия), 20 мМ HEPES и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, а также 70 нг/мл IL2 (Peprotech; США). Все клетки содержали в условиях 5%-го CO₂ при 37 °С.
Вирус штамма HVS-C488 (VR-1414) был получен из ATCC. Для наработки вирусных препаратов субконфлюэнтную культуру клеток линии ОМК заражали небольшим количеством вируса (MOI < 0,1) и культивировали в соответствующей питательной среде в течение 5–15 дней до наступления полного цитолиза. Затем собирали вируссодержащую жидкость и центрифугировали 15 мин при 5000 g на центрифуге Eppendorf 5920R (Eppendorf; ФРГ) для удаления клеточного дебриса. Собирали супернатант, разделяли на рабочие порции и хранили при –20 °С.

Плазмидные конструкции

Плазмиды с экспрессорами поверхностных гликопротеинов кори pCG-4AHcΔ24 и pMD2-FΔ30 были получены ранее. Для введения в геном HVS экспрессионной кассеты создали конструкцию pUC-HVS-OFP. Участок вирусного генома, кодирующий vCD59, использовали как сайт для проведения рекомбинации. В качестве гомологичных участков были выбраны 600-нуклеотидные последовательности, соответствующие 3'- и 5'-концам vCD59. Фрагменты ДНК получали при помощи ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК, выделенной из концентрированного препарата HVS. Между фланкирующими участками в экспрессионную кассету был помещен промотор вируса некроза селезенки мышей (SFFV) и последовательности генов устойчивости к пуромицину (pac) и оранжевого флуоресцентного белка (OFP), экспрессируемые полицистронно за счет помещенной между ними последовательности сигнального пептида Т2А. Последовательность, состоящая из фланкирующих участков по 600 п.н. каждый, гомологичных области vCD59 генома HVS, и расположенной между ними экспрессионной кассеты, клонировали в плазмиду-носитель pUC18 (рис. 1) по рестриктным сайтам NotI и BamHI. Клонируемый фрагмент собрали из трех частей методом перекрывающего ПЦР [16]. Праймеры, использованные для амплификации участков генома HVS и экспрессионной кассеты, представлены в табл. 1. Последовательности готовых конструкций и препараты ДНК рекомбинантного HVS верифицировали при помощи секвенирования по Сэнгеру (Евроген; Россия).

Трансфекция

Для определения наиболее эффективного способа трансфекции клеток линии ОМК использовали катионный полимер полиэтиленимина 25 кДА (PEI-25) (Polysciences; США), катионный липид Lipofectamine 2000 (Invitrogen; США), а также электропорацию. За сутки до проведения трансфекции клетки рассеивали на культуральные чашки диаметром 10 см (SPL; Корея) в количестве 2 × 106 клеток на чашку. Для трансфекции использовали либо кольцевую форму плазмиды pUC-HVS-OFP, либо линеаризованную непосредственно перед проведением трансфекции путем рестрикции по сайтам расщепления эндонуклеазами NotI и BamHI. Для трансфекции с помощью PEI-25 использовали описанные ранее условия и буферы [17]: плазмидную ДНК смешивали с PEI-25 (5 мкг/мкл) в соотношении 6 : 1 в лактатном буфере с pH 4, смесь инкубировали в течение 15 мин, после чего добавляли среду OptiMEM (Invitrogen; США) и вносили в культуральную среду на чашки с клетками. Для определения оптимальных условий трансфекции проводили трансфекцию с 3, 5, 10, 15 и 20 мкг кольцевой плазмиды, либо с 1, 3, 5, 10 или 15 мкг линеаризованной плазмиды. Трансфекцию при помощи катионного липида Lipofectamine 2000 (Invitrogen; США) проводили в соответствии с рекомендациями производителя; использовали по 7, 10 и 15 мкг плазмидной ДНК в кольцевой либо линеаризованной форме и 17,5, 25 и 37,5 мкл реагента соответственно. Через 3 ч после постановки трансфекции обоими методами проводили смену среды на обычную, используемую для культивации клеток OMK. Для проведения электропорации клетки открепляли от чашек при помощи раствора TrypLE (Gibco; США), центрифугировали при 1100 об./мин в течение 5 мин на центрифуге Eppendorf 5702 (Eppendorf; ФРГ), осажденные клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера. Саму электропорацию проводили при помощи электропоратора GenePulser (Bio-Rad; США) в кюветах с межэлектродным расстоянием 4 мм, с параметрами 300 v / 500 uF, либо 200 v / 250 uF, перед электропорацией к клеткам добавляли по 5 либо 10 мкг кольцевой или линейной плазмидной ДНК. После электропорации клетки немедленно высеивали чашки диаметром 10 см с добавлением 10 мл полной питательной среды. Через 48 ч после постановки трансфекции, долю трансфицированных клеток измеряли на проточном цитометре FacsVantage SE (Beckton-Dickinson; США). Оценку жизнеспособности клеточных культур производили путем подсчета клеток в образцах после их открепления при помощи TrypLE и окрашивания раствором трипанового синего (Панэко; Россия) при помощи Cytosmart Cell Counter (Corning; США).

Трансфекцию проводили на 6-луночных планшетах в среде для культивирования OptiMEM с использованием PEI-25 на клетках HEK-293T в плотности 40–60% от монослоя, рассеянных накануне. Использовали плазмиды pUC-HVS-OFP, содержащие экспрессионную кассету, фланкированную гомологичными участками из генома HVS, и плазмиды, экспрессирующие поверхностные гликопротеины F (от англ. fuion protein — белок слияния) и H (от англ. haemagglutinin — гемагглютинин) вакцинного штамма (ЭШЧ) вируса кори. Для экспрессии белков F и H использовали плазмиды pMD2-FΔ30 и pCG-4AHcΔ24 соответственно; pMD2-FΔ30 кодировала последовательность белка F c укороченным на 30 аминокислотных остатков С-концевым цитоплазматическим доменом, а pCG-4AHcΔ24 кодировала последовательность белка H, в которой первые 24 аминокислоты N-концевого цитоплазматического домена были замещены четырьмя остатками аланина, белки экспрессировались под контролем цитомегаловирусного промотора. При проведении котрансфекции плазмиды pUC-HVS-OFP, pMD2-FΔ30 и pCG-4AHcΔ24 смешивали в соотношении 8 : 7 : 1 соответственно. После трехчасовой инкубации клеток с трансфекционной смесью клетки диссоциировали раствором трипсина (ПанЭко; Россия) и культивировали совместно с инфицированными HVS-C488 клетками линии ОМК в соотношениях, представленных в табл. 2.

Титрование и клонирование вирусных препаратов

Для определения инфекционного титра вируса осуществляли инфекцию последовательными пятикратными разведениями вирусного препарата клеток ОМК в 96-луночных планшетах (Greiner; Австрия) в четырех повторностях. После наступления цитопатического действия (ЦПД) рассчитывали инфекционный титр методом Рида–Менча. Для клонирования рекомбинантного HVS-OFP на лунки 96-луночного планшета, в которые за 24 ч до этого были рассеяны свежие клетки линии ОМК в субкофлюэнтном количестве, добавляли культуральную среду, содержащую предварительно отсортированные на проточном клеточном сортировщике FacsVantage SE (Beckton-Dickinson; США) инфицированные флуоресцирующие клетки ОМК в известной концентрации, из расчета 10, 1, 0,1 и 0,01 инфицированной клетки на лунку. Через 5–7 дней в лунках определяли наличие единичных флуоресцирующих фокальных очагов ЦПД.

Определение рекомбинантов

Для подтверждения события рекомбинации клонированные препараты HVS-OFP концентрировали при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra 3 kDa (Merck; Германия), после чего определяли наличие целевой вставки в геноме HVS при помощи ПЦР с праймерами vCD59 F1 diag dir и vCD59 F2 diag rev. Продукт реакции длиной ~3000 п.н. указывал на присутствие целевой вставки, а длиной ~1200 п.н. — на вирус «дикого» фенотипа.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ Prism 6.0 (GraphPad Software; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения рекомбинации и получения трансгенного варианта HVS-C488 была создана экспрессионная кассета, содержащая два селективных маркера — ген оранжевого флуоресцентного белка OFP и ген устойчивости к пуромицину, кодирующий пуромицин-N-ацетилтрансферазу (Pac). Поиск оптимальных условий трансфекции вируспермиссивных клеток линии ОМК показал, что наибольшей эффективности можно добиться при использовании PEI-25 и линейного фрагмента экспрессионной кассеты (соотношение PEI : ДНК составляет 6 : 1; 10 мкг ДНК на 2 × 106 клеток; табл. 3), однако доля трансфицированных клеток не превышала 5% от общей численности популяции (рис. 2). Увеличение количества ДНК и трансфекционного агента приводило к сильному снижению жизнеспособности клеточной культуры; при использовании электропорации снижения жизнеспособности не наблюдалось, однако доля трансфицированных клеток оставалась крайне малой. Чтобы оценить, может ли трансфекция с максимальной достигнутой эффективностью приводить к образованию рекомбинантных вирусных частиц, вызывающих экспрессию селективных маркеров в инфицированных клетках, мы собрали осветленные вируссодержащие культуральные жидкости с предварительно инфицированных HVS-C488 клеток линии ОМК, которые были трансфицированы при помощи PEI-25 и линейного фрагмента экспрессионной кассеты. Культуральные жидкости были использованы для инфицирования свежих ОМК, последующее наблюдение за которыми не выявило наличия клеток, экспрессирующих флуоресцентный маркер.

Чтобы повысить вероятность рекомбинации HVS и экспрессионной кассеты, был разработан альтернативный способ доставки модифицированной ДНК в пермиссивные клетки. Мы предположили, что способность поддерживать литический цикл развития вируса у клеток линии ОМК сохранится после слияния с некоторым количеством непермиссивных клеток НЕК-293Т, которые непосредственно перед этим могут быть трансфицированы экспрессионной кассетой. Для проведения рекомбинации в смешанной клеточной системе клетки линии НЕК-293Т трансфицировали линеаризованной экспрессионной кассетой либо нелинеаризованной плазмидой, ее содержащей, совместно с плазмидами, кодирующими поверхностные гликопротеины вакцинного штамма вируса кори (белки F и Н с укороченными цитоплазматическими доменами), появление которых на клеточной мембране вызывает слияние контактирующих клеток в синцитии за счет связывания с рецептором CD46 (рис. 3Г, Д). Через 3 ч после трансфекции клетки переводили в суспензию и рассеивали на лунки совместно с клетками ОМК, которые за 2 дня до трансфекции были заражены HVS-C488 (MOI = 4) в различных соотношениях и плотностях посадки (см. табл. 2).
Через 4 дня после начала совместной культивации с клеток собирали вируссодержащий супернатант и определяли инфекционный титр вируса. После сравнения концентраций инфекционных частиц образец № 5 был выбран в качестве оптимального для селекции моноклонального рекомбинантного вируса, поскольку в нем зафиксировали максимальный инфекционный титр относительно общего содержания вируспермиссивных клеток и их соотношения с клетками НЕК-293Т.

Вируссодержащую среду, собранную с образца № 5, использовали для инфицирования ОМК (MOI = 0,01), через 7 дней в конфлюэнтной клеточной культуре начали образовываться фокальные участки развития цитолитической инфекции, среди которых были обнаружены отдельные бляшки, сформированные преимущественно флуоресцентными клетками (рис. 3Б). Популяцию флуоресцирующих клеток отсортировали и использовали для инфицирования пермиссивных клеток на 96-луночном планшете из расчета 10, 1, 0,1 и 0,01 инфицированных клеток на лунку. Через 10 дней после инфицирования в образцах, подвергшихся заражению с множественностью 0,1 клеток на лунку были зафиксированы 3 (из 96) единичные флуоресцентные бляшки, образованные, по-видимому, индивидуальными рекомбинировавшими вирусными частицами. Вируссодержащую среду из лунки № 2, в которой был зафиксирован наиболее активно развивающийся литический процесс, использовали для наработки препаративных количеств рекомбинантного вирусного препарата и его анализа.
Секвенирование участка vCD59 ДНК препарата рекомбинантного герпесвируса HVS-OFP показало наличие в нем целевой экспрессионной кассеты. Трансдукция периферических мононуклеарных клеток и клеток линии A549 вирусом HVS-OFP (MOI = 5) привела к образованию фракций флуоресцирующих клеток (рис. 3В, Г); для линии А549 их доля сохранялась постоянной в течение 5 недель после инфицирования, а для PBMC — постоянно увеличивалась (рис. 3A). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что полученный рекомбинантный вариант герпесвируса HVS-OFP не утратил способности находиться в клетках в латентной форме и вызывать иммортализацию нормальных лимфоидных клеток. Экспрессия введенной кассеты при этом сохраняется как в литической, так и в латентной фазе существования герпесвируса.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данном исследовании был разработан и успешно испытан новый подход для генетической инженерии герпесвирусов методом рекомбинации. Использование экспрессионной кассеты, содержащей два селективных маркера, было обусловлено результатами испытания разных способов повышения вероятности прохождения рекомбинации — предполагалось, что проведение селекции с пуромицином либо сортировки флуоресцентных ОМК непосредственно после трансфекции позволит удалить из популяции нетрансфицированные клетки. Попытки реализовать такую схему селекции показали, что времени, проходящего с момента введения экспрессионной кассеты до проявления цитопатического действия и выхода вируса в среду, недостаточно для селекции с помощью пуромицина, а стресс, сопутствующий флуоресцентной сортировке трансдуцированных клеток, приводит к подавлению продукции вируса. Вместе с тем, наличие двух селективных маркеров позволяет с большим удобством проводить отбор и мониторинг доли клеточной популяции, трансдуцированной рекомбинантным HVS. Применительно к использованному вирусному штамму HVS-C488 разработанный подход позволяет обойти главное препятствие — низкую эффективность трансфекции пермиссивной клеточной популяции трансгенной кассетой [18], в то время как для других описанных на настоящий момент методик рекомбинации HVS этот этап является ключевым [15, 19]. Эффективность прохождения рекомбинации зависит от длины рекомбинируемого участка, поэтому введение экспрессоров нескольких генов с большой общей протяженностью потребует либо нескольких последовательных стадий рекомбинирования, либо масштабирования трансфекции и селекции на большее количество клеток. При выполнении подобных задач разработанный метод уступает по своей эффективности методам рекомбинирования в бактериальной хромосоме, которые показали свою эффективность, в том числе при манипулировании геномом HVS [20, 21]. Хотя рекомбинирование в эукариотической системе в целом отличается большей трудоемкостью, чем проведение аналогичных манипуляций в бактериальной хромосоме, этот метод может быть предпочтительным, когда требуется создание единичных трансгенных вариантов, либо для поготовки вирусного генома к клонированию в BAC, например добавления селективной кассеты для облегчения рекомбиниринга. Такое применение представляется нам особенно интересным в связи с тем, что геном штамма С488, который способен с наибольшей эффективностью вызывать трансформацию человеческих Т-лимфоцитов и натуральных киллеров [22], пока не был клонирован в BAC.

В перспективе разработанный метод может позволить получать химерные вирусные частицы, лишенные генов, необходимых при развитии литической инфекции, и пригодные для препаративного получения иммортализованных лимфоидных клеток с целью проведения иммунотерапии. Стоит отметить, что большая клонирующая емкость герпесвирусного вектора [23] позволяет использовать его для одновременной доставки практически всего инструментария CAR-T клеточной терапии — моно- и биспецифичных химерных антигенных рецепторов либо даже их полноразмерных пар для точного нацеливания на специфический фенотип опухолевых клеток; средств подавления экспрессии рецепторов иммунных контрольных точек для снижения чувствительности к иммуносупрессивным сигналам; индуцируемых экспрессионных кассет для секреции цитокинов, стимулирующих опухолевое микроокружение, а также защитных механизмов, позволяющих индуцировать «самоубийство» модифицированных лимфоцитов и быстро элиминировать их из организма пациента в случае развития побочных эффектов терапии либо успешного окончания лечения. В сочетании со способностью к иммортализации периферических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров такой вектор можно использовать в целях создания серии готовых препаратов для аллогенной клеточной иммунотерапии, которые могут быть практически неограниченно наработаны ex vivo.

ВЫВОДЫ

Использование совместной культивации трансфицированных экспрессионной кассетой и экспрессорами поверхностных гликопротеинов кори Fd30 и Hd24 в соотношении 8 : 1 : 7 клеток линии HEK-293T и инфицированных за 48 ч до эксперимента диким вариантом HVS-С488 пермиссивных клеток линии ОМК (MOI = 4) в соотношении 27 : 200 привело к высокой частоте возникновения рекомбинантных вирусных частиц (~3%) и позволило за три пассажа получить готовый вирусный препарат с интегрированной экспрессионной кассетой. Полученный рекомбинантный герпесвирус HVS-OFP сохранял способность вызывать литическую инфекцию только в пермиссивных клетках линии ОМК и самоподдерживаться в латентной фазе в клетках линии A549. Вирус вызвал иммортализацию человеческих периферических мононуклеарных клеток, также сохраняясь в них в латентной форме. Введенная в геном вируса экспрессионная кассета оставалась работоспособной как в процессе литической инфекции, так и в латентной форме существования герпесвируса.