Численность наблюдаемых пациентов с хроническими заболеваниями печени, приводящими к циррозу (вирусные гепатиты B и C, алкогольные и токсические гепатиты, первичный склерозирующий холангит и др.), непрерывно растет [1].
Биопсия печени остается золотым стандартом оценки состояния органа. Однако инвазивность процедуры и связанные с этим риски осложнений для пациента не позволяют использовать этот метод в качестве рутинного [2]. Внедрение в практику методов неинвазивной диагностики, обладающих высокой достоверностью, простотой выполнения и безопасностью, как для самого пациента, так и для обслуживающего персонала [3], позволит оценивать эффективность лечения в динамике, наличие функциональных резервов печени [2, 4].
Этим функциональные тесты выгодно отличаются от эластографии или расчета лабораторных индексов APRI [5] либо FORNS [6].

Диагностика с помощью дыхательных тестов основана на способности различных органов и систем метаболизировать ¹³С- и ¹⁴С-препараты с образованием ¹³СО₂ [7] или ¹⁴СО₂ [8], которые распределяются кровеносной системой по всем органам и тканям, и, выделяясь через легкие, могут быть достоверно обнаружены в выдыхаемом воздухе пациента с помощью масс-спектрометрии или ИК-спектрометрии в варианте NDIRS (недиспергирующий инфракрасный анализатор) и лазерной абсорбции CRDS (спектральная техника для измерения поглощения, основанная на определении времени затухания излучения в ячейке с двумя высокоотражающими зеркалами при многократном прохождении света между ними) [:lit_3, 9;]. Таким образом, появляется возможность постановки диагноза на основе анализа фармакокинетических показателей — изменения концентрации ¹⁴СО₂ в выдыхаемом воздухе во времени и информации о путях и скоростях метаболических превращений препарата [10].

Уже разработаны и внедрены в практику дыхательные тесты для оценки функционального состояния печени на основе оценки скорости метаболизации ¹³С-метацетина [11–13], ¹³С-галактозы и ¹³С-аминофеназона [14] (оценивается активность цитохрома Р450), ¹³С-фенилаланина [15, 16], ¹³C-кофеина [17, 18], ¹³Сз-триоктаноина (тройного эфира глицерина и ¹³С-каприловой кислоты) для обнаружения дефицита ферментов поджелудочной железы [7, 19].
Одним из наиболее перспективных направлений в ядерной медицине является использование дыхательных тестов на основе различных фармацевтических препаратов с использованием меченых жирных кислот, в частности линолевой. Данное соединение играет существенную роль в энергетическом обмене клеток высших организмов и служит строительным блоком для липидов нескольких классов, таких как нейтральные жиры, фосфоглицериды и эфиры холестерина [20].

Линолевая кислота — длинноцепочечное нерастворимое в воде соединение. В организме под действием желчи, выделяемой из желчного пузыря, в тонком кишечнике происходит гидролиз жирной кислоты с образованием смешанных мицелл. В случае нарушения работы гепатобилиарной системы, приводящего к нехватке желчных солей в желчи, замедляется всасывание меченых жирных кислот, что может быть обнаружено по изотопному составу выделяющегося углекислого газа [20].
В литературе описан стереоспецифический синтез изомеров моно-непредельных жирных кислот с ¹⁴С-атомом в первом положении с использованием одиннадцати стадий при помощи инверсии олефина [21]. Преимущество этого способа в возможности получения мононенасыщенных жирных кислот с различным расположением двойной связи. Однако изложенный в работе способ чрезвычайно трудоемок, требует препаративного разделения стереоизомеров по окончании стадии эпоксидирования, а также такого дорогостоящего и токсичного источника ¹⁴С, как цианид. Все это ограничивает промышленное применение описанной разработки.

Способы химического синтеза ¹³С- и ¹⁴С-производных наиболее распространенных в пищевых продуктах ненасыщенных жирных кислот: линолевой и линоленовой из наиболее доступного сырья — СО₂ на базе изотопов углерода в литературе не описаны. Биологические способы с применением водорослей, простейших и грибов (например, Thraustochytrium или Mortierella alpina) имеют низкий радиохимический выход, не превышающий 60% [22, 23]. Остальную часть изотопа выбрасывают в виде отходов, что с учетом большой длительности распада ¹⁴С приводит к высокой экологической опасности схемы синтеза. Кроме того, к недостаткам известного из литературы биологического способа с точки зрения применимости ¹³С- и ¹⁴С-жирных кислот в дыхательных тестах является распределение меченых атомов по всей длине углеродной цепи ацила. Между тем, для достижения максимальной чувствительности, воспроизводимости и безопасности дыхательных тестов целесообразно использовать препараты жирных кислот, имеющих 100% меченого атома в позиции 1 (карбоксильная группа). Часто в результате биогенного синтеза образуется смесь жирных кислот различного состава. Например, показано, что биогенный синтез с использованием Thraustochytrium приводит к образованию 10 различных жирных кислот с выходами 0,72–21,82%. Кроме того, 1,9% изотопа включается в жирные кислоты неидентифицированной структуры [23].

Целью работы было представить способ синтеза линолевой кислоты с помощью ¹³С и ¹⁴С по положению 1 ацила с использованием CO₂ в качестве источника аномального изотопа для последующего применения в диагностике гепатобилиарной системы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оборудование

Чистоту полученных промежуточных и конечных продуктов контролировали тонкослойной хроматографией на силикагеле на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck; Германия) и sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ, в системе этилацетат: гексан (1 : 1). Визуализацию разделенных соединений проводили с помощью паров йода. Структуру целевого продукта подтверждали спектроскопией ядерного магнитного резонанса на приборах моделей AM-300, 300 МГц (Bruker; Германия) и DRX-500, 500 МГц (Bruker; Германия). В качестве растворителя для проведения анализа методом ЯМР-спектроскопии использовали ²Н-хлороформ, съемку проводили при частоте 300,1 мГц.
Для определения удельной активности меченых атомов углерода использовали жидкостный сцинтилляционный счетчик DPM 7001 (НТЦ Радэк; Россия), оснащенный двумя фотоэлектронными умножителями. Для определения активности смесей использовали микрокалориметр Кальве Setaram С80 (SETARAM Instrumentation; Франция). Значения рН водных растворов определяли потенциометрическим методом с помощью pH-метра модели Sartorius PB-11 (Sartorius; Германия).

Материалы

Использовали следующие материалы:

– 1-бром-8,11-гептадекадиен CH₃(CH₂)₃-(CH₂CH=CH₎₂(CH₂)₇Br AppliChem (США) со следующими характеристиками: молярная масса — 315,332 г/моль; температура плавления — 23,4 °C; температура кипения — 112 °C [24];
– источник стабильного изотопа углерода: безводный ¹³С-карбонат бария (АО «Всерегиональное объединение «Изотоп»; Россия), со следующими характеристиками, указанными производителем: изотопная чистота — 99,32%; молекулярная масса — 198,3359 г/моль; температура плавления — 1558 °C;
– источник радиоактивного изотопа углерода: безводный 14С-карбонат бария (ПО «МАЯК» Госкорпорации «РОСАТОМ»; Россия) со следующими характеристиками, указанными производителем: изотопная чистота — 97,8%; молярная масса — 199,3359 г/моль; температура плавления — 1566 °C; удельная радиоактивность — 66,92 мКи/г.
– осушенные аргон и азот квалификации «высокая чистота» («М-газ»; Россия), а также этилацетат по ГОСТ 22300-76 изм.1-3 («Химмед»; Россия), гексан по ТУ 2631- 158-44493179-13 («ЛенРеактив»; Россия), магний (стружка) по ГОСТ 804-93 («Интерхим»; Россия), йод кристаллический чда («ЛенРеактив»; Россия), диэтиловый эфир по ТУ 2600- 001-45682126-13 («Химмед»; Россия), серную кислоту хч по ГОСТ 4204-77 («Химмед»; Россия), соляную кислоту хч по ГОСТ 3118-77 («Химмед»; Россия), гидроксид натрия 98% (Fluka Швейцария; каталожный номер 71695), ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87 («Химсервис»; Россия).

Абсолютированный эфир получали по следующей схеме. Диэтиловый эфир по ТУ 2600-001-45682126-13 промывали насыщенным раствором хлорида кальция из расчета 50 мл на 1 л эфира и сушили над прокаленным в течение суток при +120 °С хлоридом кальция, используя 130 г сухого вещества для обработки 1 л эфира в течение 48 ч. Реагент фильтровали через бумажный складчатый фильтр в сухую колбу и добавляли металлический натрий из расчета 1 г на 1 л. Колбу плотно закрывали пробкой с установленной хлоркальциевой трубкой. Эфир использовали для карбоксилирования реактива Гриньяра при том условии, что при внесении новых порций натрия не наблюдалось выделения водорода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение линолевой кислоты, меченной ¹³С и ¹⁴С в первом положении, проводили в две стадии: 1) получение реактива Гриньяра; 2) карбоксилирование реактива Гриньяра диоксидом ¹³С и ¹⁴С.

Получение реактива Гриньяра

Собирали установку из трехгорлой колбы на 250 мл, в боковые горловины колбы вставляли хорошо действующий обратный холодильник с хлоркальциевой трубкой и капельную воронку с трубкой, уравнивающей давление во время прикапывания эфирного раствора. В центральное отверстие через масляный затвор вводили мешалку с электрическим приводом. В колбу помещали 3,0 г магниевой стружки и кристаллик йода. Всю установку продували током аргона квалификации «высокая чистота» в течение 20 мин. Через капельную воронку в колбу вводили 160 мл абсолютного эфира, включали мешалку и при слабом токе аргона добавляли 3,78 г (12 ммоль) 1-бром- 8,11-гептадекадиена в виде раствора в диэтиловом эфире объемом 80 мл. Для начала реакции колбу нагревали на водяной бане до кипения эфира. После начала реакции водяную баню выключали и процесс перемешивания продолжали до полного растворения магния (рис. 1; разрешения из [25]).

Карбоксилирование реактива Гриньяра диоксидом ¹³С и ¹⁴С

Установка, использованная для получения меченых кислот карбоксилированием реактивом Гриньяра, представляла собой высоковакуумную гребенку, снабженную шлифами для присоединения реакционной колбы, источника СО₂ и ртутного манометра, а также трубками для входа и выхода азота. Коническая трехгорлая реакционная колба была изготовлена с таким расчетом, чтобы ее можно было замораживать, и снабжена магнитной мешалкой, позволяющей работать в вакууме при охлаждении (рис. 2; с разрешения из [25]).
Источник диоксида ¹³С и ¹⁴С представлял собой круглодонную колбу, содержащую 5,4 ммоль карбоната бария на базе изотопов: для изотопа ¹³С — навеска массой 1,071 г, для изотопа ¹⁴С — 1,076 г. Колбу соединили с заполненной концентрированной серной кислотой капельной воронкой, снабженной приспособлением для выравнивания давления. Эту часть установки соединили с вакуумной гребенкой через трубку, наполненную осушителем.

Для проведения реакции установку откачали с помощью масляного насоса до давления 0,1 мм рт. ст. и заполнили сухим азотом. Затем, при помощи предварительно промытой и заполненной азотом пипетки с поршневой подачей, быстро ввели в реакционную колбу раствор реактива Гриньяра, полученный из 6 ммоль 1-бром-8,11-гептадекадиена (половина общего полученного количества). Свободный боковой отвод реакционной колбы закрыли пробкой, колбу охладили жидким азотом и откачивали систему до давления 0,1 мм рт. ст. После этого дали содержимому реакционной колбы оттаять, нагревая его смесью сухого льда и ацетона до –77 °С, снова замораживали жидким азотом и опять откачали систему для удаления выделившегося азота.

Карбоксилирование реактива Гриньяра проводили при температуре –20 °С, постоянно перемешивая содержимое колбы. Для запуска выделения СО₂ на базе изотопов углерода к карбонату бария из капельной воронки медленно прибавляли концентрированную серную кислоту, при этом следили за тем, чтобы давление в приборе не превышало 500 мм рт. ст. Для полного выделения меченого СO₂ в конце реакции осторожно нагревали реакционную колбу с карбонатом бария до окончательного его растворения. После полного истощения реактива Гриньяра давление СO₂ в приборе согласно показаниям манометра перестало снижаться. По этому показателю как в случае ¹³СO₂, так и в случае ¹⁴СO₂, реакция полностью завершилась в течение 15 мин.

Реакционную колбу с реактивом Гриньяра охладили жидким азотом, для того чтобы в нее перешел весь оставшийся в системе меченый СO₂, затем закрыли кран, соединяющий прибор с источником меченого СO₂, и для полного поглощения меченого СO₂ реакционную массу перемешивали в течение 15 мин при температуре –20 °С. После этого установку заполнили азотом и соединили с атмосферой. Полученный комплекс разлагали разбавленной соляной кислотой. Подкисленную смесь экстрагировали эфиром. Эфирный экстракт обработали 100 мМ NaOH и подкислили полученный щелочной раствор до рН 7,0. Выделившуюся кислоту отфильтровали. Осадок собрали, промыли водой и перекристаллизовали из ацетонитрила при –20 °С (считали, что для линолевой кислоты tзамерз = –11 °С).

Масса полученной ¹³С-линолевой кислоты составила 1459 мг (5,184 ммоль). Итоговый химический выход реакции по 1-бром-8,11-гептадекадиену составил 86,4%, по ¹³СO₂ — 96,0%. Экспериментально измеренная температура замерзания продукта составила –11,0 °С.

Масса полученной ¹⁴С-линолевой кислоты составила 1480 мг (5,243 ммоль). Итоговый химический выход реакции по 1-бром-8,11-гептадекадиену составил 87,39%, по ¹³СO₂ — 97,1%. Удельную активность ¹⁴С-линолевой кислоты определяли на сцинтилляционном счетчике: она составила 45,36 ± 0,02 мКи/г. Таким образом, общий радиохимический выход составил 96,0%. Препарат имел температуру замерзания –10,7 °С.

Анализ полученных образцов ¹³С- и ¹⁴С-линолевых кислот с помощью тонкослойной хроматографии на платинах Kieselgel 60 F254 в системе этилацетат : гексан (1 : 1) (см. Материалы и методы) позволил обнаружить примеси. Определение массы основного вещества, элюированного из силикагеля после разделения методом ТСХ, показало, что в случае ¹³С-линолевой кислоты на него приходится 98,2% сухой массы готового препарата.

Сравнение спектра ¹H ЯМР ¹⁴С-линолевой кислоты с эталонным 1S/C₁₈H₃₂O₂/c1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13- 14-15-16-17-18(19)20/h6-7, 9-10H, 2-5, 8, 11-17H₂, 1H₃, (H, 19, 20)/b7-6-, 10-9, описанным в литературе [26], показало полное соответствие структуры синтезированного вещества структуре линолевой кислоты (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Значимое преимущество предложенного способа синтеза линолевой кислоты, меченной изотопами ¹³С и ¹⁴С, состоит в ускорении процесса получения целевых продуктов, сокращении потерь меченого СО₂, в повышении его суммарного химического и радиационного выхода. Важным результатом является также исключение распределения изотопно-меченых атомов по всей длине углеродной цепи ацила: при использовании разработанного метода включение происходит только в первом положении.
Упрощение и снижение стоимости процесса получения целевых продуктов обусловлены уменьшением длительности реакции за счет подбора оптимальных соотношений реагентов и использования теста на окончание реакции карбоксилирования реактива Гриньяра с помощью измерения давления СО₂ в системе. Разработанный метод обеспечивает существенное повышение радиационного и химического выхода продукта по источнику изотопа по сравнению с известными способами [21–23]. Включение меченого изотопа в целевой продукт приближается к количественному, в результате практически полностью исключается выброс радиоактивных отходов во внешнюю среду. С учетом затратности и сложности утилизации радиоактивных отходов с длительным периодом полураспада это играет существенную роль с точки зрения экономической эффективности способа.
Полученные в ходе работы образцы ¹³С- и ¹⁴C-линолевой кислот по своей чистоте и количеству пригодны для проведения доклинических испытаний острой, субхронической, хронической и других типов токсичности в соответствии с требованиями [27]. После подтверждения безопасности соединения, изготавливаемые предлагаемым способом, могут быть рекомендованы для испытаний в клинических условиях в качестве диагностических дыхательных тестов в целях диагностики заболеваний гепатобилиарной системы.

ВЫВОДЫ

Предложен метод получения линолевой кислоты, содержащей атомы углерода ¹³С или ¹⁴С в первом положении. От известных аналогов он отличается простотой и включает две вместо 11 стадий. При работе с ¹⁴С способ дает радиохимический выход, близкий к количественному (96%), что полностью исключает проблему утилизации опасных радиоактивных отходов, возникающих при работе с ¹⁴С-содержащими исходными веществами. Для синтеза кислот предложенным способом не требуется использования сложного аналитического и препаративного оборудования, что удобно для серийного выпуска готового продукта.