На сегодняшний день микробиоту кишечника человека (МКЧ) рассматривают как важный орган, играющий ключевую роль в поддержании здоровья человека. МКЧ — это совокупность микроорганизмов, населяющих пищеварительный тракт. В здоровом кишечнике микробные сообщества поддерживают метаболизм человека в гомеостазе и находятся внутри хозяина в состоянии иммунной толерантности. Через симбиотические отношения МКЧ выполняет различные функции, которые вносят большой вклад в физиологию хозяина [1]. Микробиота коэволюционирует со своим хозяином, состав микробного сообщества в пределах кишечного тракта меняется в ответ на различные внутренние и внешние стимулы. Виды бактерий, колонизирующие желудочно-кишечный тракт в раннем возрасте, оказывают влияние на здоровье хозяина в дальнейшей жизни [2]. Бактериальный состав микробиоты стабилизируется после первых трех лет жизни и уже близок к профилю микробиоты взрослого человека [3].

Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о значительном воздействии МКЧ на широкий спектр поведения, включая социальное поведение, настроение, эмоции, тревогу и питание [4]. Кишечные бактерии влияют на различные неврологические состояния человека через так называемую «ось микробиота–кишечник–мозг» [4]. Первичный состав МКЧ может влиять на формирование нейронных сетей в период раннего развития нервной системы ребенка [5]. Бактерии воздействуют на центральную нервную систему (ЦНС) и кишечную нервную систему (ЭНС) различными путями через метаболиты и гормоны иммунной системы и афферентных нервов. Бактерии производят сотни различных соединений, которые могут влиять на физиологию хозяина. Изменения в микробном составе кишечника могут приводить к большим изменениям в продукции метаболитов. Поскольку хозяин постоянно подвергается воздействию этих молекул, не исключено, что они могут способствовать развитию различных нервно-психических расстройств, в том числе и депрессии [6].

Подростковый возраст и половое созревание — это критическая фаза развития нервной системы с многочисленными структурными, нейрохимическими и молекулярными изменениями, происходящими в ответ на генетические и экологические сигналы. В этом возрасте основная микробиота также претерпевает динамический сдвиг в составе и функционировании. Стероидные гормоны вызывают половые различия в микробном составе кишечника. Созревание МКЧ происходит параллельно с динамическим развитием мозга и оба имеют сходные критические периоды в развитии [7].

Использование технологии секвенирования нового поколения позволяет лучше понять состав кишечной микробиоты и исследовать ее структурные изменения на протяжении всей жизни человека [8]. В этом исследовании для изучения МКЧ мы использовали технологию секвенирования метагенома методом дробовика. Метод подразумевает секвенирование всего геномного материала, присутствующего в образце микробиоты, что позволяет не только получить полную информацию о бактериальном составе, но и дает достаточно точную оценку общих метаболических возможностей микробиоты и функциональных возможностей всех присутствующих в ней бактерий. Кроме того, этот метод позволяет анализировать микробиоту на уровне штаммов. Цель нашего исследования заключалась в выявлении различий в таксономическом профиле и содержании бактериальных генов, кодирующих ключевые ферменты, участвующие в метаболизме нейроактивных соединений и биомаркерных метаболитов депрессии в сравниваемых метагеномах от здоровых детей разного возраста: 3–5 лет (метагеном маленьких детей (ММД) и 15 лет (метагеном подростка (МП).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Описание когорт и секвенирования метагеномов

Для проведения исследования использовали ранее секвенированные метагеномы микробиоты кишечника 23 здоровых нейротипичных маленьких детей в возрасте 3–5 лет (группа ММД) [9] и 7 подростков в возрасте 15 лет (группа МП) [10] из московского региона. Критерии включения в исследование: возраст; отсутствие недавних заболеваний желудочно-кишечного тракта; географическое происхождение — Москва и Московская область; отсутствие приема антибиотиков, про- или пребиотиков за 2 месяца до взятия образцов; отсутствие психиатрических расстройств (депрессивных расстройств, шизофрении, биполярного расстройства и т. д.); отсутствие диареи. Фекальные образцы, полученные от каждого волонтера, хранились в стерильных пластиковых контейнерах при температуре –80 C° до проведения анализа.
Выделение тотальной метагеномной ДНК, подготовка библиотек и секвенирование на приборе Illumina HiSeq (Illumina; США) проводили по алгоритму, описанному ранее [9]. Метагеномные чтения были депонированы в базе данных Sequence Read Archive (SRA) NCBI (номер в базе данных BioProject PRJNA516054 — для ММД и PRJNA380118 — для МП). Контроль качества «сырых» чтений проводили при помощи FastQC, а тримминг — с использованием Trimmomatic [11, 12]. Основания с качеством Q < 20 и последовательности короче 50 п.о. были удалены. Для фильтрации человеческой ДНК чтения картировали на геном человека (версия сборки hg19) программой bowtie2 [13]. Метагеномные чтения были собраны в контиги с помощью metaSPADes [14].
Параметры секвенированных образцов и полученных сборок представлены в табл. 1.

Разработка каталога

Каталог гомологов генов, участвующих в синтезе и метаболизме различных нейроактивных соединений, впервые представленный ранее [9, 15], был обновлен и расширен: добавлены гены, участвующие в синтезе и метаболизме различных соединений и метаболитов, описанных в опубликованных данных как биомаркеры депрессии [16]. Аминокислотные последовательности гомологов к данным генам были отобраны по алгоритму, описанному ранее [9] (табл. 2).

Таксономический и статистический анализ

Для определения таксономического состава использовали программы Kraken2 [17] и TAGMA [18]. Анализ проводили отдельно на уровнях типов, родов и видов. Альфа-разнообразие (индекс Шеннона) оценивали с помощью языка программирования R.
Статистически значимые изменения в таксономическом составе на уровнях родов и видов определяли с использованием критерия Уилкоксона и поправки на множественное сравнение методом перестановок (1000 перестановок), порог значимости выбран на уровне P-value < 0,1. Такое значение обусловлено сравнительно малым количеством образцов в группе МП.

Идентификация сигнатур в метагеномных данных

Метагеномной сигнатурой является комбинация генов, найденных в метагеноме, и бактерий, их содержащих [9]. Для определения сигнатур метагеномные сборки были проанализированы по описанному ранее алгоритму [15]. Поиск открытых рамок считывания (ОРС) проводили программой MetaGeneMark (США) [19]. Для аннотации ОРС использовали созданный каталог и BLASTp со следующими параметрами: гомология ≥ 60%; относительная длина выравнивания ≥ 80%. Бактериальное происхождение ОРС определяли на таксономическом уровне видов при помощи Kraken2. Все неклассифицированные последовательности обозначали как «Unclassified». Таким образом, для каждого образца был получен набор пар (вид; ген). Оценку относительной представленности пар определяли методом картирования чтений на соответствующие ОРС с использованием BWA [20]. Рид-каунты нормировали методом «trimmed mean of M values» (TMM) с помощью библиотеки edgeR [21]. Сравнение относительных представленностей пар в группах ММД и МП проводили с помощью критерия Уилкоксона и поправкой на множественное сравнение методом перестановок (1000 перестановок; P-value < 0,1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Расширение каталога генов

Ранее разработанный референсный каталог гомологов генов, участвующих в метаболизме различных соединений с нейромодулирующей активностью, был расширен добавлением генов, кодирующих ферменты для продукции новых соединений и деструкции различных нейроактивных метаболитов [9, 15]. Итоговый каталог насчитывает 742 аминокислотные последовательности гомологов генов, кодирующих 68 бактериальных ферментов. В каталог вошли новые ферменты, участвующие в распаде γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), оксида азота, γ-оксимасляной кислоты и p-крезола, синтезе и распаде изовалериановой кислоты, инозитола и глутамата, а также ферменты с антиоксидантными свойствами: супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Полный список генов, входящих в обновленный каталог, представлен в табл. 2.

Коровая метагеномная сигнатура кишечной микробиоты здоровых детей

На первом этапе в метагеномах группы ММД проводили поиск бактериальных генов, кодирующих ключевые ферменты, участвующие в синтезе нейроактивных соединений и биомаркеров депрессии, которые потенциально могут повлиять на формирование и функционирование нервной системы ребенка в первые годы жизни (рис. 1). Учитывали только гены, найденные более чем в 50% образцов. Наиболее представленными оказались гены, кодирующие метилмалонил-CoA-декарбоксилазу (продукция пропионовой кислоты), фосфотрансацетилазу (продукция уксусной кислоты), глутаматдекарбоксилазу (синтез ГАМК), гамма-аминобутират-антипортер (транспорт ГАМК) и гистидинаммонийлиазу (деструкция гистидина). Были также выявлены гомологи генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболических путях ГАМК, серотонина, мелатонина, масляной кислоты, конъюгированной линолевой кислоты, спермидина, изовалериановой кислоты, инозитола, γ-оксимасляной кислоты, глутамата, креатинина, индола, триптофана, супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы.
Далее было определено бактериальное происхождение генов на уровне видов и построены сигнатурные пары (рис. 2A). Пары, выявленные в подавляющем числе образцов (более 70%), составили коровую нейрометаболическую метагеномную сигнатуру ММД (рис. 2Б). В нее вошли четыре вида (Bacteroides uniformis, Faecalibacterium prausnitzii, Lachnospiraceae bacterium и Parabacteroides distasonis) и гены, кодирующие 15 ферментов (глутаматдекарбоксилазу, гамма-аминобутират-антипортер, серотонин-N-ацетилтрансферазу, фосфотрансацетилазу, бутираткиназу, бутирил-CoA-дегидрогеназу, метилмалонил-CoA-декарбоксилазу, изомеразу линолевой кислоты, спермидинсинтазу, две субъединицы глутаматсинтазы, гистидинаммонийлиазу, триптофаназу, бета-субъединицу триптофансинтазы и супероксиддисмутазу).

Изменения в метагеномной сигнатуре МКЧ с возрастом

Метагеномные образцы МП были проанализированы по тому же алгоритму, что и ММД. Вначале проводили поиск гомологов генов из каталога (см. рис. 1). В среднем, для всех генов, найденных в более чем 50% образцов группы МП, выявлена повышенная относительная представленность по сравнению с группой ММД. В МП не было обнаружено гомологов генов, кодирующих 4-аминобутират аминотрансферазу, креатининамидогидролазу и супероксиддисмутазу (ген sodC), однако это можно объяснить малым числом образцов в выборке. В связи с этим статистические тесты имели малую мощность. Статистически значимое (скорректированное P-value < 0,1) увеличение представленности выявлено в МП для генов, кодирующих фосфотрансацетилазу, бутирил-CoA-дегидрогеназу, метилмалонил-CoA-декарбоксилазу, 4-гидроксифенилацетат декарбоксилазу, альфа- и бета- субъединицы триптофансинтазы, супероксиддисмутазу (ген sodB) и каталазу.
Далее для МП были построены метагеномные сигнатуры и проведено сравнение с ММД по представленности пар (вид; ген) (рис. 2В). Статистически значимое увеличение представленности отмечено для пар (Alistipes onderdonkii; каталаза), (A. onderdonkii; глутаматдекарбоксилаза), (A. onderdonkii; гистидинаммонийлиаза), (A. onderdonkii; 4-гидроксифенилацетатдекарбоксилаза), (Bacteroides vulgatus; гамма-аминобутират-антипортер), (Bacteroides thetaiotaomicron; метилмалонил-CoA-декарбоксилаза) и (Barnesiella viscericola; метилмалонил-CoA-декарбоксилаза). Однако выявленное изменение представленности пар, составляющих коровую сигнатуру, не было значимым.

Сравнительный таксономический анализ кишечной микробиоты детей разного возраста

Все метагеномы были проанализированы программой Kraken2. Сравнение альфа-разнообразия ММД и МП представлено на рис. 3. Среднее значение индекса Шеннона для МП выше как на уровне родов (рис. 3A), так и на уровне видов (рис. 3Б).
Таксономический состав ММД и МП определяли на уровнях типов, родов и видов. На уровне типов МП характеризуются статистически значимым увеличением представленности Proteobacteria (8,99% против 3,37% в ММД и МП соответственно, P-value = 0,001) (рис. 3В). Различия наблюдались и для типов Actinobacteria (4,85% против 2,77%; P-value = 0,735), Bacteroidetes (60,55% против 66,94%; P-value = 0,421), Firmicutes (21,08% против 24,42%; P-value = 0,758) и Verrucomicrobia (0,40% против 1,36%; P-value = 0,298), однако они не были значимыми.
В сравнении представленности на уровнях родов (табл. 3) и видов (табл. 4) участвовали только таксоны, определенные более чем в 50% образцов. В результате статистически значимое увеличение представленности (P-value < 0,1) выявлено для родов Butyrivibrio, Gordonibacter и Prevotella. На уровне видов статистически значимыми (P-value < 0,1) были увеличение представленности Alistipes communis, Alistipes megaguti, Alistipes sp. dk3624, Butyrivibrio fibrisolvens, Butyrivibrio proteoclasticus, Eggerthella sp. YY7918, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus ruminis, Prevotella dentalis, Prevotella denticola, Prevotella enoeca, Prevotella jejuni, Prevotella oris и Prevotella ruminicola и понижение представленности видов Bacteroides sp. A1C1, Gordonibacter pamelaeae, Enterococcus faecalis и Streptococcus thermophiles.
Дополнительно был проведен анализ исследуемых образцов по штаммовому разнообразию с использованием программы TAGMA (Россия) [18] (табл. 5). В МП медианное значение количества штаммов было увеличено по сравнению с ММД для видов Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Escherichia coli и Streptococcus pneumoniae. Большее число штаммов на образец было также показано для вида Enterococcus faecium, однако максимальное число штаммов было выше в группе ММД. Меньшее разнообразие штаммов в группе МП показано для вида Bacteroides fragilis. Помимо этого, у вида Klebsiella pneumonia медианное значение количества штаммов на образец было идентичным для обеих групп, но в МП выявлено значительно большее максимальное число штаммов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для исследования потенциальных механизмов, посредством которых МКЧ может влиять на правильное нейроструктурное и нейрокогнитивное развитие у здоровых детей в раннем возрасте, мы сосредоточились на группе бактериальных генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме нейроактивных соединений, коррелирующих с дисрегуляциями, которые приводят к нейрометаболическим нарушениям и нервно-психическому расстройству — депрессии. Использование составленного каталога гомологов к отобранной группе генов позволило нам определить нейрометаболическую сигнатуру ММД. С помощью сигнатурного подхода были выявлены виды бактерий, которые содержат наибольшее число генов (более семи генов) для продукции различных нейроактивных соединений и, следовательно, потенциально оказывающие большее влияние на развитие и функционирование мозга ребенка. К этим видам относятся: B. uniformis, F. prausnitzii, L. bacterium и P. distasonis, которые являются комменсалами микробиоты кишечника здоровых детей раннего возраста [22]. Эти бактерии содержат гены, кодирующие белки, участвующие в продукции уксусной, пропионовой и масляной кислот, ГАМК, и ферменты с антиоксидантными свойствами, которые оказывают положительное воздействие на психическое здоровье человека. B. uniformis, F. prausnitzii и L. bacterium вошли в коровую метагеномную сигнатуру кишечной микробиоты здоровых детей, которая может служить биомаркерным показателем микробиоты в норме у детей данного возраста.

Представленные исследования являются пилотными, это начальный этап изучения изменений в метаболическом потенциале кишечной микробиоты здоровых детей от раннего возраста до подросткового. Пока для сравнения была использована небольшая выборка группы подростков. Необходимо было определить, происходят ли изменения в микробиоте за время развития ребенка до взрослого возраста. Для этого проводили сравнение таксономических профилей и содержания бактериальных генов, кодирующих ключевые ферменты, участвующие в метаболизме нейроактивных соединений.
Были выявлены различия в количественном содержании бактериальных генов для продукции и деструкции нейрометаболических соединений в составе сравниваемых метагеномов детей разного возраста, что является важнейшим результатом данного исследования. В МП обнаружено двукратное увеличение представленности генов, кодирующих ферменты, участвующие в продукции пропионовой, уксусной и масляной кислот, глутамата, триптофана, деградации гистидина, продукции конъюгированной линолевой кислоты и белков с антиоксидантными свойствами. Все эти соединения, как известно, оказывают положительное влияние на функционирование как кишечника, так и головного мозга и сохранение общего гомеостаза организма. Сообщалось, что уровень короткоцепочечных жирных кислот влияет на энергетический гомеостаз хозяина [23]. Триптофан служит субстратом для выработки нейромедиатора серотонина [24]. Нейротрансмиттеры серотонин и глутамат являются критическим звеном при депрессивном состоянии [25]. Конъюгированная линолевая кислота и белки с антиоксидантными свойствами играют важную защитную роль при окислительном стрессе. Содержание других выявленных генов было незначительным и с небольшой количественной разницей. Эти данные, вероятно, отражают разную степень значимости исследуемых бактериальных генов в поддержании нормального развития нервной системы у здоровых детей. Дальнейшие транскриптомные и метаболомные анализы будут проведены для экспериментального подтверждения полученных результатов биоинформатического анализа метагеномов.

Ранее проведенные исследования (основанные на анализе генов 16S рРНК), направленные на сравнение кишечной микробиоты детей разного возраста, показали существенные различия в таксономическом составе [26]. В нашем исследовании для сравнительного метагеномного анализа использованы данные, полученные с применением технологии секвенирования метагенома методом дробовика. Хотя для сравнения была использована небольшая выборка МП, полученные результаты также показывают среднестатистическую разницу в составе таксонов кишечной микробиоты детей разного возраста. В МП было показано статистически значимое увеличение бактерий, относящихся к типу Proteobacteria, и отсутствовало достоверное различие для типов Actinobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes. Альфа-биоразнообразие МП оказалось выше как на родовом, так и на видовом уровнях, что соответствует опубликованным данным о более разнообразной микробиоте подростков по сравнению с маленькими детьми [26]. Высокое биоразнообразие часто коррелирует с повышенным содержанием пробиотических бактерий. В наших исследованиях в МП выявлено больше бифидобактерий (В. adolescentis) и лактобактерий. Известно, что бифидобактерии и лактобациллы проявляют пробиотические свойства, и недавно они были предложены в качестве «психобиотиков» за их способность продуцировать нейромодуляторы и влиять на взаимоотношения кишечника и мозга [27]. Статистически значимое увеличение относительного содержания было показано в МП для представителей рода Prevotella и снижение содержания бактерии A. muciniphila, которая показывает отрицательную корреляцию с ожирением и воспалением [28]. Возможно, наблюдаемые изменения в составе микробиоты у детей по мере их взросления происходят под воздействием диеты и гормонов. В свою очередь изменения в композиции микробиоты могут влиять на развитие различных отделов головного мозга [29].

Нами получены данные о штаммовом разнообразии сравниваемых групп метагеномов. Выявлено медианное увеличение бактериальных штаммов в МП для патогенных бактерий видов C. botulinum, C. perfringens, E. coli и S. pneumoniae. Возможно, это связано с возрастанием случаев применения антибиотикотерапии во время взросления. Интересно отметить, что в группе МП в среднем больше штаммов на образец для вида E. faecium и меньше штаммов для B. fragilis. Изменения в штаммовом составе микробиоты могут привести к изменению ее метаболической активности, поскольку продуцирование различных активных соединений бактериями штаммоспецифично. Комбинирование методов секвенирования методом дробовика и подхода метагеномных сигнатур в совокупности с биоинформатическими инструментами, позволяющими проводить таксономический анализ на уровне штаммов, может дать нам возможность строить метагеномные сигнатуры уже на уровне штаммов. Это, в свою очередь, должно помочь выявить способность к специфичной продукции нейроактивных соединений у новых штаммов. Данную информацию можно будет использовать в дальнейшем для создания методов диагностики состояния пациентов с такими нейропсихиатрическими заболеваниями, как депрессия, а также для разработки таргетной терапии для улучшения их состояния с применением фарма-, про-, пре и/или психобиотиков [30].

ВЫВОДЫ

Полученные результаты подтверждают и расширяют растущий массив доказательств того, что микробные сообщества кишечника становятся более разнообразными и функциональными в процессе взросления их хозяев. Кишечные бактериальные сообщества значительно обогащаются генами, участвующими в метаболизме нейроактивных соединений и соединений с противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, необходимыми для неврологической функции. Эти изменения происходят в ответ на внутренние и внешние факторы, такие как диета, антибиотики, гормоны, различные стрессы и др. Выявленная нейрометаболическая сигнатура микробиома у здоровых детей раннего возраста может служить биомаркером нормального состояния МКЧ. Будущие исследования должны быть направлены на выявление метагеномной сигнатуры кишечной микробиоты здоровых детей разного возраста из разных медико-социальных групп.