Исследователи всего мира активно изучают вирус SARSCoV-2 и связанное с ним заболевание COVID-19. Особую важность эти работы имеют для когорты беременных женщин, так как несут безотлагательный характер, и новые сведения о COVID-19 смогут уже сегодня помочь здоровью будущего поколения.  На сегодняшний день нет достоверных данных об увеличении частоты акушерских патологий, как и информации о возможной перинатальной передаче вируса SARS-CoV-2. Показана вероятная связь COVID-19 у беременной/роженицы с развитием дистресс-синдрома у плода, тромбоцитопенией и нарушением функции печени у новорожденного [1, 2]. Согласно исследованию ученых из Цюриха, COVID-19 вызывает системное воспаление сосудов легких (васкулит)  с поражением многих органов и систем без видимой связи с пневмонией. Воспаление затрагивает эндотелий — внутреннюю выстилку кровеносных сосудов различных органов [3]. Нарушение развития плаценты на ранних сроках беременности, ассоциированное с системным поражением эндотелия сосудов при COVID-19, может привести к формированию плацентарного оксидативного стресса и ряду осложнений [4, 5]. Анализ данных литературы свидетельствует о том, что синдром системного воспалительного ответа (ССВО) у беременных при COVID-19 объединяет многие патогенетические механизмы, приводящие к активации процессов воспаления и изменению иммунного ответа. Понимание патофизиологических механизмов ССВО при COVID-19, задействованных в системе «мать–плацента– плод», способствует совершенствованию методов диагностики и подбору патогенетически обоснованной терапии ряда акушерских осложнений [5, 6].

Целью исследования было выявить гистологические и иммуногистохимические (ИГХ) особенности ткани плаценты беременных женщин с COVID-19 на разных сроках гестации и изучить связь данных нарушений с патогенетическими механизмами болезни в системе «мать–плацента–плод».

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В период с марта по май 2020 г. в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова на базе 1-го инфекционного отделения была создана «красная зона», где проходили лечение и обследование пациенты с диагнозом COVID-19, в том числе беременные женщины. Подготовлено 190 коек для лечения пациентов с COVID-19 и 60 коек акушерского профиля. Биологические материалы (венозная материнская кровь, пуповинная кровь, амниотическая жидкость, ткань плаценты) были переданы на хранение в сертифицированный биобанк Центра. В основную группу вошли беременные женщины с наличием верифицированного диагноза COVID-19. Средний возраст пациенток составил (30,3 ± 6,25) года. Включение в группу происходило по мере обращения. Для решения поставленных задач было проведено клиниколабораторное исследование и ведение беременности у 66 женщин с COVID-19 (плацентарная ткань исследована в 42 случаях, окончившихся родоразрешением, и одном случае с летальным исходом) и 40 беременных группы сравнения, не имеющих клинических и лабораторных признаков вирусной инфекции.

Критерии включения: в I группу — наличие COVID-19, установленного по данным молекулярно-генетического обследования (ПЦР); во II группу — отсутствие COVID-19 по данным клинического обследования, результатам ПЦР-исследования. Критерии исключения: многоплодная беременность.

Были выполнены макроскопическое и микроскопическое исследования 42 образцов плаценты от родильниц с COVID-19, одной плаценты от пациентки с летальным исходом и 40 плацент условно здоровых родильниц из группы сравнения. В качестве дополнительной группы сравнения и для исключения форм заболевания, перенесенных в стертой форме, были взяты парафиновые блоки образцов плацент женщин с неосложненной беременностью, родоразрешенных в 2017–2018 гг. На серийных парафиновых срезах проводили гистологическое (окраска гематоксилином и эозином) и ИГХ-исследование. В 10%-м формалине (pH 7,4) на парафиновых срезах толщиной 4 мкм с помощью иммуностейнера закрытого типа Ventana (Roche; Великобритания) с закрытым набором для детекции проводили ИГХ-анализ. Протокол автоматизированного окрашивания образцов включал все этапы стандартной ИГХ-процедуры. Система визуализации — Ultra View Universal DAB, Detection Kit («Вентана Медикал Системс, Инк.»; США). Для выявления вирусных частиц в ткани плаценты использовали первичные моноклональные антитела SARS-CoV-2 nucleoprotein antibody (N-белок (NP), clon 1518 (1:1000); Bialexa, Россия). Наиболее важным был вопрос контроля оценки экспрессии NP к вирусу SARS-CoV-2. Предварительно антитела к SARS-CoV-2 проверяли метом иммуноблотинга с использованием рекомбинантного белка. Путем морфометрии оценивали степень повреждения мембран СЦТ ворсинчатого дерева. Оценку проводили при помощи системы анализа изображения NIS-Element AR3 (Nikon; Чехия) на базе микроскопа Nikon ECLIPSE 80i. Статистическую обработку полученных данных осуществляли в пакете программ

«SPSS Statistics for Windows v. 21». 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате анализа клинико-анамнестических характеристик пациенток с COVID-19 получены следующие данные: средний возраст пациенток составил (30,3 ± 6,25) года, средний индекс массы тела — (27,1 ± 4,6) кг / м², средняя продолжительность заболевания — 17,6 (6–34) дня, длительность госпитализации — 14,9 (4–30) дней. Отрицательные результаты ПЦР-теста, подтверждающие отсутствие вируса SARS-CoV-2 в слизистой ротоглотки, диагностировали в среднем через 15,6 (6–31) дня. Основными клиническими симптомами, выявляемыми у пациенток, были потеря обоняния (34,9%), гипертермия (33,3%) и кашель (51,5%). Бессимптомное течение COVID-19 зарегистрировано в 15 (22,7%) случаях. Легкое, среднее и тяжелое течение заболевания отмечено в 25 (38%), 20 (30,2%) и 6 (9,1%) случаях соответственно.

Все беременные получали низкомолекулярный гепарин и интерферон альфа-2b. Противомикробные препараты включали амоксициллин / клавулановую кислоту (46%) и макролиды (28%). В тяжелых случаях заболевания антибиотиками выбора были карбапенемы. Дополнительная оксигенация потребовалась в шести случаях (9%), из них в четырех (6%) случаях ее проводили в отделении интенсивной терапии и в двух (3%) — во время искусственной вентиляции легких. Назначали также кортикостероиды (дексаметазон 12 мг / сут. в течение 3–4 дней) и иммуноглобулиновую терапию (0,5 г / кг в течение 3–4 дней). Один случай материнской смерти от тромбоэмболии легочной артерии и прогрессирования синдрома полиорганной дисфункции на фоне тяжелого гематологического заболевания произошел на 33-и сутки после госпитализации пациентки. Самопроизвольный выкидыш произошел на 21–22-й неделе беременности. Роды и пролонгирование беременности произошли в 42 (63,6%) и 20 (30,3%) случаях соответственно, самопроизвольные выкидыши — в четырех случаях (6,1%) из 66. Родоразрешение выполнено у 42 женщин, из которых восемь преждевременных (19%) и 34 доношенных (81%) родов. Кесарево сечение проведено в 17 (40,5%) случаях, вакуум-экстракция в связи с дистрессом плода — в двух (4,8%) случаях, нормальные роды через естественные родовые пути — в 23 случаях (54,7%). Средний вес при рождении составил 3283 ± 477 г, средняя длина — 52 ± 2,75 см. Новорожденные были оценены по шкале Апгар на первой минуте (7,8 ± 0,6) и пятой минуте (8,7 ± 0,5). Случаев COVID-19 у новорожденных не зарегистрировано. Новорожденные сразу после рождения были изолированы от их матерей, пока мать не получила два отрицательных результата теста на SARSCoV-2. После получения отрицательных результатов ПЦР женщины возобновляли кормление грудью. Все новорожденные были протестированы на SARS-CoV-2 сразу после рождения, а также на третий и 10-й дни после рождения. Все новорожденные получили отрицательные результаты анализов, которые могут свидетельствовать об отсутствии вертикальной передачи инфекции. 

Образцы ткани плаценты от 42 пациенток, родоразрешенных в «красной зоне», одной пациентки с летальным исходом и 40 условно здоровых пациенток группы сравнения были направлены для дальнейшего гистологического и ИГХ-исследований в патологоанатомическое отделение. При гистологическом исследовании у пациенток с COVID-19 было зафиксировано меньшее, чем следовало ожидать, число воспалительных заболеваний плаценты (пуповины, плодных оболочек и ворсинчатого дерева) (менее 10%). При этом преобладали очаговые формы виллитов (поражения >3 полей зрения из 10 при 200-кратном увеличении микроскопа), которые выявлялись только при ИГХ-окрашивании с антителами к CD4 (маркер лимфоцитов и макрофагов) (рис. 1А–Е и рис. 2А–Г). При углубленном анализе сочетанных изменений плаценты у пациенток основной группы были выявлены достоверные различия (р < 0,05), которые проявлялись преобладанием гиперкапилляризации терминальных ворсин (средней и тяжелой степени) или патологической незрелости ворсинчатого дерева (см. рис. 1А–Е). Гистологическая картина ворсинчатого дерева у пациенток с COVID-19 соответствовала разветвленному ангиогенезу (ангиогенезу с преобладанием ветвления сосудов) (23 и 32 балла по шкале Berniske, Kaufman, 2006) умеренной и выраженной и степени, что свидетельствует о вовлечении компенсаторных механизмов и чаще характерно для внутриутробной гипоксии. Число инфарктов ворсинчатого дерева в группе пациенток, заболевших новой коронавирусной инфекцией, было значимо выше и в основном связано с тяжелыми формами (р < 0,05) (см. рис. 1А–Е). Число межворсинчатых кровоизлияний и тромбов в просвете сосудов имело тенденцию к повышению (см. рис. 1А–Е). В плаценте женщины, страдавшей лейкозом (случай с летальным исходом), было поражено до 90% ворсинчатого дерева среди полей инфарктов, множественных кровоизлияний и гематом (субамниотические, межворсинчатые, ретрохориальные), депозитов массивных отложений плодного фибриноида, среди которых различались только единичные ворсины, часть из них — с дистрофическими изменениями (см. рис. 1А–Е). Наряду с этим у пациенток с COVID-19, дети которых родились здоровыми, при анализе ворсинчатого дерева плаценты и степени повреждения СЦТ ворсин отмечено сохранение мембран СЦТ и отсутствие слущивания клеток с поверхности ворсины. На наш взгляд, имеет ключевое значение тот факт, что у женщин с COVID-19 степень повреждения трофобласта была менее 10%, т. е. соответствует нормальным показателям [7] и при попадании в материнский кровоток разрушенные компартменты трофобласта не инициируют запуск системного воспалительного ответа матери, имеющего место при преэклампсии. При оценке результатов ИГХ-исследования с первичными антителами к N-белку SARS-CoV-2 обращало внимание отсутствие окрашивания большинства ворсин плаценты у женщин, страдающих легкими формами. У женщин со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания выявлено очаговое окрашивание мембраны и цитоплазмы отдельных ворсин СЦТ, синцитиальных узелков, мелких участков базальной мембраны, эндотелия отдельных сосудов ворсин, макрофагов (рис. 3А–Е). В плодных оболочках и пуповине вирусных частиц обнаружено не было. Напротив, у пациентки, страдавшей лейкозом (случай с летальным исходом), среди полей инфарктов и кровоизлияний различались единичные ворсины с положительным окрашиванием антителами к вирусу (рис. 3; темно-окрашенные участки). Положительно окрашенные участки соответствовали контуру СЦТ ворсин, часть ворсин были дистрофически изменены и замурованы в плодный фибриноид (см. рис. 3А–Е). Таким образом, плодный фибриноид, образующийся в месте повреждения ворсинчатого дерева преимущественно из коагулированнных белков плазмы, функциональная роль которого заключается в разобщении материнского и фетального кровотока при повреждении плаценты, при попадании вирусных частиц в межворсинчатое пространство стремится локализовать и инактивировать вирусные частицы, чтобы они не попали в кровоток плода. В сосудах плацент пациенток с COVID-19, дети которых родились здоровыми, отсутствовали васкулиты и периваскулиты, что противоречит данным о поражении легких и других внутренних органов в результате гранулематозного поражения, о которых писали ряд исследователей [8, 9]. При ИГХ-окрашивании первичными антителами к TNFα в основной группе было отмечено умеренное мембранное и цитоплазматическое окрашивание цито- и синцитиотрофобласта, цитоплазмы макрофагов и лимфоцитов, эпителия, а также синцитиальных узелков, являющихся зонами пролиферации трофобласта, вневорсинчатого цитотрофобласта и децидуальных клеток. Выраженное окрашивание было отмечено в межворсинчатом плодном фибриноиде (рис. 4А–Г), что указывает на высокий уровень провоспалительных маркеров в плазме крови, по сравнению с плацентой. При оценке IL8 присутствовало более выраженное окрашивание в указанных структурах, прежде всего в СЦТ (рис. 5А–Е). Как известно, СЦТ образует гемоплацентарный барьер, создающий основную преграду для внедрения вируса. Экспрессия противовоспалительного цитокина IL4 была снижена в плаценте пациенток основной группы, страдающих СOVID-19 (рис. 6А–Г). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Таким образом, при новой коронавирусной инфекции наблюдается повышение синтеза провоспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов. Наиболее выраженное окрашивание имело место в депозитах плодного фибриноида. Следует отметить, что структуры плаценты, а не только клетки иммунной системы могут вырабатывать про- и противовоспалительные цитокины, в том числе при связывании с рецепторами врожденного иммунитета. Особо следует отметить, что если уровень провоспалительных маркеров был повышен в 5–10 раз в плазме («цитокиновый шторм»), то уровень их в плаценте был сопоставим с неосложненной беременностью. Наряду с этим, у пациенток с тяжелым и среднетяжелым течением СOVID-19 отмечалось повышение экспрессии в структурах плаценты провоспалительных факторов (TNFα, IL8) и снижение противовоспалительных (IL4).

Одна из важных причин нарушения кровотока в пуповине — формирование тромбов и сладжей в сосудах пуповины и хориона, или плодовая тромботическая васкулопатия [10, 11]. Гиперкапилляризация терминальных ворсин является компенсаторным механизмом при гипоксии, что связывают с повышением ангиогенных факторов, в том числе VEGF, способствующих росту новых сосудов. При наличии гиперкапилляризации терминальных ворсин выраженной степени (32–33 балла по шкале) [12] происходит перестройка ангиогенеза, что обусловливает замедление микроциркуляции и фетоплацентарного кровотока, ввиду этого агрегация тромбоцитов в просвете капилляров повышается, образуются микротромбы. Усиление этих процессов приводит к очаговому фиброзу стромы ворсин, и изменения, которые первоначально были направлены на компенсацию негативного влияния гипоксии, способствуют постепенному переходу в стадию декомпенсации. В нашем исследовании у пациенток основной группы умеренная и тяжелая степень гиперкапилляризации терминальных мембран встречалась значительно чаще, чем в группе сравнения. В результате исследования в основной группе по сравнению с контрольной нами отмечены более высокий процент инфарктов, наличие тромбозов хориальных сосудов, межворсинчатых и субамниотических гематом. Кроме механических факторов, причиной образования тромбов является нарушение реологических свойств крови с замедлением кровотока по сосудам, уменьшение диаметра сосудов, а также нарушения в системе свертывания крови — все это характерно для новой коронавирусной инфекции. Морфологические особенности состояния плаценты указывают на то, что острая гипоксия плода в родах развивалась в тех наблюдениях, когда в течение беременности в системе «мать–плацента–плод» имела место хроническая кислородная недостаточность или воздействовал другой повреждающий фактор [13, 14]. В результате происходила перестройка ворсинчатого дерева и развивалась субклиническая плацентарная недостаточность. Воздействие дополнительных триггерных факторов в родах (сократительная активность матки, сдавление пуповины и др.) вызывало декомпенсацию с развитием клинической картины острой гипоксии плода.

При оценке данных ИГХ-исследования не было отмечено значимого повышения провоспалительных маркеров на фоне снижения противовоспалительных при тяжелой и среднетяжелой инфекции.

ВЫВОДЫ

В связи с достижениями иммунологии и расширением представлений о механизмах врожденного и приобретенного иммунитета в последнее десятилетие все больший интерес вызывает изучение индивидуальных различий иммунного ответа при инфекционно-воспалительных заболеваниях. Наиболее продуктивны в этом плане исследования различий реакции иммунной системы у особей с преобладанием Тh1 или Тh2-типа иммунного ответа, который во многом определяет клиникоморфологические и иммунологические особенности воспалительного процесса. Таким образом, беременность можно рассматривать как фактор, способствующий более благоприятному течению COVID-19. Выявленный в нашем исследовании более высокий процент гипоксии в родах может быть связан с нарушениями в системе свертывания крови и быть следствием более высокого процента тромбозов хориальных сосудов, наличия межворсинчатых и субамниотических, ретрохориальных гематом, а также инфарктов ворсинчатого дерева. Плацента представляет собой «подушку безопасности» для плода, и при отсутствии повреждения гемоплацентарного барьера плод защищен от COVID-19. Однако в определенных условиях при «прорыве» гемоплацентарного барьера новая коронавирусная инфекция может быть опасна для плода, вызывая изменения по типу «цитокинового шторма». Плацента максимально снижет нагрузку на плод. Подавляющее большинство детей рождается здоровыми и уровень провоспалительных цитокинов в плаценте сопоставим с его уровнем в группе сравнения. Неповрежденная плацента и гемоплацентарный барьер защищают будущего ребенка от инфекции, а влияние на развитие ребенка минимально. Учитывая более высокий процент гипоксии в родах у детей от матерей, заболевших COVID-19, следует выбирать акушерскую тактику индивидуально с учетом факторов риска и проведением в родах непрерывной кардиотокографии плода. Целесообразно выполнять ИГХ-исследование образцов плаценты родильниц с подозрением на перенесенную новую коронавирусную инфекцию, с первичными антителами к вирусу SarsCoV-2, для уточнения тактики ведения новорожденного и прогноза возможных неонатальных осложнений.