Для повышения эффективности разработки лекарственных препаратов необходимо увеличивать производительность экспериментов, проводимых на доклинической стадии. Существенным недостатком используемых на сегодняшний день in vitro моделей кишечного барьера является скорость образования функционального монослоя энтероцитов со сформировавшимися плотными контактами. Целью работы было провести комплексный подбор параметров (различные покрытия и плотность клеток) для быстрого и эффективного получения пригодного к проведению экспериментов монослоя клеток Caco-2. Для оценки состояния культуры клеток при различных условиях применяли прижизненную микроскопию и импедансную спектроскопию. Для определения возможного биологического механизма действия различных белковых субстратов на энтероциты использовали транскриптомный анализ. Показано, что покрытие субстрата для роста клеток коллагеном IV существенно повышает скорость пролиферации и миграции клеток линии Caco-2. Такое воздействие позволяет в течение 24 ч сформировать функциональный монослой эпителиальных клеток с плотными контактами. С целью получения пригодного для проведения экспериментов кишечного барьера in vitro в течение 24 ч начальная плотность клеток должна лежать в диапазоне 90–200 тыс. клеток на 1 см². Обнаружено, что клетки Caco-2 слабо экспрессируют коллаген IV, при этом рецепторы к коллагену IV у данных клеток экспрессированы на достаточно высоком уровне. Показано также, что еще один компонент базальной мембраны ламинин 332 не оказывает заметного влияния на скорость формирования функционального монослоя эпителиальных клеток. Таким образом, в работе были определены оптимальные параметры, позволяющие существенно повысить производительность экспериментов с in vitro моделями кишки.