Инсульт занимает второе место в структуре смертности в России, по количеству случаев следуя за инфарктом миокарда. По данным Всемирной организации здравоохранения инвалидами становятся 70–80% выживших после инсульта пациентов [1–2]. Только тромболитическая терапия имеет доказанную фармакологическую эффективность в остром периоде ишемического инсульта, но для нее существует целый спектр ограничений в применении, главным из которых является узкий временной интервал. Лишь 5% пациентов с острым ишемическим инсультом получают тромболитическую терапию [1]. Восстановительная терапия охватывает гораздо более широкий временной интервал, измеряемый неделями и месяцами, поэтому многие исследователи ведут разработку лекарственных препаратов именно в контексте восстановительной медицины.
В последние годы как в России, так и за рубежом появился ряд инновационных разработок по указанной тематике [3–5].
В отделе медицинской химии и токсикологии НИИ трансляционной медицины РНИМУ им. Н. И. Пирогова было синтезировано новое соединение, содержащее в качестве фармакофорного фрагмента производное 4-фенилпирролидинона-2 (лабораторный шифр VRF_11) [6], которое, по данным исследований in silico [7], потенциально способно проявлять антиишемическую, ноотропную и цитопротекторную активность.
В ходе исследования был установлен профиль безопасности вещества. Для подтверждения данных об антиишемической активности нового соединения было необходимо установить режим дозирования и определить основные фармакокинетические параметры.
Целью настоящего исследования было изучить фармакокинетику VRF_11 и подобрать наиболее эффективный режим дозирования для коррекции неврологической симптоматики в модели фокальной церебральной ишемии головного мозга крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на 85 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 220 ± 12 г на момент начала исследования. Крысы были получены из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животных содержали в конвенциональном виварии РНИМУ им. Н. И. Пирогова с автоматической сменой дневного и ночного периода (08:00–20:00 — «день», 20:00–08:00 — «ночь»), как минимум 12-кратной сменой воздушного объема комнаты в течение часа, оптимальной температурой 20–24 °C и влажностью 45–65%. Для кормления животных использовали полнорационный сухой гранулированный комбикорм «Чара» для лабораторных животных («Ассортимент-Агро»; Россия; ветеринарное свидетельство ф. 3 250 № 3828680, декларация соответствия № РОСС RU.ПН88.Д07428, срок действия до 27.05.2021), который давали ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. Животных поили водой, очищенной в соответствии с ГОСТ 51232-98. Воду в стандартных поилках со стальными крышками-носиками давали ad libitum. В качестве подстила использовали обеспыленный подстилочный материал Rehofix (JRS; Германия).

Проводили две серии экспериментов.
В первой серии исследовали фармакокинетику соединения VRF_11, которое вводили в виде раствора 200 мг/мл, внутривенно, в хвостовую вену иглой 0,4 × 8 мм (27G), соблюдая правила асептики и антисептики (в дозе 250 мг/кг). Определяли концентрацию вещества в плазме крови и ткани головного мозга в разных временных точках. Забор крови осуществляли через 15, 30, 60, 120, 240 мин, 8, 12, 24 и 48 ч из хвостовой вены в объеме 100–150 мкл (в пробирки с ЭДТА). Для изучения накопления VRF_11 в головном мозге крыс подвергали эвтаназии в СО2-боксе, после чего препарировали сердечную мышцу, вставляли канюли и промывали тушку 1 л холодного раствора NaCl (0,9%). Головной мозг извлекали, выделяли кору больших полушарий. Выделенную структуру замораживали и хранили при температуре –80 °С, плазму также замораживали и хранили при –30 °С.
В соответствии с рекомендациями по изучению фармакокинетики [8] были сформированы группы животных, по 6 особей в каждой
(табл. 1).
Концентрации VRF_11 в образцах плазмы и мозга крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Спектрофотометрический детектор SPD-20A (Shimadzu; Япония) использовали для определения концентраций VRF_11 в диапазоне 10 мкг/мл–1 мг/мл, а масс-спектрометрический детектор LC/MS 8030/8040 (Shimadzu; Япония) — для определения концентраций VRF_11 в диапазоне 10 нг/мл–10 мкг/мл. Калибровочные кривые с диапазоном концентраций VRF_11 от 20 до 1000 мкг и от 10 нг до 50 мкг были построены с использованием сток растворов VRF_11 и плазмы интактных животных.

Определение концентрации VRF_11 в диапазоне 10 мкг/мл – 1 мг/мл

Для определения концентрации препарата в плазме крови животных проводили следующую пробоподготовку. К 100 мкл плазмы крови животных добавляли 300 мкл ацетонитрила, содержащего 0,5% муравьиной кислоты. После перемешивания и центрифугирования на центрифуге CM-50 (ELMI; Латвия) на скорости 12499 об./мин в течение 3 мин производили отбор надосадочной жидкости с ее последующим упариванием на вакуумном роторном испарителе SpeedVac Savant SPD 1010 (Thermo Scientific; США) при комнатной температуре в течение 2 ч. Полученный сухой остаток повторно растворяли в 200 мкл подвижной фазы. Для приготовления подвижной фазы в 850 мл деионизированной воды растворяли 1,36 г дигидроортофосфата калия (KH2PO4). К полученному раствору добавляли 1,625 мл диэтиламина и 150 млацетонитрила. Условия хроматографирования: элюирование в изократическом режиме; применение аналитической колонки NUCLEODUR C18 ec 250/4.6 (Macherey-Nagel; Германия) с зернением 5 мкм; температура колонки — 40 °С ± 0,1; скорость потока элюента — 0,8 мл/мин, объем раствора на вкол — 10 мкл; рабочая длина волны — 220 нм.

Определение концентраций VRF_11 в диапазоне 10 нг/мл – 10 мкг/мл

Для определения концентрации препарата в плазме крови животных проводили следующую пробоподготовку. К 100 мкл плазмы крови животных добавляли 300 мкл ацетонитрила, содержащего 0,5% муравьиной кислоты. После перемешивания и центрифугирования (условия центрифугирования аналогичны описанным выше) супернатант упаривали на вакуумном роторном испарителе (условия описаны выше) и повторно растворяли в 200 мкл элюента. Условия хроматографирования: аналитическая колонка Discovery® C18 HPLC Column (Supelco/Sigma-Aldrich; США) с зернением 5 мкм, L × I.D. 15 см × 4.6 мм; температура колонки — 40 °С ± 0,1; скорость потока элюента — 0,8 мл/мин; объем раствора на вкол — 10 мкл.
Механизм анализа — ионизация распылением в электрическом поле (ESI). Температура линии десольватации (DL) составляла 250 °С, нагревательного блока — 400 °С. Скорость потока распыляющего газа — 2 л/мин, осушающего газа — 15 л/мин.
Напряжение на капилляре — 4,5 кВ. Давление газа для соударительной диссоциации (CID) составляло 60 кПа.
Для определения концентрации VRF_11 в ткани головного мозга к 70–100 мг мозга животных добавляли 1,5 мл ацетонитрила, содержащего 0,5% муравьиной кислоты, и гомогенизировали в стеклянном ручном гомогенизаторе в течение 3 мин. Полученную взвесь дважды центрифугировали (условия центрифугирования аналогичны описанным выше). Затем надосадочную жидкость упаривали на вакуумном центрифужном испарителе (условия описаны выше). К сухому остатку добавляли 300 мкл смеси деионизированной воды с ацетонитрилом в соотношении 100 : 5 и интенсивно перемешивали в течение 5 мин. Затем центрифугировали (условия описаны выше). Супернатант анализировали. Подвижная фаза состояла из смеси 700 мл деионизированной воды, 3,5 мл муравьиной кислоты и 300 мл ацетонитрила. Условия хроматографирования: элюирование в изократическом режиме; аналитическая колонка Discovery® C18 HPLC Column (Supelco/Sigma-Aldrich; США) с зернением 5 мкм, 150/4,6; температура колонки — 40 °С ± 0,1; скорость потока элюента — 0,8 мл/мин; объем раствора на вкол — 10 мкл. Метод ионизации — ионизация распылением в электрическом поле. Температура линии десольватации (DL) блока составляла 250 °С, нагревательного блока — 400 °С. Скорость потока распыляющего газа — 2 л/мин, осушающего газа — 15 л/мин.
Напряжение на капилляре — 4,5 кВ. Давление газа для соударительной диссоциации (CID) составляло 60кПа. Обработку и анализ полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения LabSolution вер. 5.80 (Shimadzu; Япония) и Borgia 1.03 (Наука Плюс; Россия), а также приложений Microsoft Excel (Microsoft; США) и Statistica 12 (Statsoft; США).

Во второй серии экспериментов у крыс моделировали инфаркт мозга и исследовали влияние VRF_11 в дозах 250 и 125 мг/кг на неврологическую симптоматику и поведение.
Экспериментальный инфаркт мозга моделировали путем эндоваскулярной транзиторной окклюзии средней мозговой артерии по модифицированному методу Коидзуми [9, 10] с последующей реперфузией. Срок окклюзии среднемозговой артерии составлял 90 мин.

Были сформированы следующие группы животных, в каждой группе было по 8 особей.
1. Контрольная группа. Животным через 24 ч после реперфузии внутривенно вводили физиологический раствор 1 раз в сутки (5 дней).
2. Опытная группа. Животным через 24 ч после реперфузии внутривенно вводили VRF_11 в дозе 125 мг/кг 1 раз в сутки (5 дней).
3. Опытная группа. Животным через 24 ч после реперфузии внутривенно вводили VRF_11 в дозе 250 мг/кг 1 раз в сутки (5 дней).

Магнитно-резонансную томографию (МРТ) экспериментальных животных в динамике проводили на МР-томографе ClinScan (Bruker BioSpin; Германия) с индукцией магнитного поля 7 Тл. Для оценки объема очага инфаркта мозга МР-исследование выполняли на 1-е, 7-е, 14-е, 28-е сутки после окклюзии. МР-протокол предполагал получение T2-взвешенных изображений с синхронизацией по дыханию (TurboSpinEcho, Turbo Factor = 10, TR/TE = 5230/46 мс, размер воксела — 0.117*0.13*0.7 мм) в аксиальной проекции начиная с первых суток после моделирования инфаркта мозга. Объем очага инфаркта мозга в динамике измеряли с помощью программного пакета ImageJ (Wayne Rasband; США) по Т2-взвешенным изображениям. На первом этапе измеряли площадь на каждом срезе, после чего рассчитывали общий объем очага по формуле

V = (S₁+…+Sn)*(h + d),

где S₁ — площадь первого среза, Sn — площадь среза n (мм²), h — толщина среза (мм); d — межсрезовый промежуток (мм) [11].
Поведенческие изменения у крыс оценивали в течение 4 недель после моделирования инсульта. Для выявлениия общих неврологических нарушений применяли неврологическую шкалу mNSS [12]. Моторные нарушения оценивали с помощью функциональных тестов: установок «Норковая камера» (OpenScience; Россия) и «Открытое поле» (OpenScience; Россия). Тест «Норковая камера» проводили на 10-е и 24-е сутки после инсульта [13]. Тест «Открытое поле» проводили на 16-е сутки. В тесте также оценивали ориентировочно-двигательную активность (по тем же параметрам). Кроме того, рассчитывали общий путь и скорость перемещений [14].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 12.0 (Statsoft; США), используя непараметрический критерий Манна– Уитни, t-критерий Стьюдента для независимых выборок и описательные статистики с определением среднего арифметического, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование фармакокинетики VRF_11 при его внутривенном введении в дозе 250 мг/кг

В табл. 2 и табл. 3 приведены значения концентрации VRF_11 в крови экспериментальных животных после однократного внутривенного введения. Все значения укладываются в калибровочную кривую.
Результаты исследования по измерению содержания VRF_11 в крови экспериментальных животных приведены на рис. 1.
Данные, представленные на рис. 1, удовлетворительно аппроксимируются в рамках одночастевой модели без всасывания, которую описывает уравнение вида:

C = A × exp (–at),

где C — концентрация исследуемой фармацевтической субстанции в крови экспериментальных животных, t — время после введения препаратов, А, а — константы процесса, описывающего фармакокинетическое уравнение, связанные с константами, характеризующими процессы распространения тестируемого препарата в организме.
В результате аппроксимации фармакокинетических данных с помощью приложения Borgia 1.03 было получено следующее уравнение:

С = 580,143 × ехр (–0,00833 × t).

В табл. 4 приведены показатели основных фармакокинетических параметров: Cmax, Tmax, AUC(0→∞), T1/2, Cl, Vd.

Накопление VRF_11 в коре головного мозга

В табл. 5 приведены значения концентрации VRF_11 в экстрактах гомогенатов коры головного мозга после его однократного внутривенного введения в дозе 250 мг/кг. Все значения укладываются в калибровочную кривую.
Таким образом, препарат VRF_11 проникает через ГЭБ, достигая максимальной концентрации через 30 мин после введения. Через 24 ч после введения препарат еще обнаруживается в коре головного мозга крыс.

Контроль модели острой ишемии головного мозга, динамика объема инфаркта с течением времени

Исследование было проведено на 3 группах животных по 8 крыс в каждой. Через сутки после моделирования инфаркта мозга методом эндоваскулярной транзиторной окклюзии средней мозговой артерии животным проводили МРТ для контроля объема очага поражения. Оценка объема ишемического поражения показала, что моделирование было выполнено корректно. Две крысы с малым объемом очага были исключены из исследования (табл. 5). Крысам опытных групп после МРТ-подтверждения корректности процедуры в хвостовую вену вводили исследуемое вещество в дозах 125 и 250 мг/кг. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора тем же методом.
Результаты МРТ-сканирования в динамике на 1-е, 7-е, 14-е и 28-е сутки реперфузии показали, что изучаемое вещество в дозах 250 и 125 мг/кг не оказывало влияния на средний объем очага (в сравнении с контрольной группой, не получавшей VRF_11) (табл. 6). Объем очага инфаркта с течением времени достоверно снижался у всех групп животных к концу первого месяца относительно первых суток после ишемии.

Оценка неврологических нарушений

Оценку неврологического дефицита по шкале mNSS проводили на 1-е, 3-и и 5-е сутки реперфузии. Тестирование в первые сутки проводили до введения препаратов. Результаты оценки по неврологической шкале у животных, получивших VRF_11 в дозе 250 и 125 мг/кг, и контрольных животных значимо не отличались (табл. 6).
Как видно из представленных данных (табл. 7), при сравнении неврологического дефицита на 1-е и 5-е сутки, животные из группы VRF_11 показали статистически значимые различия, тогда как у контрольных животных таких различий не было. Следует отметить больший неврологический дефицит на первые сутки реперфузии у группы, получавшей VRF_11 в дозе 250 мг/кг, по сравнению с другими группами, тогда как МРТ-сканирование не выявило различий в объеме очага ишемии у животных.

Изучение поведенческих реакций

Исследование поведения в установке «Открытое поле», которое было проведено на 16-е сутки реперфузии, показало значимые различия в показателях времени замираний и груминга, а также количества посещений центральной зоны у животных, получавших VRF_11 в дозах 125 и 250 мг/кг, по сравнению с контрольной группой (табл. 8).
В тесте «Норковая камера» через 10 дней после моделирования ишемии наблюдали значимые различия между контрольной группой и группой животных, получавших внутривенные инъекции VRF_11 (125 мг/кг и 250 мг/кг) (рис. 2). Различия присутствовали в проявлениях горизонтальной (пересечение секторов 12,1 ± 6,8 22,5 ± 10,5 (р < 0,05) и 20,2 ± 14,7 (р < 0,07)) и вертикальной активности (количество выполненных стоек 2 ± 1,6 7,5 ± 4,0 (р < 0,05) и 7 ± 12,1 (р < 0,07)), времени замирания (46,6 ± 34,4, 1,0 ± 1,3 (р < 0,01) и 24,1 ± 21,9 (р < 0,05)) (для контрольной группы, животных, получавших VRF_11 в дозе 125 мг/кг, и животных, получавших VRF_11 в дозе 250мг/кг, соответственно). На 24-е сутки после реперфузии в тесте «Норковая камера» опытные животные демонстрировали большую ориентировочно-исследовательскую активность по сравнению с контрольной группой. Так, статистически значимые различия (р < 0,05) были отмечены для пересечения секторов (у животных, получавших инъекции физ. раствора, этот показатель составил 18 ± 7,3, у животных, получавших VRF_11 в дозировке 125 мг/кг, он был равен 31 ± 16,5 (p < 0,03), а у крыс, получавших VRF_11 в дозировке 250 мг/кг, — 26,3 ± 12,5 (p < 0,05)) и количества выполненных норок (5 ± 3, 10,5 ± 2,9 (р < 0,01) и 8,6 ± 2,9 (p < 0,05) соответственно). Время замираний значимо снижалось только под воздействием VRF_11 в дозе 125 мг/кг (22,9 ± 22,8 и 0,6 ± 2,3 (р < 0,01)).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Несмотря на широкое применение эффективных препаратов для эндоваскулярной терапии, клинические исходы после острого церебрального ишемического инсульта остаются неудовлетворительными [15]. У большинства пациентов сохраняются моторные нарушения, снижаются когнитивные способности, у многих страдает психоэмоциональная сфера. Из-за вызываемых инсультом неврологических осложнений нейропротекция и постинсультная реабилитация в последнее время становятся все более актуальной темой [16].
Кафедра химии РНИМУ им. Н. И. Пирогова имеет богатый опыт работы с ноотропными препаратами [17, 18]. В настоящем исследовании было использовано перспективное вещество, производное 4-фенилпирролидинона-2 VRF_11, обладающее, по данным компьютерного моделирования, нейропротекторными свойствами.
Проведенные исследования фармакокинетики VRF_11 (табл. 4) позволяют говорить о том, что препарат проникает через ГЭБ и в течение суток сохраняется в коре головного мозга.
По своим фармакокинетическим показателям VRF_11 несколько отличается от известных препаратов ноотропного ряда, таких как пирацетам и фенотропил. Так, для пирацетама Т½ составляет 4–5 ч при внутривенном введении [19], а для фенотропила — 2,77 ч [20]. Молекулярная масса пирацетама равна 142 г/моль, фенотропила — 218 г/моль. Можно проследить тенденцию к уменьшению времени полувыведения с увеличением молекулярной массы. Так, у VRF_11 c молекулярной массой 252 г/моль Т½ составляет 1,26 ч.

В ткани головного мозга VRF_11 сохраняется в течение суток. Именно по этой причине мы выбрали режим дозирования раз в сутки, чтобы избежать эффекта накопления в органе-мишени. Четкого мнения о режиме дозирования в литературе по метаботропным препаратам (и по ноотропам в частности) нет. Так, согласно официальной инструкции, пирацетам принимают до 3 раз в день, фенотропил — раз в день. Именно поэтому подбор режима дозирования в экспериментальных исследованиях новых соединений — это одна из самых сложных и времязатратных задач. Нами был выбран следующий алгоритм: пересчет по молекулярной массе с наиболее близкого изученного аналога (фенотропила). Необходимая доза фенотропила составляет 100 мг/кг.
При пересчете с учетом молекулярной массы доза исследуемого вещества составила 125 мг/кг. Для того чтобы показать возможные дозозависимые эффекты, в исследовании использовали дозу, в 2 раза превышавшую расчетную (250 мг/кг).
При коррекции ишемического поражения доза в 125 мг/кг оказалась эффективнее дозы 250 мг/кг, о чем свидетельствовало большее снижение неврологического дефицита, усиление ориентировочно-исследовательского поведения в тестах «Норковая камера» и «Открытое поле». Согласно литературным данным, эффект пирацетама, напротив, достигается только при высоких концентрациях [21]. Наши наблюдения говорят о целесообразности изучить больший диапазон доз, так как разные дозы препарата могут не только влиять на его эффективность, но и приводить к противоположным фармакологическим эффектам [20].
Согласно результатам МРТ-сканирования, соединение VRF_11 не оказывает воздействия на размер очага поражения, однако достоверно снижает неврологическую симптоматику у крыс. Такое наблюдение ограничивает оценку исследуемого соединения как нейропротектора, но говорит о перспективе его возможного применения в ряду других реабилитационных препаратов. Наблюдение интересно с точки зрения изучения возможных механизмов действия VRF_11. Безусловно, на него мы будем опираться в наших дальнейших исследованиях по поиску конкретной мишени действия препарата.

ВЫВОДЫ

Расчет основных фармакокинетических параметров нового производного 4-фенилпирролидинона-2 (лабораторный шифр VRF_11) позволил прийти к следующим выводам. 1. Препарат VRF_11 проходит через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и накапливается в ткани головного мозга. 2. Максимальная концентрация препарата VRF_11 в исследованном временном диапазоне достигается через 0,5 ч после введения препарата. 3. Через 24 ч препарат VRF_11 в коре головного мозга находится на грани детектирования. 4. VRF_11 в дозе 125 мг/кг значимо корректирует неврологический дефицит, возникающий в результате моделирования фокальной ишемии у крыс.