На сегодняшний день установлено, что такие распространенные осложнения беременности, как задержка роста плода (ЗРП) и преэклампсия (ПЭ), связаны с дисфункцией плаценты. При этих патологиях метаболическая и кровеносная система не способны адаптироваться к изменениям в период беременности, что приводит к гипертонии и нарушению плацентарного кровотока. Это не только вызывает нежелательные последствия для здоровья матери и ребенка в период гестации, но и может повлиять на их будущее здоровье. В последние годы в странах с развитой экономикой от 10 до 20% беременностей осложняются той или иной формой гипертонии [1]. ПЭ — это осложнение беременности, возникающее в плаценте и негативно влияющее как на мать, так и на плод. ПЭ выявляют у 5–7% беременных во всем мире [2]. Это состояние может возникнуть после 20-й недели беременности и характеризуется гипертонией, протеинурией и отеками, что вызывает в дальнейшем угнетение плода и препятствует положительному исходу беременности. ЗРП выражается в недостижении плодом своего потенциала роста, когда вес и индекс массы тела (ИМТ) новорожденного не соответствуют норме для определенного числа гестационных недель. ЗРП происходит примерно у 4–8% новорожденных в промышленно развитых странах и 6–30% — в развивающихся странах [3, 4]. Причины ЗРП подразделяют на внутренние, присущие плоду или плаценте, и внешние, такие как материнские факторы, воздействующие преимущественно на плаценту и плод, или на внутренние и внешние вместе.

На сегодняшний день отсутствуют адекватные способы прогнозирования данных осложнений беременности, поэтому очевидна необходимость разработки неинвазивных и объективных методов пренатальной диагностики и мониторинга.

Постгеномные омикс-технологии, в том числе метаболомика и липидомика, в настоящее время переживают фазу бурного роста и все более активно внедряются в клиническую практику. Применительно к рассматриваемым в данной работе патологиям были обнаружены значительные изменения уровней метаболитов еще до клинического проявления преэклампсии, и эти изменения усиливаются по мере прогрессирования расстройства [5–7]. Метаболомика может быть использована для обнаружения особенностей этих состояний на молекулярном уровне и способствовать выявлению биологических механизмов, лежащих в их основе, а также обнаружению новых биомаркеров. Метаболомика имеет также уникальные возможности для выявления различных эндотипов патологических состояний [7, 8] и для диагностики различных осложнений беременности. Похожие наблюдения были сделаны и для ЗРП [9]. В упомянутых работах проводили анализ метаболома крови. Забор крови является инвазивным способом получения биологического материала. В данной работе рассмотрена возможность использования отделяемого цервикального канала для достижения неинвазивности процедуры прогнозирования развития ПЭ или ЗРП.

На сегодняшний день поиск неинвазивных и малоинвазивных маркеров диагностики в акушерстве является перспективным направлением научного поиска. Одним из потенциальных локусов малоинвазивного забора биологического материала выступает цервикальный канал. Описаны потенциальные биомаркеры самопроизвольных преждевременных родов, которые были идентифицированы с помощью целенаправленного протеомного анализа образцов цервико-вагинальной жидкости от бессимптомных женщин из группы высокого риска. Белки в образцах цервико-вагинальной жидкости от пациенток со спонтанными преждевременными родами относятся к белкам внеклеточного матрикса и / или регулируют физиологию клеточных мембран [10]. В 2020 г. в группе женщин с преждевременными родами и преждевременным разрывом плодных оболочек обнаружено достоверно значимое различие уровня цитокинов из образцов цервико-вагинальной жидкости, особенно IL6 и IL17α. Данные показатели могут быть более точными прогностическими маркерами преждевременных родов, чем фетальный фибронектин, используемый в клинической практике на сегодняшний день [11]. Во время беременности дисбактериоз микробиоты влагалища напрямую влияет на метаболические профили, что может вызвать преждевременные роды. В 2020 г. был проведен анализ метаболического профиля цервико-вагинальной жидкости с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса и определены метаболические маркеры для прогнозирования преждевременных родов. Анализ ROCкривой показал, что ацетон, этиленгликоль, формиат, гликолят, изопропанол, метанол и триметиламиноксид имели лучшие прогностические значения для преждевременных родов. Эти метаболиты могут быть полезными маркерами для клинического применения и прогноза преждевременных родов [12]. Таким образом, на сегодняшний день доказано, что цервико-вагинальная жидкость, являющаяся частью системы «мать–плацента– плод», содержит целый ряд биологически активных компонентов, которые потенциально можно использовать для предикции и диагностики акушерской патологии.

Для выявления и валидации биомаркеров в метаболомных исследованиях используют широкий спектр аналитических методов: ультрафиолетовую и инфракрасную спектроскопию, спектроскопию ядерного магнитного резонанса, электрофорез, — но наибольшее распространение получили метаболомные платформы на базе жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ЖХ-МС).

Использование метаболомики в исследованиях акушерских синдромов, ассоциированных с плацентарной недостаточностью (ПЭ и ЗРП), имеют на сегодняшний день большой потенциал для понимания патогенеза данных осложнений беременности и разработки новых диагностических и прогностических подходов.

Целью исследования стал поиск различий липидома отделяемого цервикального канала пациенток с нормально протекающей беременностью и пациенток с задержкой роста плода и преэклампсией, а также разработка математических моделей на базе найденных различий для создания неинвазивных методов антенатальной диагностики ПЭ и ЗРП.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование «случай-контроль» было проведено в Национальном  медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова (Россия) в период с января по декабрь 2020 г. В нем участвовали 57 беременных женщин, проходящих обследование и родоразрешенных за это время в отделениях Центра. Беременные были разделены на три группы: I группа включала в себя 18 пациенток с преэклампсией, II группа — 19 пациенток с задержкой роста плода, III группа — 20 беременных женщин без данных осложнений, условно здоровых (группа контроля). Критерии включения в группу I:  повышение после 20-й недели беременности САД  ≥ 140  мм  рт.  ст.  и/или  ДАД ≥ 90  мм  рт.  ст.  независимо  от  уровня  АД  в  анамнезе  в сочетании  с  протеинурией  ≥ 0,3  г  в  сутки  или  ≥  0,3  г/л  в двух  порциях  мочи,  взятых  с интервалом в 6 ч. Критерии включения в группу II: диагноз ЗРП, выставленный по данным УЗ-исследования, если было отмечено замедление показателей прироста предполагаемой массы плода (ПМП) и/или окружности живота (ОЖ) < 10-го процентиля в сочетании с патологическим кровотоком по данным УЗ-допплерографии либо значения ПМП и/или ОЖ < 3-го процентиля. Критерии исключения: многоплодная беременность, патология шейки матки, сахарный диабет, нарушение почечных функций, хроническая артериальная гипертензия, онкологические и инфекционновоспалительные заболевания во время данной беременности. Случаи сочетания ПЭ и ЗРП не вошли в данное исследование. Всех пациенток родоразрешали путем операции кесарева сечения.

Сбор и подготовка образцов

У всех беременных женщин, вошедших в исследование, в день госпитализации проводили забор цервиковагинального отделяемого до проведения влагалищного исследования. Для исключения инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта проводили забор отделяемого влагалища на микробиологическое исследование и мазок на степень чистоты влагалища. В среднем забор проходил за 10–14 дней до родоразрешения.

Забор цервико-вагинального отделяемого проводили с использованием одноразового влагалищного подъемника и стерильных одноразовых цитощеток. После введения подъемника и визуальной идентификации наружного канала шейки матки, в цервикальный канал на глубину 0,5 см вводили цитощетку и после вращательного движения по часовой стрелке извлекали таким образом, чтобы избежать контакта со стенками влагалища и наружными половыми органами. После забора образцы охлаждали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °С.

Перед анализом образцы подвергали жидкостножидкостной экстракции для получения липидной фракции. Для этого в пробирку с цервикальной щеткой добавляли 500 мкл раствора H₂O / метанол (1 : 1), после чего образец тщательно перемешивали в течение 5 мин и обрабатывали ультразвуком в течение еще 5 мин. После этого цервикальную щетку извлекали из пробирки, добавляли 1 мл хлороформа и перемешивали в течение 10 мин. Затем центрифугировали 5 мин при 13 000 G при температуре окружающей среды, отбирали 925 мкл нижнего слоя, высушивали в потоке азота и повторно растворяли в 200 мкл раствора изопропанол / ацетонитрил (1 : 1) для последующего анализа.

Масс-спектрометрический анализ экстрактов липидов

Липидные экстракты анализировали на жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific; Германия), соединенном с масс-анализатором MaXis Impact qTOF с электрораспылительным источником ионизации (Bruker Daltonics; Германия). Разделение образцов осуществляли методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Zorbax C18 (150 × 2,1 мм, 5 мкм; Agilent, США) с линейным градиентом от 30 до 90% элюента В за 20 мин. В качестве элюента А использовали раствор ацетонитрил / вода в объемном соотношении 60 : 40 с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония, в качестве элюента В — раствор изопропанол / ацетонитрил / вода (90 : 8 : 2), с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония. Скорость потока элюирования была равна 40 мкл/мин, объем инжектируемого образца — 3 мкл. Масс-спектры получали в режиме положительных и отрицательных ионов в диапазоне m/z 100–1700 Да со следующими установками: напряжение на капилляре составляло 4,1 кВ в режиме положительных ионов и — 3,2 кВ в режиме отрицательных ионов, давление распыляющего газа — 0,7 бар, скорость потока осушающего газа — 6 л/мин, температура осушающего газа — 200 °C.

Исходные масс-спектрометрические данные обрабатывали с помощью программы msConvert из пакета Proteowizard 3.0.9987 [13], MzMine [14], Идентификацию липидов производили средствами скриптов LipidMatch [15] по точной массе и по характерным тандемным масс-спектрам (МС / МС). Номенклатура липидов соответствует LipidMaps [16].

Статистический анализ

Для статистической обработки результатов использовали скрипты, написанные на языке R версии 3.3.3 [17], и программу RStudio 1.383 [18].

Соответствие анализируемых параметров закону нормального распределения оценивали по значениям теста Шапиро–Уилка. Статистический анализ проводили с помощью теста Стьюдента при нормальном распределении исследуемой величины или теста Манна–Уитни при парном сравнении в случае, когда распределение не соответствовало закону нормального распределения. Для описания количественных данных, имеющих нормальное распределение, использовали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (SD) в формате М (SD). При распределении признаков с распределением, отличающимся от нормального, их описывали в виде медианы (Me) и квартилей Q₁ и Q₃ в формате Me (Q₁; Q₃). Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.

Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании исследуемых параметров были разработаны модели логистической регрессии. В качестве независимых переменных в моделях рассматривали липиды со статистически значимой разницей уровней между исследуемыми группами. Выбор переменных осуществляли на основе критерия AIC (информационного критерия Акаике) [19]. Производили поэтапный отбор переменных, пока это приводило к увеличению AIC. Качество полученной диагностической модели тестировали внутренней кросс-валидацией с контролем по отдельным объектам. Для оценки использовали значения площади под операционной кривой, чувствительность и специфичность. В качестве зависимой переменной выступала принадлежность пациентки к группе. Для каждой модели были определены критерий Вальда, 95%-й доверительный интервал (ДИ), отношение шансов (ОШ) и его доверительный интервал. Качество разработанных моделей определяли путем построения ROC-кривой, определения площади под ROC-кривой, а также расчета чувствительности и специфичности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты анализа клинических параметров исследуемых групп представлены в табл. 1.

Было выявлено, что ИМТ беременных женщин из группы ЗРП статистически значимо ниже, чем у женщин групп «норма» и «преэклампсия» (р = 0,005 и р = 0,0045 соответственно).

Все женщины были родоразрешены в III триместре беременности. Срок родоразрешения для групп с ПЭ и ЗРП значимо отличался от контрольной группы (р < 0,001), что объясняется необходимостью ускоренного родоразрешения по акушерским показаниям. Частота преждевременного родоразрешения в группе ПЭ составила 33,3% (шесть случаев), а ЗРП — 31,6% (шесть случаев).

Средний вес новорожденных в контрольной группе составил 3493,6 г по сравнению с 2341 г и 2128,7 г для случаев ПЭ и ЗРП соответственно (р ≤ 0,001).

Следует отметить, что оценка новорожденного по шкале Апгар в группе с ПЭ была значимо ниже на первой минуте жизни (р = 0,04), тогда как в группе ЗРП — на пятой минуте (р = 0,05), по сравнению с группой контроля. Вероятно, это обусловлено истощением компенсаторных механизмов и тяжелой адаптации в раннем неонатальном периоде у новорожденных, длительный период пребывающих в условиях хронической гипоксии и отставания роста. У одного ребенка выявлена асфиксия средней степени тяжести при рождении, потребовавшая дополнительной респираторной поддержки.

Анализ липидного состава отделяемого цервикального канала осуществляли с помощью ЖХ-МС. МС проводили как в режиме положительных, так и в режиме отрицательных ионов, поскольку такой подход позволяет расширить охват зарегистрированных и идентифицированных липидов. В результате ЖХ-МС-анализа было идентифицировано 129 липидов в режиме положительных ионов и 110 соединений липидов в режиме отрицательных ионов. Сравнение относительных уровней липидов между исследуемыми группами позволило выявить 10 липидов со статистически значимой разницей между группами нормы и ЗРП в режиме положительных ионов и семь липидов в режиме отрицательных ионов (рис. 1). При сравнении группы нормы и ПЭ были найдены один липид со статистически значимой разницей уровней в режиме положительных ионов и два липида в режиме отрицательных ионов (рис. 2). Между группами ПЭ и ЗРП статистически значимую разницу в уровнях имели два липида (рис. 3). Липиды относились преимущественно к классам оксилипидов (окситриглицеридов и оксикардиолипинов), сфингомиелинов, триглицеридов и кардиолипинов.

На основе полученных данных были построены модели логистической регрессии для определения пациенток, у которых может развиться ЗРП или ПЭ по липидам отделяемого цервикального канала (табл. 2). Для оценки качества разработанных моделей был выполнен ROCанализ, результаты которого представлены в табл. 3 и на рис. 4, рис. 5. Наилучшими параметрами характеризовались модели для классификации ЗРП / Норма, построенные по данным, полученным как в режиме положительных, так и в режиме отрицательных ионов. AUC составили 0,70 и 0,85 соответственно. Модель для классификации по группам ПЭ / Норма имела достаточно высокое значение специфичности (0,91), но низкую чувствительность (0,30). Таким образом, из рассмотренных в данной работе акушерских патологий ЗРП и ПЭ, неинвазивный подход анализа липидного профиля отделяемого цервикального канала представляется более перспективным для диагностики ЗРП. Применимость описанного подхода для диагностики ПЭ требует дополнительного исследования. Для дальнейшего усовершенствования и валидации могут быть рассмотрены модели ЗРП / Норма и ЗРП / ПЭ, построенные по данным МС в режиме отрицательных и положительных ионов соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенного нами анализа идентифицировано 129 липидов в режиме положительных ионов и 110 соединений липидов в режиме отрицательных ионов, относящихся к простым липидам глицеридам и к сложным липидам, в свою очередь делящимся на глицерофосфолипиды и сфинголипиды. Эта обширная группа природных органических соединений, включающая жиры и жироподобные вещества, необходима для построения клеточных мембран и регуляции обмена веществ и имеет несомненный интерес в исследовании ее изменения в акушерской патологии и особенно детекции колебания ее уровня на границе системы «мать–плацента– плод». Жирные кислоты и липиды во время эмбрионального периода играют первостепенную роль в росте и развитии. Дисбаланс потребления жирных кислот в перинатальном периоде изменяет состав жирных кислот мембранных фосфолипидов плода, что может вызвать структурные и функциональные проблемы в его клетках. Кроме того, метаболическая и нейроэндокринная среда плода и новорожденного играет ключевую роль в регулировании энергетического баланса. Дисбаланс жирных кислот и липидов во время беременности может привести к необратимым изменениям в контроле нейроэндокринной функции и энергетическом обмене у плода, что приведет к метаболическому программированию. Таким образом, детекция уровня липидов позволяет зафиксировать нарушения в работе «мать–плацента–плод» еще на доклиническом этапе [20]. Показано, что метаболический путь сфинголипидов играет критическую роль в толерантности плода и матери, регулируя врожденный иммунитет на границе раздела между плодами и матерями как в экспериментах с животными, так и у людей, и может дать новое понимание разработки терапевтических стратегий лечения акушерских осложнений [21].

Во время беременности метаболические изменения происходят во всех системах организма женщины, в том числе и в липидном обмене. Холестерин и свободные жирные кислоты необходимы для клеточного синтеза эмбриональных мембран. Плод синтезирует липиды и широко использует материнские, хотя свободный трансплацентарный транспорт материнских липопротеинов ограничен «плацентарным барьером» [22]. Фосфолипиды и триацилглицерины (ТАГ) из организма матери не проникают напрямую к плоду. Существует ряд механизмов транспорта жирных кислот на территорию плода, которые задействуют способность связывать жирные кислоты [23] и интенсивно транспортировать их через плаценту. Циркулирующие липиды имеют разнообразное влияние на функцию эндотелиальных клеток. Дислипидемия часто связана с дисфункцией этих клеток [24]. Исследования показали зависимую от концентрации связь между повышенным уровнем ТАГ и риском ПЭ. Корреляцию между дислипидемией и ПЭ можно объяснить множеством механизмов. Например, увеличение таких липидных фракций, как ТАГ, ведет к их накоплению в эндотелиальных клетках и уменьшению выработки простациклина, что впоследствии приводит к эндотелиальной дисфункции [25]. В нашем исследовании уровень TG 18:1_24:0_24:1, CL 16:0_16:1_22:6_22:6, PC O-22:1/18:1 имели достоверно значимые различия в группе «ПЭ», по сравнению с группой «Норма» (р = 0,008, р = 0,02, р = 0,04 соответственно). При построении диагностической модели ПЭ / Норма достигнута специфичность 0,91 (порог отсечки — 0,10; AUC — 0,67).

При синдроме ЗРП на фоне нарушений структуры и функции плаценты мы видим проявления проблемы на территории плода и не отмечаем их в организме матери. В ряде исследований [26, 27] было установлено, что при беременности, осложненной ЗРП, происходит снижение содержания уровня липидов в пуповинной крови и крови матери, а также уменьшение числа их рецепторов. Снижение уровня липидов и их рецепторов в фето-плацентарном комплексе, вероятно, будет иметь весьма серьезные последствия для нормального роста и развития плода, так как они не будут способны в достаточной мере обеспечивать транспорт холестерина и нормальное функционирование плаценты и гармоничный рост плода.  В нашей работе уровни 17 липидов (табл. 2) имели достоверно значимые различия в группе «ЗРП», по сравнению с группой «Норма» (р < 0,05). При построении диагностической модели ЗРП / Норма достигнута чувствительность 0,81, специфичность 0,91 (порог отсечки — 0,50; AUC — 0,85).

Особый интерес представляет достоверно значимое различие полученных результатов образцов цервиковагинального отделяемого среди групп пациенток с ЗРП и ПЭ (р = 0,04). Это наглядно демонстрирует существующие патогенетические различия данных осложнений беременности, изначально объединенных общей идеей плацентарной дисфункции.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного нами исследования наглядно продемонстрирована возможность использования цервико-вагинальной жидкости в комплексном диагностическом мониторинге беременных с плацентаассоциированными акушерскими осложнениями. Выполнен углубленный клинико-анамнестический и масс-спектрометрический анализ данных, полученных от 57 беременных женщин. При изучении отделяемого цервикального канала беременных с ЗРП и ПЭ было идентифицировано 129 соединений липидов в режиме положительных ионов и 110 соединений липидов в режиме отрицательных ионов. В нашем исследовании уровень ряда липидов имел достоверно значимые различия в группах «ПЭ» и «ЗРП» по сравнению с группой «Норма». Это наблюдение может указывать на существующие различия в цепи биологических процессов патогенеза данных осложнений беременности, объединенных общей идеей плацентарной дисфункции и в результате дальнейших исследований в данном направлении выявить новые подходы к разработке таргетных путей терапии «больших акушерских синдромов». Липиды относились преимущественно к классам оксилипидов (окситриглицеридов и оксикардиолипинов), сфингомиелинов, триглицеридов и кардиолипинов, что позволяет использовать данный метод в комплексе предиктивных мероприятий. На основании выявленных различий были созданы модели логистической регрессии, которые могут быть перспективными для разработки методов неинвазивной диагностики данных заболеваний.

В результате проведенного нами исследования продемонстрирована возможность использования неинвазивного метода определения уровня липидов в цервико-вагинальной жидкости в комплексном диагностическом мониторинге беременных с плацентаассоциированными акушерскими осложнениями.