Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) — это хроническое заболевание, при котором происходит избыточное накопление липидов в гепатоцитах в отсутствие повреждающего действия алкоголя и других токсических веществ. Возникновение и развитие НАЖБП тесно связано с нарушениями углеводного и липидного обменов, ожирением и инсулинорезистентностью. По современным оценкам, до 25% мирового населения страдают НАЖБП, что делает это заболевание основной причиной хронической патологии печени [1, 2]. Помимо метаболических нарушений, большое внимание специалистов привлекают тревожнодепрессивные расстройства, астения и когнитивные нарушения, ассоциированные с НАЖБП [3–5]. Так, в одном из исследований у 53% больных НАЖБП была обнаружена субклиническая депрессия и у 14% — клиническая [6]. Стоит отметить, что у таких пациентов раздражительность и перепады настроения часто сопровождаются повышенной утомляемостью и хронической усталостью [3]. Ряд исследователей полагают, что когнитивные нарушения осложняют течение НАЖБП практически у всех больных, из которых половина испытывают их в легкой форме, а другая половина — в среднетяжелой или тяжелой [4]. Основные цели лечения НАЖБП — устранение факторов развития, уменьшение проявлений и предупреждение прогрессирования болезни [2, 7]. К лекарственным препаратам, применение которых может быть показано у больных НАЖБП наряду с диетой и физической нагрузкой, относят гиполипидемические и гипогликемические средства, а также гепатопротекторы [2, 7]. Их эффективность в качестве средств коррекции метаболических нарушений изучена достаточно подробно, но оценке возможности их применения при психоневрологических нарушениях на фоне НАЖБП посвящено весьма ограниченное число работ [8, 9]. В связи с этим целью настоящего исследования стала оценка влияния эмпаглифлозина и L-орнитина L-аспартата на поведение, когнитивные функции и физическую работоспособность мышей линии C57BL/6 при моделировании у них НАЖБП.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено в Санкт-Петербургском государственном химико-фармацевтическом университете на 52 трехмесячных инбредных мышах-самцах линии C57BL/6 со средней массой тела 23 г, полученных из ФГУП «ПЛЖ Рапполово» (Ленинградская область). Животные получали корм «Полнорационный комбикорм для лабораторных животных» (ООО «Лабораторкорм», РФ) и воду, соответствующую требованиям ГОСТ 287482 «Вода питьевая» (исключая период высококалорийной диеты). Доступ к корму и воде был обеспечен ad libitum. Выбор животных этой линии обусловлен развитием у них метаболических и поведенческо-когнитивных изменений на фоне высокожировой диеты [10, 11]. По окончании 14-дневного периода адаптации мыши были рандомизированы на четыре экспериментальные группы: 1-я группа — интактные животные («Интакт»; n = 10), 2-я — контроль без лечения («Контроль»; модель НАЖБП, n = 14), 3-я — НАЖБП + эмпаглифлозин («ЭМПА»; Джардинс®, 2 мг/кг; n = 14), 4-я — НАЖБП + L-орнитина L-аспартат («ОА»; Гепа-Мерц®, 1,5 г/кг, n = 14). Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно с использованием зондов в течение всего эксперимента раз в день, контрольная и интактные группы получали эквиобъемные количества 0,9%-го раствора хлорида натрия.

НАЖБП (стеатогепатит) моделировали, используя сочетание «западной» диеты (western diet) и внутрибрюшинного введения тетрахлорметана (CCl4) (рис. 1А). Группы «Контроль», «ЭМПА» и «ОА» в течение 6 месяцев находились на высококалорийной диете (ВКД) следующего состава: 36,65% стандартного корма + 21,1% топленого говяжьего жира + 41% D-фруктозы + 1,25% холестерола. В качестве питья животные указанных групп получали раствор D-фруктозы с концентрацией 42 г/л. Еженедельно в течение всего периода ВКД животным указанных групп вводили внутрибрюшинно CCl4 в дозе 0,32 мкг/кг массы тела [12]. Интактные мыши на протяжении всего периода получали стандартный корм и питьевую воду без добавок.
По истечении периода ВКД поведение животных оценивали в тестах «Открытое поле» (ОП), «Черно-белая камера» (ЧБК) и «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (НПК «Открытая наука»; Россия) с использованием системы видеорегистрации VideoMot2 (TSE Systems; Германия).
Для оценки краткосрочной и долгосрочной памяти мышей тестировали в «Лабиринте Барнс» (ЛБ) (НПК «Открытая наука»; Россия) [13]. Обучение животных проводили ежедневно 4 раза в течение 4-х дней; на 5-й и 12-й дни осуществляли контрольное тестирование. В процессе обучения и тестирования учитывали время нахождения target box (с), а также число совершенных ошибок. Через два дня после проведения поведенческих тестов физическую работоспособность животных оценивали с помощью плавательных тестов «Вынужденное плавание» (ВП) с грузом 7,5% от массы тела и «Трехнагрузочная плавательная проба» (ТПП) [14, 15]. Регистрацию времени плавания в ТПП вели в 3-х временных точках: исходно, через 5 и через 45 мин после начала тестирования.

Для определения структурных изменений в печени выполняли гистологическое исследование. Образцы ткани печени после фиксации 10%-м нейтральным формалином подвергали дегидратации и обезжириванию с использованием изопропанола, имбибиции парафином по общепринятой методике. Из парафиновых блоков изготовляли срезы толщиной 4 мкм, помещали на предметные стекла, окрашивали гематоксилином и эозином и заключали под покровные стекла. Изучение гистологических препаратов осуществляли в проходящем свете с качественной оценкой жировой и белковой (баллонной) дистрофии гепатоцитов, а также патологической клеточной инфильтрации паренхимы печени [2, 16].

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программного обеспечения GraphPad Prism 8.0.2 (GraphPad Software; США). Осуществляли проверку нормальности распределения количественных признаков с использованием W-критерия Шапиро–Уилка. При нормальном распределении количественных признаков значимость различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с post-hoc-тестом по Даннетту; при ненормальном распределении — с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с posthoc-тестом по Данну. Числовые данные, приведенные на рисунках, представлены в виде M ± SE. Анализ главных компонент выполнен с помощью приложения для MS Excel XLStat 2016 (Addinsoft; Франция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выживаемость животных и гистоморфологические изменения печени при экспериментальной НАЖБП

В течение 6 месяцев эксперимента произошла гибель приблизительно 40% мышей контрольной и опытных групп. Ни эмпаглифлозин, ни ОА не оказывали влияния на выживаемость животных (рис. 1Б). Гистоморфологическая картина изменений печени мышей с НАЖБП характеризовалась наличием жировой и баллонной дистрофии гепатоцитов, а также инфильтрацией полиморфноядерными лейкоцитами паренхимы печени. Степень выраженности указанных морфологических изменений была максимальной у животных из контрольной группы: жировой дистрофии были подвергнуты не менее 30% гепатоцитов, баллонной дистрофии — не менее 30% гепатоцитов, а также выявлена очаговая инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами. Тестируемые препараты снижали выраженность данных изменений у экспериментальных животных (рис. 1В).

Влияние экспериментальной НАЖБП на исследуемые показатели животных контрольной группы

При тестировании животных было показано, что развитие стеатогепатита приводит к изменениям поведения, когнитивной функции и физической работоспособности. В тесте ОП мыши с экспериментальной НАЖБП передвигались с меньшей скоростью (–38%; p < 0,01), имели меньшее суммарное время замираний (–35%; p < 0,01), а также совершали большее число стоек (+432%; p < 0,05) по сравнению со здоровыми животными (рис. 2А). У контрольной группы было также увеличено число стоек (+279%; p < 0,05) и свисаний (+553%; p < 0,05) в ПКЛ (рис. 2Б). В тесте ЧБК, как и в ОП, мыши с НАЖБП передвигались медленнее (–35%; p < 0,01), чем здоровые животные (рис. 2В). Несмотря на то что в ЛБ у животных всех экспериментальных групп динамика обучения была схожей (уменьшение количества ошибок и времени, затрачиваемого на поиск target box), только у контрольной группы отмечали увеличение как затрачиваемого времени (+108%), так и числа ошибок на 12-й день по сравнению с 5-м (+439%) (p < 0,05 в обоих случаях) (рис. 3). Время вынужденного плавания (–50%; p < 0,05), а также время плавания в исходной точке в тесте ТПП (–69%; p < 0,05) были меньше у мышей с НАЖБП без лечения по сравнению с интактной группой. Кроме того, во время ТПП физическая работоспособность мышей контрольной группы восстанавливалась медленнее и их результаты в точке 5 мин уступали результатам здоровых животных (–63%; p < 0,05) (рис. 4).

Влияние эмпаглифлозина на исследуемые показатели у животных

В тесте ОП эмпаглифлозин увеличивал количество грумингов (+160%; p < 0,05) (рис. 2А), а в тесте ПКЛ — уменьшал число заходов в закрытые рукава в сравнении с контрольной группой (–56%; p < 0,05) (см. рис. 2Б). В тесте ЧБК мыши, получавшие препарат, дольше находились в белой камере (+275%; p < 0,05), позднее совершали первый переход в черную камеру (+355%; p < 0,01), а также значительно чаще делали груминги по сравнению с контрольными животными (+2173%; p < 0,01) (см. рис. 2В). Введение эмпаглифлозина мышам с НАЖБП не оказывало статистически значимого влияния на показатели краткосрочной и долгосрочной памяти в ЛБ и физическую работоспособность в тестах ВП и ТПП.

Влияние L-орнитина L-аспартата на исследуемые показатели у животных

В тестах ОП, ЧБК и ЛБ ОА не оказывал значимого влияния на показатели экспериментальных животных. В тесте ПКЛ он увеличивал время, проводимое животными в открытых рукавах, по сравнению с контрольной группой (+267%; p < 0,05) (рис. 2Б).
У животных, получавших ОА, время вынужденного плавания было существенно выше, чем в контрольной группе (+106%; p < 0,05), и сопоставимо с результатами здоровых особей. Аналогичным образом в тесте ТПП через 45 мин от исходной точки группа ОА дольше оставалась на поверхности воды в сравнении с группой НАЖБП (+137%; p < 0,01) (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании изучено влияние курсового введения эмпаглифлозина и ОА на поведение, память и физическую работоспособность мышей линии C57BL/6 с НАЖБП на стадии стеатогепатита.
В тестах ОП и ПКЛ мыши с экспериментальной НАЖБП совершали больше стоек, нежели контрольные животные, а в ПКЛ, кроме того, больше свисаний с открытых рукавов. Увеличение частоты стоек можно рассматривать как признак тревожного состояния животных [17, 18]. Свисание с открытых рукавов не только является элементом исследовательской активности, но и входит в число действий, совершаемых грызунами для оценки риска [19]. В связи с этим увеличение частоты свисаний само по себе — неоднозначный признак. С учетом одновременного увеличения частоты стоек, а также некоторой склонности животных к посещению закрытых рукавов это изменение может быть расценено как признак повышения тревожности [20, 21].

В тесте ЧБК мыши с НАЖБП, в отличие от интактной группы, реже совершали груминги, при этом была тенденция к снижению времени нахождения в белой камере. Предпочтение грызунами темного закрытого пространства, основанное на проявлении норкового рефлекса, свидетельствует о повышении уровня тревожности [22]. Увеличение тревожности у грызунов на фоне диет-индуцированной НАЖБП в своих исследованиях отмечали и другие авторы [23, 24]. Помимо этого, повышенная тревожность наряду с ухудшением настроения и апатией относится к характерным психоневрологическим симптомам у пациентов, страдающих НАЖБП [3, 6].

Стоит отметить, что у животных с НАЖБП происходило снижение средней скорости передвижения по сравнению с интактными животными в тестах ОП и ЧБК (в ПКЛ данный показатель не фиксировали), на которое эмпаглифлозин и ОА не оказывали влияния. Кроме того, в ОП у мышей с НАЖБП во всех группах наблюдали уменьшение суммарного времени замирания. Можно предположить, что снижение средней скорости передвижения также является проявлением тревожного поведения. Что касается уменьшения времени замираний, то в классическом понимании данное изменение поведения свидетельствует об анксиолитическом эффекте. Вместе с тем снижение времени замирания может говорить и о том, что мыши активно искали укрытие ввиду повышенной тревожности. Мы решили обратить внимание на данные показатели отдельно ввиду сложности их однозначной интерпретации. Не исключено также, что НАЖБП у мышей вызывает более комплексные изменения поведения, которые нельзя трактовать только с точки зрения увеличения/уменьшения уровня тревожности.

Мыши, получавшие эмпаглифлозин, проводили больше времени в белой камере в тесте ЧБК по сравнению с контрольными животными. Очевидно, при помещении в белую камеру животные испытывали меньшие дискомфорт и потребность в поиске убежища, благодаря чему у них значительно возрастала латентность первого посещения черной камеры. Кроме того, во время своего пребывания в белой камере мыши, получавшие эмпаглифлозин, совершали больше грумингов, чем контрольные животные. Аналогичное увеличение частоты грумингов было отмечено и в тесте ОП. В настоящее время этот эффект рассматривают двояко. С одной стороны, под воздействием стрессорных факторов животные склонны совершать более частые, но более короткие акты груминга, что наряду с учащением вегетативных (экскреторных) реакций служит признаком повышения тревожности. В данном случае груминг замещает другие поведенческие реакции и виды активности, подавляемые при остром стрессе [25]. С другой стороны, грызуны осуществляют больше грумингов, когда чувствуют себя в безопасности, находятся в спокойном состоянии и не испытывают тревоги [26]. С учетом предпочтения открытого и освещенного пространства увеличение частоты грумингов в данном случае следует расценивать скорее как проявление анксиолитического эффекта препарата.

Описанные нами эффекты эмпаглифлозина могут быть напрямую связаны с его благоприятным влиянием на морфологию глиальных клеток [27], а также с увеличением уровня BDNF (нейротрофический фактор мозга; brain-derived neurotrophic factor) у мышей с ожирением и инсулинорезистентностью [28]. Это дает основание предполагать, что у эмпаглифлозина есть дополнительные центральные механизмы, опосредующие его анксиолитический эффект.

ОА у мышей с НАЖБП в тесте ПКЛ увеличивал время нахождения в открытых рукавах, что служит признаком его анксиолитической активности. Отсутствие изменений таких показателей, как частота заходов в закрытые рукава, а также число свисаний с открытых рукавов, может говорить о сохранении спонтанной двигательной и исследовательской активности у животных этой группы [29].
В ЛБ в процессе обучения у животных всех экспериментальных групп снижалось время, затрачиваемое на поиск target box, а также количество совершаемых при этом ошибок. Контрольная группа была единственной, где на 12-й день эксперимента результаты как по времени поиска, так и по количеству ошибок были достоверно хуже, чем на 5-й день. Предположительно, это говорит об ухудшении долговременной памяти у мышей на фоне НАЖБП. Ранее нарушения пространственной памяти были обнаружены у крыс с НАЖБП [30]. Экспериментально установлено, что снижение когнитивного статуса при НАЖБП коррелирует с уменьшением объема серого и белого вещества мозга, а также сопровождается снижением массы мозга в целом [31]. Неалкогольный стеатогепатит и фиброз печени, особенно его поздние стадии, приводят к развитию множественного очагового поражения белого вещества вне зависимости от наличия сопутствующих заболеваний [32]. В группах мышей, получавших лечение одним из препаратов, а также у интактных животных состояние долговременной памяти не было нарушено.

На 3-й, 4-й и 5-й дни эксперимента мыши, получавшие эмпаглифлозин, показывали несколько худшие результаты по времени поиска в сравнении с животными других групп. Характерно, что эти мыши не стремились к исследованию лабиринта и поиску убежища, а, напротив, предпочитали находиться на открытом пространстве, как правило, выбрав для этого одно из ложных отверстий. Это вполне согласуется с высказанным ранее предположением о наличии у эмпаглифлозина анксиолитического эффекта, который в данном случае способствовал повышению устойчивости мышей к стрессорным воздействиям (в данном случае — открытому пространству и свету).

Ранее было показано, что перевод животных с обычного рациона питания на высокожировую диету при моделировании НАЖБП вызывает достаточно быстрое (к концу первого месяца) ухудшение функционального состояния, проявляющееся двукратным снижением физической работоспособности [33]. В последующем, с 4-го месяца такого питания начиналось постепенное восстановление работоспособности. Однако в настоящей работе метаболическая нагрузка на организм животных была более жесткой. Именно с этим может быть связано то, что к 6 месяцам моделирования НАЖБП адаптация энергопродуцирующих механизмов к новым условиям существования организма не наступила, и физическая работоспособность животных в плавательном тесте оставалась резко сниженной (45% от уровня интактной группы по сравнению с полным восстановлением уровня работоспособности к 6-му месяцу моделирования при менее жесткой диете).

Необходимо отметить, что в процессе формирования НАЖБП даже в более мягком режиме было выявлено существенное снижение уровня гликогена в скелетных мышцах (на 33%) и печени (на 44%) [33]. Сочетание ВКД с инъекционным введением CCl4, обладающего гепатотоксическим и прооксидантным действиями, позволяет получить у животных выраженные нарушения липидного обмена, сопровождающиеся характерными гистоморфологическими изменениями ткани печени, и вызвать дополнительное ухудшение поведенческо-когнитивных функций и физической работоспособности [12]. Дефицит углеводных резервов в скелетных мышцах может быть метаболической основой снижения физической работоспособности лабораторных животных. В настоящем исследовании курсовое применение эмпаглифлозина не оказало влияние на физическую работоспособность животных в тесте вынужденного плавания, что было ожидаемо, так как механизм действия препарата не способствует улучшению транспорта глюкозы в мышцы и усилению синтеза гликогена.

Одним из энергетических резервов для обеспечения мышечной деятельности является распад мышечных белков и включение аминокислот в процессы образования субстратов цикла Кребса. При этом происходит усиленная генерация аммиака, утилизируемого в орнитиновом цикле синтеза мочевины. Известно, что у человека прием ОА активирует цикл мочевины, интенсифицирует липидный обмен, незначительно повышет уровень кетоновых тел и свободных жирных кислот, а также снижает уровень аммиака в крови и субъективное чувство усталости [34]. В нашем исследовании курсовое применение ОА значительно устраняло влияние НАЖБП на физическую работоспособность животных в тесте вынужденного плавания, что показывает особую роль утилизации аминокислот в энергообеспечении мышечной деятельности при перестройке базового метаболизма организма в условиях ВКД.

Для уточнения механизма действия ОА в отношении физической работоспособности при моделировании НАЖБП была выполнена ТПП. Соотношение значений первой и истощающей нагрузок (сумма первой и второй нагрузок) в группе интактных животных показывает, что причина отказа животных от дальнейшего их выполнения в физическом утомлении при незначительной роли центрального компонента [35]. При моделировании НАЖБП произошло снижение длительности выполнения первой нагрузки в 3 раза, что свидетельствует об уменьшении выносливости; причем высокая утомляемость имеет центральный и периферический компоненты. Курсовое применение эмпаглифлозина и ОА преимущественно снижало центральный, но не периферический компонент, о чем свидетельствовало снижение уровня истощающей нагрузки до 40% от уровня интактных особей.

Основной показатель ТПП (индекс пробы, ИП) характеризует эффективность механизмов первой фазы восстановления после истощающих нагрузок. Этот показатель равен отношению времени плавания животных с грузом через 45 мин восстановительного периода к длительности истощающей нагрузки. Срочное восстановление распространяется на первые 0,5–1,5 ч отдыха и сводится к устранению накопившихся за период работы продуктов анаэробного распада и погашению кислородного долга. Необходимо отметить, что в срочной фазе постнагрузочного восстановления окислительное фосфорилирование не играет ключевой роли в ресинтезе аденозинтрифосфата (АТФ). Более значим (особенно при истощающих нагрузках, выраженном утомлении и переутомлении, перетренированности) алактатный путь, использующий для ресинтеза АТФ продукт его деградации — аденозиндифосфат. Этот механизм запускается высоким уровнем концентрации АДФ в мышцах, который может возникнуть при исчерпании иных путей ресинтеза АТФ. Для обеспечения высокой скорости протекания миокиназной реакции необходима быстрая дальнейшая деградация аденозинмонофосфата АМФ и вывод из скелетных мышц его метаболита — инозинмонофосфата. Именно этот процесс сопряжен с генерацией аммиака активно работающими скелетными мышцами [36].

Оценка ИП показазала, что эмпаглифлозин не влияет на процессы первой фазы восстановления (ИП в интактной группе равен 0,20, в группе ЭМПА — 0,19; ИП в контрольной группе равен 0,38 за счет резкого снижения выносливости и связанного с этим малого объема истощающей нагрузки). В то же время при применении ОА ИП был равен 0,61, что свидетельствует о достоверном влиянии препарата на процессы постнагрузочного восстановления. Вероятно, именно с этим может быть связано восстановление физической работоспособности у животных, получавших во время моделирования НАЖБП ОА. Влияние L-орнитина и его различных солей на процессы восстановления (и сопряженное с ними достижение тренировочного эффекта) у здоровых людей и лабораторных животных хорошо известно в практике спортивной медицины [37– 39]. Однако его влияние на физическую работоспособность и эффективность первой фазы процесса восстановления после истощающих нагрузок на фоне формирования НАЖБП показаны впервые.

При анализе всех полученных данных методом главных компонент (principal component analysis, PCA) видно, что животные интактной и контрольной групп имеют выраженные различия, при этом исследуемые препараты оказывают эффект не только за счет влияния на течение НАЖБП, но и имеют собственные, не связанные с данной патологией эффекты (рис. 5). При курсовом введении они могут не только улучшать гистоморфологическую картину печени, но и корригировать симптомы, часто сопровождающие НАЖБП — тревожно-депрессивные расстройства, когнитивные нарушения и астению. Данные эффекты могут иметь большое значение для клинической практики ввиду высокой распространенности НАЖБП среди социально активной части населения.

ВЫВОДЫ

1. У мышей линии C57BL/6 экспериментальная НАЖБП приводит к выраженным изменениям поведения, проявляющимся главным образом увеличением уровня тревожности. Кроме того, у таких животных ухудшается долговременная память и снижается физическая работоспособность. 2. Курсовое применение эмпаглифлозина и ОА позволяет уменьшить отдельные проявления тревожного поведения и в некоторой степени нормализовать когнитивную функцию. 3. Характерной особенностью ОА является способность корригировать у животных с НАЖБП астению, проявляющуюся снижением физической работоспособности.