Кишка является важным органом, в котором происходит переваривание пищи, всасывание в кровоток питательных веществ и различных лекарственных препаратов, а также взаимодействие микроорганизмов с клетками организма- хозяина. Одна из основных функций кишки — барьерная функция. Нарушение барьерной функции ассоциировано с целым рядом патологических состояний, включая воспалительные и аутоиммунные заболевания [1]. Часто к нарушению барьерной функции кишки приводит прием различных противоопухолевых препаратов [2].
Различают три основных способа транспорта молекул через кишечный барьер: активный транспорт, пассивная диффузия через клеточную мембрану и пассивная диффузия через межклеточное пространство. Ключевым компонентом клеток, регулирующим парацеллюлярный транспорт, являются плотные контакты [3]. Плотные контакты представляют собой белковые комплексы, расположенные ближе к апикальной части эпителиальной клетки и состоящие из нескольких цитоплазматических и трансмембранных белков, включая окклюдины и клаудины. За счет динамических изменений плотных контактов возможно быстрое изменение проницаемости кишки [4]. Состояние плотных контактов могут регулировать различные сигнальные молекулы, в том числе некоторые киназы (c-Src, c-Yes, и др.) и цитокины (ФНОα, интерферрон — и др.) [5]. В связи с важностью плотных контактов для функционирования кишки как в норме, так и при патологии, актуальна задача создания in vitro моделей для оценки влияния различных воздействий на плотные контакты [6, 7].
Существует несколько различных способов измерения парацеллюлярной проницаемости, отражающей состояние плотных контактов. В частности, популярно применение различных молекулярных меток, концентрация которых может быть точно измерена по обе стороны барьера [8, 9]. Однако данный метод достаточно трудоемкий и времязатратный. Альтернативой может быть измерение трансэпителиального сопротивления (TEER) [10]. Данный способ является быстрым и хорошо подходит для высокопроизводительных скринингов, при этом повышения точности измерения TEER можно добиться за счет применения импедансной спектроскопии [11, 12].
На сегодняшний день для моделирования кишечного барьера in vitro широко используют линию клеток Caco-2 [13]. Исходно клетки Caco-2 были получены из аденокарциномы толстой кишки, и оказалось, что они могут спонтанно дифференцироваться в культуре и приобретать многие свойства эпителия тонкой кишки [14, 15]. Известно, что клетки Caco-2 образуют плотные контакты по мере роста и дофференцировки, при этом их плотность выше, чем в нормальной кишке [14, 15]. В связи с таким свойством клетки Caco-2 представляют собой хорошую модель для изучения различных воздействий на плотные контакты. Однако для более широкого применения данной клеточной модели необходимо существенно повысить производительность экспериментов. Частично этого можно добиться при помощи автоматизации культивирования, например с помощью микрофлюидных чипов [16– 18], однако необходимо определить наиболее благоприятные условия культивирования, которые позволят быстро получать готовые клеточные модели.
Целью данной работы было определение оптимальных условий культивирования клеток Caco-2, позволяющих как можно быстрее получить целостный монослой клеток со сформировавшимися плотными контактами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки линии Caco-2 (Институт цитологии РАН; Россия) культивировали в питательной среде MEM (Gibco; США), содержащей 20% об. фетальной бычьей сыворотки (Gibco; США) и 1% об. раствора пенициллина и стрептомицина (Gibco; США). Культивирование проводили при 37 °С в атмосфере 5%-го СО₂. Субкультивирование производили каждые 2–3 дня по стандартной методике при помощи раствора трипсина-ЭДТА («ПанЭко»; Россия). Подсчет числа клеток проводили при помощи автоматического счетчика клеток Countess (Gibco; США) согласно рекомендациям производителя.
Перед посевом клеток в мембранные полиэфирные (PET) вставки HTS Transwell-96 (Corning; США) с размером пор 1 мкм производили покрытие части мембран ламинином-332 (BioLamina; Швеция) и коллагеном IV («Имтек»; Россия). Для этого в мембранные вставки добавляли по 30 мкл раствора соответствующего белка в DPBS с концентрацией 10 мкг/мл. Затем 96-луночный планшет с мембранными вставками инкубировали при температуре 4 °С в течение 24 ч. После инкубации отбирали растворы белков из всех лунок и промывали каждую лунку 3 раза с помощью 100 мкл раствора DPBS. Мембранные вставки HTS непосредственно перед посевом клеток заполняли питательной средой (50 мкл в верхнюю камеру, 235 мкл в нижнюю камеру) и инкубировали в клеточном инкубаторе 1 ч. Далее в каждую мембранную вставку добавляли различное число клеток (6250, 12 500 и 25 000 клеток на лунку) в 50 мкл питательной среды для достижения начальной плотности клеток 43 700, 87 400 и 174 800 клеток на 1 см². Эксперимент проводили в трех повторах. Планшеты с мембранными вставками в течение всего эксперимента инкубировали в клеточном инкубаторе.

Для определения значений TEER через 24 и 48 ч от начала эксперимента измеряли импеданс-спектры, при помощи системы импедансной спектрометрии (НТЦ «БиоКлиникум»; Россия) и оригинальных электродов (НТЦ «БиоКлиникум»; Россия). Значения TEER рассчитывали из описанной ранее эквивалентной электрической схемы [19] при помощи ПО CEISA Impedance fitting (НТЦ «БиоКлиникум»; Россия). Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи языка программирования R 4.0 с интегрированной средой разработки RStudio 1.1 (RStudio PBC; США). Для оценки статистической значимости наблюдаемых различий TEER применяли трехфакторный (тип подложки, начальная плотность клеток и время от начала эксперимента) дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Тьюки на множественные сравнения. Различия считали значимыми при p < 0,05.
Для получения микрофотографий клеток Caco-2 на различных подложках часть лунок в культуральных 96-луночных планшетах (Corning; США) покрывали ламинином-332 (BioLamina; Швеция) и коллагеном IV (Имтек; Россия) по аналогичному с мембранными вставками протоколу. Для покрытия использовали по 50 мкл растворов белков. Далее в лунки вносили по 100 мкл клеточной суспензии в полной питательной среде с концентрацией клеток 100 000 и 200 000 клеток на 1 мл (соответствует начальной плотности клеток 31 300 и 62 600 на 1 см²). Планшеты в течение всего эксперимента инкубировали в клеточном инкубаторе. Микрофотографии получали при помощи инвертированного микроскопа PrimoVert (Carl Zeiss; Германия).
Для получения полностью дифференцированных клеток Caco-2 культивирование проводили по описанной ранее методике [11, 19]. Анализ уровней экспрессии генов в дифференцированных и недифференцированных клетках Caco-2 проводили при помощи микрочипов GeneChip Human Genome 1.0 ST (Affymetrix; США) [20]. Клетки лизировали при помощи лизирующего буфера QIAzol (Qiagen; Германия). Далее проводили выделение тотальной РНК при помощи набора реагентов miRNeasy Mini Kit (Qiagen; Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию выделенной тотальной РНК измеряли при помощи спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific; США). Качество РНК оценивали с помощью системы Experion (Bio-Rad; США). Для гибридизации на микрочипах использовали по 500 нг каждого образца РНК. Эксперимент проводили в трех повторах.
Полученные результаты обрабатывали при помощи программного обеспечения TAC 4.0 (Thermo Fisher Scientific; США). Оценку статистической значимости различий уровней экспрессии между дифференцированными и недифференцированными клетками Caco-2 проводили при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с поправкой Бенджамина–Хохберга. Пороговый уровень значимости был равен 0,05. Гены с уровнем экспрессии ниже 6,0 в логарифмической шкале Affymetrix считали неэкспрессирующимися.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам измерения значений TEER (рис. 1) в мембранных вставках через 24 ч после посева клеток было показано, что TEER возрастает при росте начальной клеточной плотности. Например, для контрольных мембранных вставок без покрытия было обнаружено, что значения TEER примерно на 118 Ом∙см² выше при максимальной протестированной начальной плотности посадки клеток по сравнению с минимальной (p < 0,001). При этом значимых различий между промежуточной и минимальной плотностями обнаружено не было (p = 1). Аналогичные результаты были получены и для покрытия лунок ламинином 332. Причем в случае покрытия ламинином 332 ни для одной протестированной начальной плотности клеток не было обнаружено значительных отличий TEER от контрольных лунок без покрытия (все p = 1). Однако при покрытии коллагеном IV результаты существенно отличались. В данном случае были обнаружены значительные отличия от минимальной исследованной начальной плотности 43 700 клеток на квадратный сантиметр как для начальной плотности, равной 87 400 (увеличение на 147 Ом∙см²; p < 0,001), так и для начальной плотности, равной 174 800 (увеличение на 208 Ом∙см²; p < 0,001). Таким образом, при покрытии коллагеном IV зависимость значений TEER от начальной плотности клеток была более выраженной. Для начальных плотностей клеток 87 400 и 174 800 см^-2 также было обнаружено сильное повышение TEER (на 188 Ом∙см² и 142 Ом∙см² соответственно) при покрытии коллагеном IV по сравнению с контрольными полиэфирными лунками (p < 0,001 в обоих случаях).

Через 48 ч от начала эксперимента значения TEER в контрольных лунках без покрытия существенно выросли при начальной плотности клеток, равной 87 400 и 174 800 см^-2, по сравнению с измерениями, проведенными через 24 ч после посева клеток (на 202 Ом∙см² и 110 Ом∙см² соответственно; p < 0,001 и p = 0,002 соответственно). При этом значимых различий TEER в лунках с минимальной протестированной начальной плотностью клеток 43 700 см^-2 через 48 ч по сравнению с 24 ч от начала эксперимента обнаружено не было (p = 1). В случае покрытия лунок ламинином 332 были получены схожие результаты при сравнении значений TEER через 48 ч и 24 ч после посева клеток: при начальной плотности 43 700 см^-2 значимых различий обнаружено не было (p = 0,1), при начальной плотности 87 400 см^-2 значения TEER значимо выросли на 165 Ом∙см2 (p < 0,001), однако при начальной плотности 174 800 см^-2 наблюдаемый рост на 83 Ом∙см2 не был статистически значимым (p = 1). В то же время в покрытых коллагеном IV лунках через 48 ч значения TEER значимо увеличились на 175 Ом∙см² по сравнению с измерениями, проведенными в предыдущий день, только при минимальной начальной плотности клеток (p < 0,001), а при 87 400 см^-2 и 174 800 см^-2 значимых различий обнаружено не было (p = 0,2 и p = 1 соответственно).

Интересно, что для лунок без покрытия и при покрытии ламинином 332 значения TEER все еще зависели от начальной плотности клеток через 48 ч после их посева. При сравнении с минимальной протестированной клеточной плотностью в случае непокрытых полиэфирных лунок значения TEER были выше как при начальной плотности 87 400 см^-2 (на 172 Ом∙см²; p < 0,001), так и при начальной плотности 174 800 см^-2 (на 188 Ом∙см²; p < 0,001). Аналогичные результаты были получены и в случае покрытия ламинином 332. При этом значения TEER, в лунках покрытых коллагеном IV, значимо не зависели от начальной плотности клеток через 48 ч после начала эксперимента (все p = 1) и были выше 200 Ом∙см².

С целью оценки влияния покрытия субстрата для роста клеток коллагеном IV и ламинином 332 на морфологию и скорость роста клеток была проведена прижизненная микроскопия клеток Caco-2 при различных начальных плотностях через 24 ч после посева клеток (рис. 2). Оказалось, что для контрольных непокрытых полистироловых лунок и в случае покрытия ламинином 332 при рассмотренных начальных плотностях клеток 100%-я конфлюэнтность не достигается. Однако при покрытии коллагеном IV уже при начальной плотности 31 300 см^-2 около 80% поверхности оказывается покрыто клетками, а при начальной плотности 62 600 см^-2 в лунках образуется сформированный монослой. При этом при покрытии коллагеном IV в культуре обнаружено повышенное содержание вытянутых веретенообразных клеток, по сравнению с контрольными лунками и лунками с покрытием ламинином 332.

В результате проведенного транскриптомного анализа было показано (см. таблица), что как в дифференцированных, так и в недифференцированных клетках Caco-2 экспрессия всех цепей коллагена IV находится на достаточно низком уровне (все значения меньше 7 в логарифмической шкале Affymetrix). Более того, по мере дифференцировки клеток наблюдалось небольшое снижение экспрессии генов COL4A1 и COL4A6.

Известно, что основными рецепторами коллагена IV являются интегрины α1β1 и α2β1 [21]. По данным проведенного транскриптомного анализа было показано, что ген ITGB1 (β1-цепь интегрина) экспрессируется на достаточно высоком уровне как в дифференцированных, так и в недифференцированных клетках Caco-2 (значения в логарифмической шкале Affymetrix — 10,0 и 10,1 соответственно), причем его экспрессия значимо не меняется по мере дифференцировки (p = 0,4). Ген ITGA1 (α1-цепь интегрина) тоже экспрессировался в дифференцированных и в недифференцированных клетках Caco-2 (значения в логарифмической шкале Affymetrix — 8,6 и 9,0 соответственно), однако его экспрессия слегка падала в дифференцированных клетках (в 1,3 раза; p = 0,002). Аналогичные результаты были получены и для гена ITGA2 (α2-цепь интегрина): средние значения экспрессии в дифференцированных и недифференцированных клетках составили 9,2 и 9,5 логарифмических единиц Affymetrix, при этом небольшое снижение экспрессии в дифференцированных клетках было статистически значимым (в 1,3 раза; p = 0,04).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Из полученных данных следует, что коллаген IV является наиболее эффективным субстратом, значительно ускоряющим скорость формирования фукционального эпителиального барьера клеток кишки. Известно, что некоторые цепи коллагена IV (α1, α2, α5 и α6) участвуют в формировании и развитии кишки, причем данные белки могут синтезировать как эпителиальные, так и мезенхимальные клетки [22]. Судя по результатам проведенного транскриптомного анализа, клетки Caco-2 не могут в достаточной мере синтезировать коллаген IV, при этом на всех стадиях они экспрессируют рецепторы к коллагену IV, что свидетельствует о возможности его влияния на жизнедеятельность клетки.
Исходя из полученных микрофотографий можно сделать вывод, что коллаген IV способствует как пролиферации, так и миграции клеток Caco-2. На сегодняшний день накоплен достаточно большой массив данных, свидетельствующих о том, что коллаген IV стимулирует прикрепление и миграцию клеток Caco- 2 [23–25]. Известно также, что коллаген IV может стимулировать пролиферацию некоторых других типов эпителиальных клеток [26, 27]. Таким образом, полученные результаты хорошо согласуются с проведенными ранее исследованиями.
Ранее уже было изучено влияние коллагена IV на величину TEER монослоя клеток Caco-2 и обнаружено, что через несколько дней после посева клеток значения TEER были значительно выше в лунках, покрытых коллагеном IV, однако динамику изменений TEER в течение первых нескольких дней культивирования не определяли [28]. В данной работе было показано, что коллаген IV влияет не только на величины TEER, но и на скорость достижения минимально достаточных для проведения экспериментов с барьерными моделями значений TEER (примерно 200 Ом∙см²) [9], причем таких значений точно можно добиться в течение 24 ч, а возможно и раньше. Полученная методика может быть легко перенесена как на другие статические in vitro модели барьерных тканей, так и на современные динамические микрофлюидные системы [29, 30].

ВЫВОДЫ

В данной работе было показано, что покрытие субстрата для роста клеток коллагеном IV существенно повышает скорость пролиферации и миграции клеток линии Caco-2.
Такое воздействие позволяет быстро в течение 24 ч сформировать функциональный монослой эпителиальных клеток с плотными контактами. Был определен оптимальный диапазон начальной плотности клеток. С целью получения пригодного для проведения экспериментов кишечного барьера in vitro в течение 24 ч начальная плотность клеток должна лежать в диапазоне 90–200 тыс. клеток на 1 см². Обнаружено, что коллаген IV слабо экспрессируется клетками Caco-2, при этом рецепторы к коллагену IV у данных клеток экспрессированы на достаточно высоком уровне. В то же время было показано, что еще один компонент базальной мембраны (ламинин 332) не оказывает заметного влияния на скорость формирования функционального монослоя эпителиальных клеток.
Полученные результаты в будущем могут быть использованы для повышения производительности экспериментов с in vitro моделями кишечного барьера, как в статических условиях, так и в микрофлюидных системах.