Возбудителем дифтерии являются токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, в геном которых интегрирована ДНК бактериофага, содержащая ген токсина. Передача возбудителя происходит, как правило, воздушно-капельным путем от человека к человеку с развитием классической дифтерии зева и/или носа.
Благодаря программам массовой иммунизации заболеваемость дифтерией в мире за последнее столетие резко снизилась [1]. В России в настоящее время в условиях поддержания высокого уровня привитости (95% и более) достигнута стaбилизaция заболеваемости [2]. В 2017 г. случаи заболевания дифтерией не регистрировали, выявлено два случая бактерионосительства; в 2018 г. зарегистрировано четыре случая заболевания и три случая бактерионосительства; за 9 месяцев 2019 г. — три случая заболевания и два случая бактерионосительства [3]. При этом за последние годы не было зарегистрировано как вторичных случаев в очагах, так и летальных исходов. В структуре клинических форм преобладают легкие локализованные формы дифтерии.
Однако актуальность проблемы дифтерийной инфекции в условиях единичных случаев заболеваний по сей день сохраняется, так как утрачивается опыт клиничeского и бактериологического распознaвaния дифтерии; сохраняется резервуар возбудителя в форме бактерионосительства; эпидемический процесс протекает среди привитого населения [3].
В последнее время можно наблюдать рост инфекций, вызванных нетоксигенными штаммами C. diphtheriae, с атипичными клиническими проявлениями, включая фарингит, инфекции дыхательных путей, эндокардит, остеомиелит, септический артрит или кожные инфекции
[4–8].

На основе биохимического фенотипического тестирования C. diphtheriae исторически классифицировали на четыре биовара: gravis, mitis, intermedius и belfanti [9, 10]. Однако штаммы C. diphtheriae в пределах определенного биовара могут быть генетически более отдаленными [11, 12]. Поэтому геномика не поддерживает использование биоваров для надежной классификации штаммов C. diphtheriae [13]. Кроме того, отсутствует корреляция между определением биовара и патогенностью [14]. Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST), основанное на аллельном определении семи генов «домашнего хозяйства», позволило разделить существующее разнообразие штаммов на две эволюционные линии: lineage-1 (включает в себя большинство штаммов) и lineage-2 (включает только штаммы биовара belfanti) [14].

В 2018 г. появилась публикация об описании трех нетоксигенных штаммов C. diphtheriae [15]. Один из них был выделен в Швейцарии от пациента с трахеобронхитом с множественными поражениями дистальной трахеи и главных бронхов, два других штамма — из мазков из носа и зева от пациентов в Великобритании и Индии. Сравнительные геномные исследования с общедоступными геномами C. diphtheriae показали, что выделенные штаммы имеют более низкую среднюю идентичность нуклеотидов (от 95,24 до 95,39%) с эталонным геномом C. diphtheriae NCTC 11397, чем остальные ранее опубликованные геномы C. diphtheriae (> 98,15%). Реконструкция филогении на основании полногеномных данных подтвердила наличие двух монофилетических кластеров внутри вида, соответствующих lineage-1 и lineage-2. На основании этих результатов было предложено классифицировать вид C. diphtheriae на два подвида: C. diphtheriae subsp. diphtheriae и C. diphtheriae subsp. lausannense.

Цель данного исследования — описать генотип и фенотип нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, выделенных в 2017–2018 гг., которые на основании совокупности множества методов можно отнести к C. diphtheriae subsp. lausannense.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментальную часть исследования было включено два нетоксигенных штамма C. diphtheriae, выделенных в период 2017–2018 гг. в бактериологической лаборатории Краевой клинической психиатрической больницы г. Хабаровска; контрольный токсигенный штамм C. diphtheriае биовара gravis № 665 (из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск»), а также свежевыделенные токсигенные штаммы C. diphtheriае № 66–19, 98–19 (биовара gravis), № 55–19, № 56–19 (биовара mitis); нетоксигенные штаммы C. diphtheriае № 57–19, 67–19 (биовара gravis), № 60–19, № 91–19 (биовара mitis), присланные в Референс-центр по мониторингу возбудителей кори, краснухи, эпидемического паротита, коклюша и дифтерии Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского из субъектов РФ.
Изучение штаммов C. diphtheriae проводили согласно МУ 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». Исследуемый материал засевали на кровяно-теллуритовую среду (КТА) на основе 2%-го агара (ГРМ-агар, ГНЦПМБ; Оболенск, Россия) с добавлением 7% крови крупного рогатого скота («Лейтран»; Россия) и теллурита калия (ГНЦПМБ; Оболенск, Россия) и термостатировали в течение 24–48 ч при температуре 37 °С. Выросшие колонии C. diphtheriae оценивали по культурально-морфологическим, токсигенным и биохимическим свойствам. Токсигенность штаммов C. diphtheriae оценивали в реакции преципитации в агаре с использованием питательного агара «Коринетоксагар» (ГНЦПМБ; Оболенск, Россия) с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота («Лейтран»; Россия) и дисков, пропитанных дифтерийным антитоксином («Диагностические системы», Нижний Новгород, Россия).
Один диск с антитоксином содержал 5 ± 1 МЕ дифтерийного антитоксина (согласно МУК 4.2.3065-13). Биохимические свойства выделенных культур изучали по оценке цистиназной, уреазной, сахаролитической и нитратредуктазной активностей на средах, приготовленных в лабораторных условиях, а также с использованием биохимической тест-системы «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» («Диагностические системы», Нижний Новгород, Россия).

Для определения возможности сбраживания N-ацетилглюкозамина в основу Гисса ex temporo был добавлен N-ацетилглюкозамин (Sigma-Adlrich; США). Далее в приготовленный раствор объемом 3 мл внесли полную бактериологическую петлю суточных культур C. diphtheriae, выращенных на сывороточном агаре. Культуры инкубировали 24–48 ч при температуре 37 °С. Интерпретацию результатов проводили по изменению цвета раствора. Контролем служили два токсигенных штамма биовара gravis, два нетоксигенных штамма биовара gravis, два токсигенных штамма биовара mitis и два нетоксигенных штамма биовара mitis.
Для изучения опубликованных геномных последовательностей использовали 204 генома C. diphtheriae подвидов diphtheriae и lausannense, представленных в базе данных NCBI Refseq. Выборку дополнили тремя  геномами C. diphtheriae subsp. lausannense из базы данных NCBI Genbank и одним геномом Corynebacterium ulcerans BR-AD22 в качестве внешнего представителя для филогенетической реконструкции. Итоговый объем выборки составил 208 геномов.

Белок-кодирующие области в геномах в соответствии с представленными в базах данных аннотациями кластеризовали в группы ортологов с использованием программного обеспечения OrthoMCL [16] со стандартными настройками (индекс инфляции составил 1.5, порог схожести белковых последовательностей — 50%, порог e-value — 10-5). Для реконструкции филогении использовали группы ортологов, в которые входили гены, присутствовавшие во всех геномах в одной копии. Нуклеотидные последовательности выравнивали с использованием MUSCLE [17] и конкатенировали. Реконструкцию филогении осуществляли по алгоритму Maximum Likelihood, реализованному в программном обеспечении FastTree [18], с использованием модели GTR+CAT. Отношения опубликованных геномных последовательностей к сиквенс-типам по методу MLST предсказывали на основе данных из базы PubMLST. Формирование клональных комплексов производили с помощью алгоритма goeBURST на уровне SLV в программе Phyloviz 2.0 [19].
Тотальную ДНК выделяли стандартным методом кипячения из 24-часовой культуры C. diphtheriae, выращенной на ГРМ-агаре (ГНЦПМБ; Оболенск, Россия) с добавлением 10% крови крупного рогатого скота («Лейтран»; Москва) и последующим центрифугированием.

Фрагменты гена tox у нетоксигенных штаммов C. diphtheriae выявляли в соответствии с опубликованным протоколом [20]. Реакционная смесь для ПЦР содержала 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 0,1 мкМ прямого и обратного праймеров, 200 мМ каждого dNTP и 1 ед. Taq ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific; США). В качестве положительного контроля амплификации использовали ДНК контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665. Генотипирование штаммов С. diphtheriae с помощью MЛСТ проводили согласно международному протоколу [14] на основе секвенирования фрагментов семи генов «домашнего хозяйства» — atpA, dnaE, dnaK, fusA, leuA, odhA и rpoB. Секвенирование проводили согласно общепринятому методу Сенгера в ЗАО «Евроген» (Москва). Идентификацию аллелей осуществляли согласно международной базе данных PubMLST.
ПЦР для выявления фрагментов гена dtxR у штаммов C. diphtheriae проводили с использованием одной пары праймеров, охватывающей всю область гена dtxR: GGGACTACAACGCAACAAGAA и TCATCTAATTTCGCCGCCTTTA согласно [20, 21]. Подвид-специфичную ПЦР проводили с праймерами ptsI_F: ACTTTCCGAACCTGCCATCC и ptsI_R: GTGTACTCCTTCGTCTGCTC. narG_F: CTGACCACTGGGGCGAGG и narG_R: GAGTTGTCATAACGCCACTG.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы C. diphtheriae В-8759 и В-8760 были выделены из зева двух пациентов (26 и 77 лет), госпитализированных в различные отделения психиатрического стационара, которые были обследованы профилактически при поступлении с целью выявления бактерионосительства (согласно п. 3.4 Методических указаний 3.1.3018-12 «Эпидемиологический надзор за дифтерией»). Нами была проведена идентификация выделенных штаммов по культурально-морфологическим, токсигенным и биохимическим свойствам согласно Методическим указаниям 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». На кровяно-теллуритовом агаре наблюдали серо-черные шероховатые колонии с легкой краевой исчерченностью, с приподнятым центром; при соприкосновении колонии крошились. Токсигенность определяли с помощью дисков, пропитанных дифтерийным антитоксином, по методу Фельдмана. У выделенных культур через 24 и 48 ч инкубации отсутствовали специфичные линии преципитации при наличии специфичных линий преципитации у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665, что свидетельствовало об отсутствии у них токсигенности. Проведение ПЦР для выявления фрагмента гена tox показало, что у исследуемых штаммов ген дифтерийного токсина отсутствует.

Биохимические свойства выделенных культур изучали с оценкой цистиназной, уреазной, сахаролитической и нитратредуктазной активности. Так, выделенные культуры C. diphtheriae обладали цистиназной активностью с образованием «коричневого облака» по ходу укола в среду Пизу, ферментировали глюкозу, мальтозу, фруктозу и галактозу, не ферментировали сахарозу и крахмал, не обладали уреазной и нитратредуктазной активностью (таблица). В результате проведенной идентификации выделенные культуры были предварительно отнесены к C. diphtheriae биовар belfanti, что характерно для представителей подвида lausannense.
На следующем этапе работы было проведено исследование ранее опубликованных геномов C. diphtheriae с целью подтверждения четкого разделения данного вида на подвиды и поиска видоспецифичных белок-кодирующих генов.

Реконструкция филогенетического дерева (рис. 1) подтвердила на большей выборке ранее полученные данные о том, что представители вида C. diphtheriae формируют две клады, соответствующие подвидам diphtheriae и lausannense. Она указала также на то, что представители данных подвидов относятся к непересекающимся группам сиквенс-типов. По результатам кластеризации описанных в PubMLST МЛСТ-типов с помощью goeBURST (рис. 2), все представители подвида lausannense с просеквенированным геномом имеют сиквенс-типы ST106, ST360, ST409, а также один неописанный тип, отличающийся одним аллелем от ST359, входящие в один клональный комплекс.
Можно предположить, что все остальные сиквенс-типы (например, ST35, ST37, ST69, ST81), представленные в данном клональном комплексе, тоже относятся к lausannense. Дополнительным подтверждением тому может служить тот факт, что почти все изоляты из сиквенс-типов данного клонального комплекса описаны в базе данных PubMLST как относящиеся к биовару belfanti, характерному для подвида lausannense.

Анализ групп ортологов показал существование локусов, специфичных для подвидов C. diphtheriae. Так, все штаммы подвида lausannense имели регион (вероятно, оперон), содержащий гены фосфотрансферазной системы, предполагаемым субстратом которой служит N-aцетилглюкозамин. Под ген фосфоенолпируват-белка, кодирующего фосфотрансферазу, были подобраны праймеры: ptsI_F: ACTTTCCGAACCTGCCATCC и ptsI_R: GTGTACTCCTTCGTCTGCTC (ожидаемая длина продукта — 489 пн). В то же время только среди геномов подвида diphtheriae был обнаружен локус, кодирующий синтез субъединиц нитратредуктазы. Под ген ее α-субъединицы (присутствующий в геномной сборке 201 штамма из 202, относящихся к данному подвиду в исследуемой выборке) были подобраны праймеры narG_F: CTGACCACTGGGGCGAGG и narG_R: GAGTTGTCATAACGCCACTG (ожидаемая длина продукта — 691 пн).

Проведение ПЦР с праймерами для амплификации фрагментов генов ptsI и narG (рис. 3) показало, что в образцах, содержащих ДНК изучаемых штаммов В-8759 и В-8760, присутствует ген ptsI и отсутствует ген narG, в то время как с классическими штаммами C. diphtheriae наблюдалась обратная картина. Не было случаев, когда у одного штамма обнаруживали одновременно два локуса или ни одного локуса.
В совокупности с данными биохимической идентификации это позволило нам сделать заключение, что изученные штаммы C. diphtheriae относятся к виду C. diphtheriae subsp. lausannense. Дополнительно этот вывод был подтвержден тем, что выделенные штаммы принадлежали к сиквенс-типу ST199, входящему в клональный комплекс, предположительно характерный для представителей данного подвида (см. рис. 2). Еще одним подтверждением служила последовательность гена dtxR, которая совпадала с последовательностями, имеющимися в геномах представителей подвида lausannense.
Учитывая, что у штаммов C. diphtheriae subsp. lausannense присутствует ген, кодирующий фосфоенолпируват-белок фосфотрансферазы, входящей в фосфотрансферазную систему, для, вероятно, N-ацетилглюкозамина, мы провели эксперименты по оценке фенотипического проявления этого гена. Эксперименты показали, что оба изученных штамма, отнесенных к C. diphtheriae subsp. lausannense, сбраживали N-ацетилглюкозамин в рамках предложенной системы, в отличие от штаммов C. diphtheriae subsp. diphtheriae (рис. 4).
Изученные штаммы, определенные по результатам данного исследования как C. diphtheriae subsp. lausannense, депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск».

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нам удалось на территории России идентифицировать нетоксигенные штаммы C. diphtheriae subsp. lausannense, что наряду с данными зарубежных исследований [14, 22] свидетельствует об их повсеместной циркуляции. Выделенные штаммы принадлежали к сиквенс-типу ST199, входящему в кластер lineage-2, характерный для подвида lausannense, и несли последовательность гена dtxR, характерную для представителей данного подвида. Анализ групп ортологов позволил нам установить существование локусов, специфичных для подвидов С. diphtheriae: региона, содержащего гены N-ацетилглюкозамин-фосфотрансферазной системы, — для подвида lausannense и локус, кодирующий синтез субъединиц нитратредуктазы, — для подвида diphtheriae. Последнее подтверждает более ранние геномные исследования подвида lausannense [15] и исследования биохимических свойств биовара belfantii [9, 10]. Сконструированные под эти гены праймеры и проведение ПЦР позволили нам подтвердить идентификацию исследуемых двух штаммов как C. diphtheriae subsp. lausannense.

ВЫВОДЫ

В результате данного исследования на территории России были идентифицированы нетоксигенные штаммы C. diphtheriae subsp. lausannense. Полученные результаты расширяют представления о биологическом разнообразии вида C. diphtheriae и свидетельствуют о необходимости проведения исследований по оценке распространенности этих микроорганизмов на территории нашей страны и их патогенного потенциала.