Главными факторами, влияющими на развитие рака молочной железы (РМЖ), являются гормональный статус и генетическая предрасположенность [1].

Большинство всех случаев заболевания приходится на спорадический (ненаследственный) РМЖ. Его отмечают у 90–95% заболевших. Наследственные формы, характеризующиеся различными мутациями в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, ATM, PALB2 и др. [2, 3], выявляют у 5–10% пациентов с диагнозом РМЖ [2].

Наиболее часто наследственный характер РМЖ обусловлен наличием мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Эти гены кодируют белки, которые отвечают за процессы репарации двунитевых разрывов ДНК, контролируют прохождение клеточного цикла, регулируют транскрипцию и апоптоз, поддерживая геномную стабильность [4]. Повреждения в данных генах увеличивают вероятность развития онкологических заболеваний, большая часть из которых возникает в молодом возрасте [5, 6]. Наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 во многом определяет выбор тактики лечения, а также профилактических мероприятий [7].

В настоящее время в России определение наследственных форм РМЖ осуществляют с помощью «стандартных» диагностических панелей, которые методом ПЦР позволяют быстро и сравнительно недорого обнаружить наиболее характерные для нашей популяции повреждения в генах BRCA1 и BRCA2 [8]. Однако ряд проведенных исследований указывает на наличие других клинически значимых мутаций, которые не определяются «стандартной» панелью, но также увеличивают онкологический риск, а, следовательно, их наличие требует специализированного подхода при лечении и профилактике заболеваний [9].

Целью работы было исследовать особенности BRCAассоциированного РМЖ в российской популяции.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 4440 пациентов, которые проходили обследование и лечение в Российском научном центре рентгенорадиологии с 2010 по 2019 г. Критерий включения: наличие у пациента диагноза РМЖ. Критерий исключения: отказ пациента от участия в исследовании. Возраст манифестации заболевания пациентов варьировал от 20 до 90 лет (табл. 1). Всем пациентам проведено гистологическое исследование тканей опухоли, а также выполнен иммуно-гистохимический анализ (ИГХ) опухолевых образцов. При сборе анамнеза особое внимание уделяли факторам, указывающим на возможный наследственный характер заболевания.

На основании данных анамнеза, согласно рекомендациям Национальной онкологической сети США (NCCN) [7], была сформирована группа повышенного риска (с клиническими признаками наследственного заболевания (КПНЗ)), в которую вошли 1026 больных РМЖ в возрасте 20–90 лет. Пациента включали в группу повышенного риска, если он имел хотя бы один КПНЗ: молодой возраст манифестации заболевания (до 50 лет), наличие первичномножественных опухолей (РМЖ и/или рак яичников (РЯ)), онкологически отягощенный семейный анамнез (РМЖ и/ или РЯ у родственников первой и/или второй степени родства), трижды негативный молекулярный подтип опухоли.

На первом этапе исследования у всех 4440 пациентов методом ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) определяли наличие наиболее распространенных в российской популяции мутаций в генах BRCA1 и BRCA2: 185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G, 2080delA (BRCA1) и 6174delT (BRCA2). Для выделения ДНК использовали наборы «М-Сорб» («Синтол»; Россия). Постановку РТ-ПЦР проводили с использованием панели реагентов «ОнкоГенетика BRCA» («ДНК-Технология»; Россия), включающей специфичные праймеры для детекции восьми исследуемых мутаций.

На втором этапе были обследованы 290 пациентов из группы повышенного риска возникновения РМЖ, у которых не были выявлены «стандартные» мутации на первом этапе исследования. Им проводили анализ всей кодирующей части генов BRCA1 и BRCA2 методом высокопроизводительного секвенирования (NGS).

Геномную ДНК выделяли из периферической крови с использованием реактивов «QIAamp DNA Blood Mini Kit» (Qiagen; Германия) по протоколу производителя. Рабочая концентрация ДНК составляла не менее 10 нг/мкл. Подготовку библиотек для секвенирования проводили по протоколу фирмы-производителя с использованием методики селективного захвата таргетных участков ДНК с помощью панели «TruSight Cancer» (Illumina; США) и набора реагентов «TruSight Rapid Capture» (Illumina; США).

Секвенирование подготовленных библиотек проводили на приборе «MiSeq» (Illumina; США) с использованием наборов реагентов «MiSeq Reagent Kits v2» (Illumina; США) методом парно-концевого чтения (2 × 151 пар оснований). Среднее покрытие исследуемых таргетных участков ДНК составило не менее 100×.

Обработка полученных после секвенирования данных, осуществленная с помощью стандартного программного обеспечения «MiSeq Reporter v2.5» (Illumina; США), позволила выявить в ряде образцов генетические нарушения в исследуемых регионах. Для снижения вероятности появления ошибок риды с низким качеством прочтения исключали из анализа. Аннотацию и классификацию выявленных генетических вариантов проводили с использованием программного обеспечения «Variant Studio 2.2» (Illumina; США).

Клиническую значимость выявленных генетических нарушений оценивали на основании критериев оценки «патогенности» генетических вариантов, предложенной Американским колледжем медицинской генетики (ACMG) [10], с учетом информации в доступных базах данных: «dbSNP» («The Single Nucleotide Polymorphism database»), «ClinVar» («Clinical Variation»), «HGMD» («Human Gene Mutation Database»), «BIC» («Breast Cancer Information Core»), «OMIM» («Online Mendelian Inheritance in Man»), «ExAC» («Exome Aggregation Consortium»), «1000G» («1000 Genomes Project») и программ предсказания патогенности «CADD» («Combined Annotation Dependent Depletion»), «PolyPhen» («Polymorphism Phenotyping») и «Sift» («Sorting Intolerant from Tolerant»). Генетические варианты, не имеющие клинического значения, а также имеющие неизвестное клиническое значение, в данной работе не рассматривали.

Для верификации выявленных изменений нуклеотидной последовательности использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Анализ проводили на автоматическом капиллярном секвенаторе «ABI PRISM 3100» (Applied Biosystems; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В общей группе пациентов с установленным диагнозом РМЖ (n = 4440) методом РТ-ПЦР у 169 человек, что составило 3,8%, были выявлены мутации, входящие в «стандартные» диагностические панели, в генах BRCA1 и BRCA2 (табл. 2). При анализе частоты «стандартных» мутаций в группе пациентов с КПНЗ отмечено, что частота данных генетических изменений в этой группе в 4 раза превысила уровень в общей группе и составила 15,4%. Показано, что наиболее распространенным вариантом была мутация 5382insC в гене BRCA1. Частота встречаемости данного варианта в общей группе составила 2,9%, а в группе пациентов с КПНЗ — 11,5%, т. е. он был обнаружен примерно у каждого девятого пациента из группы повышенного риска. Среди выявленных «стандартных» мутаций вариант 5382insC обнаружен в 75% случаев. Остальные генетические варианты из «стандартной» диагностической панели встретились по крайней мере на порядок реже (табл. 2).

Анализ всей кодирующей области, а также регионов сплайсинга генов BRCA1 и BRCA2 методом высокопроизводительного секвенирования позволил выявить 33 клинически значимых генетических варианта у 40 из 290 (13,8%) больных РМЖ из группы повышенного риска. В 18 случаях мутации были обнаружены в гене BRCA1 и представлены девятью вариантами нонсенсмутаций, тремя вариантами делеций со сдвигом рамки считывания и двумя нарушениями в сайтах сплайсинга. В гене BRCA2 патогенные варианты нуклеотидной последовательности были обнаружены у 22 пациентов и представляли собой семь вариантов нонсенс-мутаций, восемь вариантов делеций и инсерций со сдвигом рамки считывания и два нарушения в сайтах сплайсинга (табл. 3).

Среди выявленных генетических нарушений наиболее частым вариантом изменения нуклеотидной последовательности была мутация c.3607C>T в гене BRCA1, обнаруженная в 7,5% случаев (у трех пациентов). Частота в спектре выявленных патогенных вариантов на уровне 5% была обнаружена для мутаций c.4689C>G и c.5224C>T — в гене BRCA1, c.1301_1304delAAAG, c.9089_9090insA и c.3283C>T — в гене BRCA2.

Частота встречаемости каждого из выявленных методом NGS патогенных вариантов сопоставима с частотой распространенных «стандартных» мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 (статистически значимые различия не обнаружены, p > 0,05), за исключением мутации 5382insC в гене BRCA1.

Учитывая имеющиеся сведения об особенностях BRCA-ассоциированного РМЖ, провели анализ некоторых клинических характеристик пациентов — носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 и морфологических характеристик опухоли (табл. 4). У 94% больных BRCA1-ассоциированным и у всех больных BRCA2-ассоциированным РМЖ наблюдали один или несколько признаков наследственного заболевания (возраст до 50 лет, онкологически отягощенный семейный анамнез, первично-множественные злокачественные новообразования, трижды негативный молекулярный подтип опухоли). У 6% пациентов клинические признаки наследственного заболевания отсутствовали.

Сравнение групп пациентов с выявленными мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 показало, что в группе больных BRCA1-ассоциированным РМЖ средний возраст манифестации заболевания составил 42 года (20–82 года), а группа больных BRCA2-ассоциированным РМЖ характеризовалась более высоким средним возрастом начала заболевания — 44 года (25–79 лет). При этом в группе носителей мутаций в гене BRCA2 у 87% пациентов установлена манифестация заболевания в молодом возрасте (до 50 лет), в то время как в группе больных BRCA1-ассоциированным РМЖ молодой возраст начала заболевания отмечен в 81% случаев.

Больше половины больных — носителей мутаций в генах BRCA1 (63%) и BRCA2 (74%) отметили наличие онкологических заболеваний (РМЖ/РЯ) у кровных родственников. Для носителей мутаций как в гене BRCA1, так и в гене BRCA2 зафиксирована довольно высокая частота первично-множественных злокачественных новообразований (в 22 и 30% случаев соответственно) (табл. 4).

Результаты исследования показали, что большая часть как BRCA1-ассоциированных (91%), так и BRCA2-ассоциированных опухолей (61%) относилась к инвазивному протоковому типу РМЖ (табл. 4). Однако при сравнении данных групп было отмечено преобладание инвазивного протокового гистологического типа опухоли у носителей мутаций в гене BRCA1 (91%) по сравнению с носителями мутаций в гене BRCA2 (61%) (р = 0,0003). Для BRCA2-ассоциированных опухолей, напротив, наблюдалось преобладание инвазивного долькового РМЖ (30%) по сравнению с BRCA1-ассоциированными опухолями (5%) (р = 0,0005).

Современная классификация молекулярных подтипов РМЖ основана на определении с помощью ИГХ уровней экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PR) и эпидермального фактора роста (Her2). Данные показатели, определенные в баллах, позволяют отнести РМЖ к одному из молекулярных подтипов, что, в свою очередь, во многом определяет тактику лечения и прогноз заболевания. В проведенном исследовании трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ) был выявлен в 29% случаев (у 54 человек) BRCA1-ассоциированного РМЖ и лишь в 4% случаев (у одного человека) BRCA2ассоциированного РМЖ. В настоящем исследовании почти все BRCA2-ассоциированные опухоли (96%) относились к люминальному подтипу и характеризовались экспрессией рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты проведенного исследования согласуются с данными ранее опубликованных работ и подтверждают достаточно высокую частоту мутантных вариантов в генах BRCA1 и BRCA2 в российской популяции, наиболее распространенным из которых является мутация 5382insC в гене BRCA1, встречающаяся на порядок чаще остальных мутаций в данных генах [2, 3, 8]. Данный факт подтверждает предположение о славянском происхождении этого генетического варианта [2].

Среди редких патогенных мутаций, выявленных методом высокопроизводительного секвенирования, наиболее частым вариантом изменения нуклеотидной последовательности была мутация c.3607C>T в гене BRCA1. Данный генетический вариант описан в литературе и характеризуется высоким риском развития как РМЖ, так и рака яичника [11, 12].

Проведенный анализ международных и российских публикаций и баз данных показал, что в российских исследованиях описано лишь несколько из выявленных редких генетических вариантов. Мутация c.3607C>T в гене BRCA1 описана у пациентки из Санкт-Петербурга с диагнозом РМЖ, семейный анамнез которой онкологически отягощен [13]. Мутации c.5224C>T и c.5314C>T в гене BRCA1 обнаружены в татарской популяции у пациентов с наследственным РМЖ и РЯ [14]. Мутации c.4689C>G, c.5152+1G>T — в гене BRCA1, c.6997_6998insT, c.7254_7255delAG и c.658_659delGT — в гене BRCA2 были найдены у жителей Сибири и Дальнего Востока с наследственным РМЖ и РЯ [15]. Остальные выявленные методом NGS генетические варианты описаны лишь в зарубежных публикациях и базах данных.

Результаты проведенного исследования подтверждают, что для больных РМЖ — носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 характерно наличие КПНЗ, которые включают: молодой возраст манифестации заболевания (до 50 лет), наличие первично-множественных опухолей (РМЖ и/или РЯ), онкологически отягощенный семейный анамнез (РМЖ и/или РЯ у родственников первой и/или второй степени родства), трижды негативный молекулярный подтип опухоли. Отсутствие КПНЗ у 6% больных c мутациями в гене BRCA1 может быть связано как с отсутствием у пациента данных об онкологических заболеваниях родственников, так и с возможностью появления этих мутаций de novo.

Для группы больных BRCA2-ассоциированным РМЖ был характерен более высокий средний возраст начала заболевания (44 года) по сравнению с группой больных РМЖ с мутациями в гене BRCA1 (42 года), что согласуется с литературными данными. По результатам объединенного исследования, включившего в себя анализ патоморфологических характеристик опухоли и клинических данных 3797 носителей мутаций в гене BRCA1 и 2392 носителей мутаций в гене BRCA2, медиана возраста манифестации заболевания для BRCA1-ассоциированного РМЖ составила 40 лет, для BRCA2-ассоциированного РМЖ — 43 года [16].

Полученные в настоящем исследовании данные подтверждают, что большинство BRCA-ассоциированных опухолей относится к инвазивному протоковому гистологическому подтипу, однако среди BRCA2ассоциированных опухолей преобладает инвазивный дольковый РМЖ по сравнению с BRCA1-ассоциированными опухолями [16].

Для носителей мутаций в гене BRCA1 показано, что опухоль наиболее часто характеризуется отсутствием экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PR) и эпидермального фактора роста (Her2), т. е. относится к ТНРМЖ по сравнению с больными РМЖ без повреждений в данном гене [16, 17]. В проведенном исследовании ТНРМЖ был выявлен в 29% случаев BRCA1- ассоциированного РМЖ, что статистически значимо различается с числом случаев ТНРМЖ у пациентов с мутацией в гене BRCA2. В настоящем исследовании почти все BRCA2-ассоциированные опухоли (96%) относились к люминальному подтипу и характеризовались экспрессией рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), что также свойственно для спорадического РМЖ [18].

ВЫВОДЫ

Таким образом, BRCA-ассоциированный РМЖ в российской популяции характеризуется широким спектром патогенных вариантов, который не ограничен мутациями, включенными в «стандартные» клинико-диагностические панели, подходящие скорее для первичного скрининга. Полученные результаты указывают на необходимость анализа всей кодирующей части генов BRCA1 и BRCA2, что позволит повысить эффективность выявления герминальных мутаций у больных РМЖ по крайней мере в 2 раза. В связи с наличием определенных клинико-морфологических особенностей у BRCA-ассоциированного РМЖ в первую очередь такое исследование необходимо проводить пациентам, имеющим ранний возраст развития заболевания (до 50 лет), кровных родственников с онкологическими заболеваниями в анамнезе (РМЖ и РЯ), первично-множественные злокачественные новообразования (РМЖ и РМЖ и/или РЯ), трижды негативный молекулярный подтип опухоли.