Гипоксия играет роль в развитии и течении ряда патологических состояний, таких как сердечно-сосудистые [1] и опухолевые заболевания [2]. Использование моделей гипоксии in vitro — информативный подход для изучения реакции на гипоксию на молекулярном и клеточном уровнях. Одна из традиционных моделей состоит в имитации гипоксии с использованием химических агентов, вызывающих активацию сигнальных путей гипоксии. Использование CoCl₂ — один из самых распространенных вариантов индукции химической гипоксии, поскольку вызывает прямую и долгосрочную стабилизацию индуцируемых гипоксией факторов 1 и 2 (HIF-1, HIF-2) [3].
МикроРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, основная функциональная активность которых заключается в посттранскрипционном подавлении генов [4]. Обычно одна микроРНК имеет десятки генов-мишеней, при этом 3'-UTR какого-либо гена может содержать места связывания для сотен микроРНК [5]. Было показано, что взаимодействия между микроРНК и их генами-мишенями играют важную роль в межклеточной коммуникации [6] и патогенезе множества заболеваний, включая различные типы опухолей [7, 8].
В ряде исследований изучали роль и функциональную активность клеточных микроРНК в условиях гипоксического стресса. Обнаружено, что некоторые микроРНК, такие как miR-210 или miR-27, изменяются гипоксией во многих клетках, дифференциальная экспрессия miRNA и их таргетома обычно зависят от механизма индукции гипоксии и типа клеток [9]. Установлена также связь между паттернами изменения экспрессии микроРНК, вызванными гипоксией и опухолевыми заболеваниями: большая часть микроРНК, ассоциированных с опухолями, может быть затронута гипоксией [10].
Целью данной работы было исследовать влияние гипоксии на транскриптом и профиль микроРНК в клетках линии колоректальной аденокарциномы человека HT-29 и выявить потенциальные ключевые молекулы, участвующие в ответе на гипоксию.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование и обработка клеток

Клетки линии колоректальной аденокарциномы человека HT-29 (ATCC; США) культивировали в среде McCoy's 5A (Thermo Fisher Scientific; США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Thermo Fisher Scientific; США). К питательной среде добавляли пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (100 мг/мл). Клетки рассаживали в шестилуночные планшеты в количестве 4 × 105 клеток в лунку и культивировали в увлажненной атмосфере при + 37 °C и 5% CO₂ в течение 48 ч. Для индукции гипоксии готовили свежий раствор хлорида кобальта (CoCl₂) в воде, добавляли в среду для получения конечной концентрации 300 мкМ и инкубировали в течение 24 ч. Проводили по три биологических повтора как для контрольных, так и для обработанных клеток.

Выделение РНК

Клетки лизировали в Qiazol Lysis Reagent (Qiagen; Германия) для последующей экстракции тотальной РНК с использованием набора Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden; Германия). Количество выделенной РНК определяли с помощью Nanodrop (Thermo Fisher Scientific; США). Анализ качества выделенных образцов РНК проводили с использованием набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies; США) и прибора для капиллярного электрофореза Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies; США). Значение параметра RIN (RNA integrity number) для всех образцов было выше 9.0.

Приготовление библиотек и секвенирование

Библиотеки для секвенирования мРНК получали из образцов тотальной РНК с использованием набора Illumina Stranded mRNA Library Prep Kit Illumina (Illumina; США). Каждый образец был секвенирован на Illumina NextSeq 550 для получения 75 нуклеотидных считываний на одном конце.
Библиотеки для секвенирования микроРНК были приготовлены из образцов тотальной РНК с использованием набора NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit для Illumina. Каждый образец был секвенирован на Illumina NextSeq 550 для получения 50 однонаправленных считываний нуклеотидов.
Секвенирование мРНК и микроРНК проводили для трех биологических повторов, для каждого из которых было поставлено четыре технических повтора.

Обработка результатов секвенирования

Качество файлов FASTQ оценивали с помощью FastQC v0.11.9 (Babraham Bioinformatics; UK). Один образец из обработанных CoCl2 репликатов не прошел контроль качества при секвенировании микроРНК. Адаптеры были обрезаны с помощью Cutadapt v2.10 [11]. Полученные последовательности фрагментов мРНК картировали на геном человека (GENCODE GRCh38.p13) с помощью STAR v2.7.5b [12]. Матрицу экспрессии микроРНК получили с помощью пакета miRDeep2 v2.0.1.2 [13].
Глубины библиотек секвенирования были нормализованы с помощью алгоритма Trimmed Mean of M-values (TMM), доступного в пакете edgeR v3.30.3 [14] с фильтрацией фонового шума по умолчанию. Тот же пакет использовали для генерации нормированных матриц экспрессии мРНК и микроРНК в единицах Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads (RPKM) и Reads Per Million mapped reads (RPM) соответственно. Полученные значения логарифмировали по основанию 2. Для дальнейшей обработки использовали только высокоэкспрессированные транскрипты, отсекая нижние 5% генов и 50% микроРНК в соответствии с их средними значениями RPKM / RPM.

Оценка дифференциальной экспрессии и перепредставленных сигнальных путей

Анализ дифференциальной экспрессии проводили с использованием DESeq2 v1.28.1 [15], частоту ложных обнаружений (FDR) рассчитывали по методу Бенджамини–Хохберга. Статистически значимыми считали различия с FDR ниже порогового значения 0,05. Анализ перепредставленных сингальных путей проводили с помощью онлайн-сервиса DAVID v6.8 [16].

Предсказание мишеней микроРНК

На первом этапе для предсказания мишеней микроРНК был получен список взаимодействий микроРНК–ген из TargetScan v7.2 [17]. Затем из когорты The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD) выбирали пары микроРНК–ген с отрицательной корреляцией экспрессии [18]. Исходные матрицы экспрессии микроРНК/мРНК для опухолевых образцов были получены с портала GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/) и преобразованы в формат RPKM/RPM таблиц с помощью вышеописанной процедуры. Далее рассчитывали корреляцию Спирмена для каждой микроРНК и предсказанного гена-мишени. Пороговые значения 0,05 и –0,1 были установлены на значения FDR и корреляции соответственно.

Построение регуляторной сети взаимодействий факторов транскрипции и микроРНК

Информация о регуляторных взаимодействиях факторов транскрипции и микроРНК была взята из курируемой базы данных TransmiR v2.0 [19]. Полученную сеть взаимодействия строили и визуализировали в редакторе yED Graph Editor (yWorks GmbH; Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние хлорида кобальта (II) на экспрессию генов в клетках линии НТ-29

Для химического индуцирования гипоксии клетки линии НТ-29 обрабатывали хлоридом кобальта (II) в течение 24 ч. Анализ секвенирования РНК, выделенной из контрольных клеток HT-29 и обработанных хлоридом кобальта, показал статистически значимое изменение экспрессии 2511 генов, кодирующих белки, в 2 и более раза в ответ на гипоксию. Поиск перепредставленных метаболических путей выявил 25 генов, связанных с переключением аэробного метаболизма на анаэробный гликолиз (KEGG pathway hsa00010 «Glycolysis/Gluconeogenesis», FDR = 2,04 ×10–4; рис. 1A), а также продемонстрировал активацию сигнального пути HIF-1 (KEGG pathway hsa04066 «HIF-1 signaling pathway», FDR = 4,45 × 10–3), задействуя который хлорид кобальта имитирует гипоксию (рис. 1Б). Помимо пути HIF-1, активированными были и несколько других сигнальных каскадов, участвующих в ответе на гипоксию, включая NF-κB [20] и AMPK [21] (приложение 1).
Наиболее перепредставленная категория соответствовала генам, кодирующим белки протеасомных комплексов (KEGG pathway hsa03050 «Proteasome», FDR = 2,02 × 10–16). В частности, 33 гена были значительно активированы в ответ на гипоксию, включая 6 из 6 АТФаз, 11 из 12 субъединиц протеасомы 26S, не обладающих АТФ-азной активностью, 7 из 8 α-субъединиц и 7 из 11 β-субъединиц протеасомы 20S, а также белок созревания протеасомы POMP и активаторная субъединица протеасомы PSME4 (приложение 2).

Было отмечено увеличение экспрессии генов UBB, UBC, UBA52 и RPS27A (в 3,1, 8,7, 2,0 и 1,6 раза соответственно), кодирующих убиквитин, активность которого необходима для протеасомзависимой деградации белков.
Детектировалось также изменение экспрессии генов, которые кодируют белки, участвующие в фокальной адгезии: интегрины и ламинины. Так, уровни экспрессии ламининовых субъединиц α3, β3, ϒ1 и ϒ2 были увеличены в 5,5, 4,6, 3,1 и 4,5 раза. Три из них (α3, β3, ϒ2) могут формировать гетеротример и, таким образом, образовывать ламинин 332, известный также как ламинин-5 [22]. Направление изменения экспрессии субъединиц интегринов различалось: для субъединиц αE, αV и β1 обнаружено увеличение в 1,8, 2,2, 1,8 раза, в то время как для субъединиц α1, α2, α3 и β8 снижение уровня экспрессии произошло в 2,3, 2,1, 1,7 и 2,7 раза.

Влияние гипоксии на экспрессию микроРНК и их генов-мишеней

Статистически значимое изменение экспрессии в ответ на обработку клеток хлоридом кобальта было выявлено для 16 микроРНК (табл. 1). Среди них обнаружена hsa-miR-210-3p, единственная микроРНК, увеличение экспрессии которой показано в ответ на гипоксию почти во всех существующих исследованиях [23]. При этом уровень нескольких подтвержденных мРНК-мишеней hsa-miR-210-3p, вовлеченных в митохондриальный метаболизм и индукцию апоптоза, снижался в ответ на гипоксию : GPD1L в 2,3 раза, CASP8AP2 в 1,7 раза, а AIFM3 — в 8 раз.
Чтобы оценить общие функциональные эффекты изменения представленности микроРНК в клетке в ответ на гипоксию, был проведен следующий анализ. С помощью ресурса TargetScan был создан список потенциальных мишеней микроРНК. Поскольку некоторые взаимодействия микроРНК и мРНК-мишеней ингибируют трансляцию, не влияя на уровень экспрессии мРНК, далее осуществляли поиск пар микроРНК–мРНК-мишень, демонстрирующих значимую отрицательную корреляцию при анализе образцов 441 пациента с аденокарциномой толстой кишки, полученных из базы данных TCGA-COAD (приложение 3). Затем полученный список пересекли со списком генов, экспрессия которых достоверно изменялась не менее чем в два раза в направлении, противоположном изменению соответствующей микроРНК. В результате были получены шесть микроРНК со статистически значимым числом дерегулированных генов-мишеней (гипергеометрический тест; p < 0,05): hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR. -182-5p, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-425-5p (приложение 4).

Постороение сети регуляторных взаимодействий факторов транскрипции и микроРНК

Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе аберрантной экспрессии микроРНК, была проанализирована возможность регуляции микроРНК факторами транскрипции (ТФ). В частности, рассмотрели ТФ, уровни представленности мРНК которых достоверно изменились в два или более раза в ответ на гипоксию, и провели поиск микроРНК, которые они регулируют, используя базу данных регуляторных взаимодействий ТФ-микроРНК TransmiR. В результате были идентифицированы 30 взаимодействий ТФ–микроРНК между 15 ТФ и 11 микроРНК. Мы также рассмотрели реципрокное miRNA-индуцированное молчание ТФ, чтобы построить полную регуляторную сеть на этих узлах (рис. 2).
Как видно, четыре ТФ, кодируемые генами EGR1, HIF1A, MYC и RELA, одновременно регулируют несколько микроРНК, а большинство микроРНК регулируются ансамблями ТФ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании с помощью техники интегративного секвенирования мРНК и микроРНК проведена оценка изменения транскриптомного ландшафта клеток НТ-29 в ответ на гипоксию, индуцированную хлоридом кобальта (II). Помимо активации канонического сигнального пути HIF-1, было показано изменение экспрессии интегринов и ламининов, которые играют важнейшую роль в клеточной адгезии и взаимодействиях с внеклеточным матриксом. Последнее имеет особое значение, поскольку недавно полученные данные указывают на тесную связь между микроокружением, формируемым гипоксией, и метастатическим прогрессированием опухолей, включая аденокарциному толстой кишки [24]. Один из возможных механизмов метастатического распространения опухолей связан с ламинином 332. Взаимодействуя с различными рецепторами на поверхности клетки (включая интегрины α6β4 и α3β1, рецептор эпидермального фактора роста и синдекан 1), а также некоторыми другими компонентами базальной мембраны, ламинин 332 регулирует процесс онкогенеза, способствует инвазии и выживанию опухолевых клеток [25]. Повышенная экспрессия ϒ1-цепи ламининов (кодируемая геном LAMC1) также может играть роль в прогрессировании опухолевых заболеваний, как это было показано на карциноме матки [26].

Анализ профиля малых некодирующих РНК выявил несколько дифференциально экспрессированных микроРНК в ответ на гипоксию. Для некоторых из этих микроРНК ранее уже сообщалось об изменении их экспрессии при гипоксии, включая hsa-miR-210-3p [23], hsa-miR-27a-5p [27], hsa-miR-182-5p [28]. Для четырех микроРНК (hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-32-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-1260a и hsa-miR-1260b) информации об их связи с ответом клетки на гипоксию обнаружено не было. Это можно объяснить как клеточной специфичностью ответа, так и поточными эффектами действия хлорида кобальта.

Особое внимание следует обратить на микроРНК, которые демонстрируют дифференциальные паттерны экспрессии, специфичные для конкретной цепи микроРНК («arm-specific» дифференциальные паттерны экспрессии), и для которых была отмечена регуляция только пассажирских цепей hsa-let-7a, hsa-mir-10a и hsa-mir-27a, в то время как экспрессия их направляющих цепей не изменялась (табл. 2).
Недавно мы сообщили о подобном наблюдении для miR-21-3p (пассажирская цепь) в легких мыши, которая демонстрировала восьмикратное увеличение экспрессии при заражении SARS-CoV, в то время как направляющая цепь этой же микроРНК увеличивалась только в три раза [29]. Одной из наиболее перспективных теорий для объяснения данного феномена является регуляция цепей микроРНК РНК-связывающими белками [30].
Анализ регуляторных взаимодействий ТФ и микроРНК показал, что HIF-1, p65, с-Myc и EGR1 (кодируемые генами HIF1A, RELA, MYC и EGR1) являются ключевыми факторами, регулирующими транскрипцию дифференциально экспрессированных микроРНК (см. рис. 2).
Три из рассмотренных микроРНК продемонстрировали взаимообратную активность, подавляя некоторые из ТФ. В частности, HIF1A является подтвержденной мишенью hsa-miR-18a-5p, которая подавляется множеством ТФ.

ВЫВОДЫ

На основании проведенного интегративного секвенирования микроРНК/мРНК обнаружены значительные изменения транскриптома и профиля микроРНК в клетках линии HT-29 в условиях гипоксии, индуцированной CoCl₂. Показано, что дифференциальная экспрессия нескольких из микроРНК может быть причиной значительного изменения экспрессии их мРНК-мишеней. Анализ регуляторных взаимодействий между факторами транскрипции и микроРНК выявил возможные механизмы, лежащие в основе наблюдаемого ответа на гипоксию.