Боль в спине (БС) — одна из основных причин инвалидизации пациентов в развитых странах мира, вызывающая стойкую потерю трудоспособности. БС встречается во всех возрастных группах. Так, по данным польского исследования, у 85% мужчин и 86% женщин с дебютом БС в 14-летнем возрасте в течение 34 последующих лет БС носила рецидивирующий характер [1]. Одним из прогностически неблагоприятных вариантов БС является дегенеративная болезнь диска (ДБД), в основе которой лежат процессы деградации и воспаления в ткани межпозвонкового диска (МПД) [2]. ДБД — хроническое состояние с тенденцией к прогрессированию. Несмотря на то что до сих пор нет однозначных критериев разграничения «естественного» физиологического старения диска и патологической дегенерации, встречающейся и у молодых лиц, термин ДБД используют и клиницисты, и патоморфологи для обозначения дезинтеграции межклеточного матрикса диска с нарушением гомеостаза и индукцией воспалительной активности в пространстве диска [3]. Клинически проявления ДБД хорошо изучены: это БС механического характера, связанная с осевой нагрузкой (усиливается при физической нагрузке, переносе груза, сгибании, уменьшается в покое) и/или со стенозом позвоночного канала, радикулопатией, реже —  с миелопатией. ДБД является одной из причин хронической нестабильности позвонководвигательных сегментов (ПДС) и ранней инвалидизации пациентов трудоспособного возраста. Исследования показали, что дегенерация МПД является многофакторным процессом, включающим апоптоз, воспаление, старение и биомеханические нарушения [4]. В последнее время большое внимание уделяют изучению влияния воспалительных цитокинов на развитие ДБД, дисбалансу провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [5].

Показано, что воспалительный паттерн запускает катаболические процессы в матриксе хряща скомпрометированного ПДС, дальнейшую дегенерацию экстрацеллюлярного матрикса и дегидратацию пульпозного ядра (ПЯ) и фиброзного кольца (ФК) [5, 6]. Потеря структурной целостности диска и микротрещины ФК являются причиной пролабирования содержимого ПЯ в ткань ФК и за его пределы с формированием протрузий, экструзий и секвестров. В литературе обсуждается роль TNFα, IL1β, гиперэкспрессия IL6 и моноцитов CD16 в возникновении и прогрессировании дегенеративных изменений. Важно отметить, что экспрессия цитокинов может коррелировать с тяжестью дегенерации МПД. Роль IL6 в дегенерации диска и формировании грыжи изучена во многих работах [7]. Гипотеза об участии IL6 в дегенерации МПД человека была подтверждена тем, что при усилении экспрессии IL6 повышается представленность транскриптов катаболических генов и подавляется экспрессия генов протеогликанов [8]. Изучение роли IL17  в воспалительном каскаде при ДБД показало, что воздействие на человеческие NP-клетки IL17 и TNFα способствовало увеличению высвобождения IL6 in vitro и экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 на поверхности клеток ПЯ и ФК [9]. Установлена ассоциация между интенсивностью болевого синдрома, грыжей МПД и воспалительным ответом. Указанные биомаркеры было предложено рассматривать в качестве предполагаемых потенциальных маркеров начала, интенсивности и прогрессирования заболевания.

Продемонстрирована возможность определения биомаркеров воспаления в сыворотке крови для идентификации процессов дегенерации и воспаления в ткани МПД у больных с ДБД [7, 10]. Для разработки подходов к репаративной терапии ДБД были изучены молекулярные механизмы дегенерации и воспаления непосредственно в ткани самого диска [3]. IL1β, TNFα, VEGF были верифицированы иммуногистохимическим методом у лиц разного возраста без симптомов БС [11], уровень их экспрессии в ткани диска практически не различался между группами молодых и пожилых лиц в отсутствии симптомов заболевания. Соответственно, измерение уровня цитокинов поврежденного диска является важной задачей с точки зрения поиска патогенетически обоснованной противовоспалительной и репаративной терапии. Недавно была продемонстрирована роль фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF, VFA) в васкуляризации ткани диска (в норме являющегося аваскулярной структурой) на всех стадиях дегенерации МПД. Активность VEGF реализуется путем регуляции экспрессии растворимого рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (soluble vascular endothelial growth factor receptor 1) [12].

Японские исследователи, изучая механизм резорбции грыжи у больных ДБД (подтвержденный данными МРТ), проанализировали цепочку взаимодействий TNFα– VEGF–MMP (matrix metalloproteinases MMP-3 и MMP-7, участвующих в деградации белков экстрацеллюлярного матрикса МПД — аггрекана и коллагена) и установили, что уровень экспрессии мРНК и белка VEGF был повышен в ситуации контакта макрофагов с тканью диска человека in vitro и напрямую зависит от уровня экспрессии TNFα [13]. Таким образом, было показано, что неоваскуляризация способствует «обратному развитию» межпозвоночной грыжи. Процесс врастания капилляров в ткань МПД был подтвержден при помощи магнитно-резонансной томографии (МРТ) с использованием гадолиния и может служить дополнительным критерием резорбции экструзии [14].

Взаимосвязь маркеров асептического воспаления и репарации МПД в ткани диска и их представленность в периферической крови у пациентов молодого возраста с продвинутой стадией ДБД до конца не определена. Имеются различные данные о преимущественной роли того или иного цитокина в изменении иммунологического гомеостаза МПД. Изучение профиля цитокинов (в сочетании с особенностями поражения ПДС) позволит выделить иммунные фенотипы пациентов для разработки биологических мишеней терапии и прогноза заболевания. Цель исследования заключалась в определении профиля наиболее значимых биомаркеров воспалительного повреждения (TNFα, IL6, IL17, IL1β)  и ангиогенеза (изоформ фактора роста эндотелия сосудов А —  VEGF121, VEGF165 и VEGF189) в хрящевой ткани МПД и в лейкоцитах крови больных молодого возраста с ДБД, подвергшихся дискэктомии, в сравнении с контрольной группой.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на базе нейрохирургического отделения ГКБ № 1 имени Н. И. Пирогова и кафедры факультетской терапии имени А. И. Нестерова РНИМУ имени Н. И. Пирогова в период с 2019 по 2021 г. В нем приняли участие 87 человек (40 мужчин и 48 женщин) молодого возраста (по классификации ВОЗ 2012 г. от 18 до 44 лет). Критерии включения в основную группу: молодые пациенты (мeдиана возраста — 37,01 лет [35,54–38,49]), страдающие БС, ассоциированной с ДБД, подтвержденной инструментальными данными (МРТ) (таблица). Критерии исключения: травма позвоночника на момент исследования и в анамнезе, опухолевое, инфекционное поражение позвоночника и других органов, воспалительные спондилоартриты, хирургические вмешательства в предшествующие 30 дней. Всем лицам основной группы было проведено оперативное вмешательство (микродискэктомия) по поводу грыжи МПД на соответствующем уровне в поясничном отделе позвоночника. Интенсивность болевого синдрома измеряли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) в миллиметрах. Степень функциональных ограничений в поясничном отделе позвоночника оценивали согласно индексу BAI (Backache-Index) [15]. Контрольную группу представляли здоровые добровольцы без БС (20 человек), сопоставимые по полу и возрасту. Всем больным до оперативного вмешательства и лицам группы контроля выполняли МРТ поясничного отдела позвоночника. Дегенерацию МПД оценивали на основании снижения интенсивности сигнала МПД, сужения дискового пространства, изменения структуры диска и потери границы между пульпозным ядром (ПЯ) и фиброзным кольцом (ФК). Стадии дегенерации МПД оценивали согласно классификации C. W. Pfirmann 2001 г. (стадии дегенерации 1–5). Стадии 3, 4 и 5 рассматривали как необратимые в отношении повреждения диска, а стадии 4 и 5 трактовали как тяжелые стадии ДБД.

Фрагменты дегенерированных МПД были получены во время дискэктомии. Микрочастицы МПД размером менее 1 мм³ сразу погружали в стабилизирующий раствор IntactRNA (нетоксичный водный фиксатор, предназначенный для быстрой стабилизации клеточной РНК в тканях и клеточных культурах, не нарушающий целостность клеток), образцам ткани диска присваивали штрих-код, идентичный штрих-коду образцов крови пациента. Молекулярные маркеры, определяемые в образцах крови и хряща были идентичны, выбраны в соответствии с последними данными на основе обзорных статей и технической доступности лабораторной диагностики («ДНК-Технология»; Россия). Определяли уровни представленности мРНК исследуемых генов в клетках крови —  лейкоцитах, ткани МПД с помощью методов обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции, используя наборы реагентов («ДНКТехнология»; Россия). Реакцию амплификации проводили в детектирующем амплификаторе DTprime 4 («ДНК- Технология»; Россия).

Получение образцов ткани МПД (1 мм³): выделение РНК проводили, предварительно измельчая хрящевое волокно хирургическим лезвием (скальпель хирургический стерильный одноразовый производства Huaiyin Medikal Instruments Co. Ltd., China). После измельчения получали фрагмент размером 1 мм, который дополнительно измельчали растиранием конуса микроцентрифужной пробирки о дно чашки Петри до образования мельчайших частиц и налета. Затем в чашку вносили 320 мкл лизирующего раствора из набора «ПробаНК» («ДНК-Технология»; Россия). Содержимое чашки вместе с измельченным образцом переносили в микроцентрифужные пробирки «Эксиджен» (Эксиджен, Инк.; США), после чего перемешивали на вортексе «Mikrospin» FV-2400  (Biosan; Латвия) в течение 5 с и осаждали. Далее оставляли на лизис в течение 1 ч. Затем выделение РНК проводили набором «Проба-НК» («ДНК- Технология»; Россия) согласно инструкции производителя. Выделенную РНК в объеме 16,5 мкл немедленно использовали для постановки обратной транскрипции, которую проводили при температуре 40 °С в течение 30 мин с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95 °С в течение 5 мин. Полученный раствор кДНК либо сразу использовали для постановки количественной ПЦР, либо хранили при –20 °С. Амплификацию с регистрацией результатов в режиме «реального времени» осуществляли в объеме 35 мкл по следующей программе: 50 циклов 94 °С — 10 с, 64 °С — 20 с, 72 °С — 10 с. Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64 °С.

Забор крови в объеме 4 мл в одноразовые пробирки Vacutainer с ЭДТА (BectonDickinson; США) проводили за сутки до оперативного вмешательства, далее кровь подвергали обработке для выделения лейкоцитов. Для получения лейкоцитарного кольца использовали набор «Проба-Фиколл» для выделения лимфоцитов из цельной крови. Выделение РНК производили набором «Проба-НК» («ДНК-Технология»; Россия) согласно инструкции производителя. Выделенную РНК в объеме 16,5 мкл немедленно использовали для постановки реакции обратной транскрипции при 40 °С в течение 30 мин с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95 °С в течение 5 мин. Полученный раствор кДНК либо сразу использовали для постановки количественной ПЦР, либо хранили при температуре –20 °С. Амплификацию с регистрацией результатов в режиме «реального времени» осуществляли в объеме 35 мкл по следующей программе: 50 циклов 94 °С — 10 с, 64 °С — 20 с, 72 °С — 10 с. Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64 °С.

Исследуемые гены включали TNFα, IL6, IL17, IL1β, изоформы фактора роста эндотелия сосудов А (VEGF121, VEGF165, VEGF189). Нормировочные гены представлены β2-микроглобулином (B2m), β-глюкуронидазой (GUSB). Нормировочные значения для мРНК каждого гена рассчитывали с помощью метода ΔΔCt [16]. Уровень экспрессии мРНК генов выражали в условных единицах относительно нормировочных генов (B2m, GUSB), которые имеют относительно устойчивый уровень экспрессии.

Статистический анализ

Для оценки статистической значимости полученных различий использовали метод непараметрической статистики (U-критерий Манна–Уитни). Количественные показатели проверяли на соответствие нормальному закону распределения с помощью критерия Шапиро– Уилка. Сравнение качественных показателей осуществляли с помощью критерия хи-квадрат и двухстороннего критерия Фишера для малых выборок. Различие групп считали достоверным при p < 0,01 и p < 0,05. Анализ данных выполняли с помощью программы Statistica v 8.0 и  SPSS v.10 и Graph Pad Prism.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-инструментальная характеристика пациентов

Клиническая характеристика молодых пациентов с БС представлена в таблица. Среднее значение интенсивности боли соответствовало 68 мм [48,0–88,0]. Острое течение болевого синдрома (не более 12 недель) имели 18% больных, хроническое — 82%. Средняя продолжительность заболевания у последних составила 5 лет [2,0–10,0]. У 82% больных отмечена средняя и тяжелая степени функциональных нарушений согласно индексу BAI. Результаты МРТ поясничного отдела позвоночника продемонстрировали значительное сужение межпозвонкового пространства, исчезновение границы между ПЯ и ФК и снижение интенсивности сигнала от ПЯ. На уровне оперируемого диска стадия дегенерации МПД по Pfirrmann соответствовала 4-й и 5-й стадиям у 66% и 33% пациентов основной группы соответственно. Грыжи локализовались на уровнях L4–L5, L5–S1 в соотношении 36 и 64% соответственно. У 70% больных при МР-визуализации на уровне оперируемого диска были выявлены изменения интенсивности МР-сигнала от костного мозга в Т2-взвешенном изображении и режиме подавления жировой ткани (STIR), отражавшие почти в равном соотношении отек костного мозга — Modic I (45% больных) (рис. 1) и жировую дегенерацию — Modic II (55%). В группе контроля Modic-изменения были выявлены только у 1 (5%) пациента из 20, и они также были ассоциированы с тяжелой стадией ДБД и наличием грыжи МПД, имевшей бессимптомное течение. У 37 лиц (53,6%) основной группы по данным МРТ было выявлено сочетание грыжи МПД с эрозивным поражением замыкательных пластин прилежащих тел позвонков (ЗП) и наличием Modic-изменений. Такое «тройное сочетание» ассоциировалось с большей продолжительностью БС в годах, болью в утренние часы и персистирующим течением хронической боли без «светлых промежутков» (p < 0,05) по сравнению с пациентами без эрозивного поражения ЗП и/или Modic-изменений.  У пациентов основной группы среднее значение стадии ДБД по Pfirrmann и частота встречаемости Modic-изменений статистически значимо отличались от контрольной группы (4,4 и 2,8 для стадии ДБД, 70 и 5% для Modic; p < 0,01). Полученные данные подтверждают взаимосвязь Modic-изменений с наличием грыжи МПД и тяжелой стадией ДБД.

Представленность мРНК цитокинов и изоформ фактора роста эндотелия сосудов в ткани МПД

Из всего профиля мРНК исследуемых генов цитокинов и изоформ фактора роста эндотелия сосудов в хрящевой ткани экспрессия TNFα, IL17, VEGF121, VEGF165 была статистически значимо повышена (p < 0,01) по сравнению с контрольной группой (рис. 2).  Cопоставление уровня экспрессии мРНК всех исследуемых  генов основной группы со стадией дегенерации МПД по Pfirrmann выявило положительную корреляцию уровня экспрессии TNFα со стадией дегенерации МПД (r = 0,301; p < 0,05) (рис. 3).

Несмотря на то что уровень экспрессии мРНК IL1β не имел статистически значимых различий с группой контроля, представленность этого гена в ткани диска коррелировала с тяжестью его дегенерации (r = 0,37; p < 0,05) (рис. 4).

С точки зрения прогрессирования дезорганизации вещества МПД интересно было оценить маркеры васкуляризации хряща на 4-й и 5-й стадиях дегенерации МПД. Для факторов роста эндотелия сосудов была выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость уровня VEGF121 со стадией дегенерации МПД (r = –0,85; p < 0,001), что может свидетельствовать о снижении интенсивности ангиогенеза в диске на продвинутых стадиях ДБД.

Анализ представленности генов в клетках крови

Дальнейший анализ был направлен на определение мРНК цитокинов и ростовых факторов в лейкоцитах периферической крови. В нашем исследовании выявлено статистически значимое повышение уровня представленности генов интерлейкинов IL1β, IL6 (p < 0,01) (рис. 5). Анализ зависимости уровня экспрессии мРНК цитокина IL6 в периферичекой крови со стадией дегенерации МПД показал снижение уровня цитокина на последней стадии дегенерации диска по Pfir (r = –0,347; p < 0,05), свидетельствуя о его значимом вкладе в дегенерацию на более ранних стадиях.

Учитывая высокую частоту встречаемости реактивных изменений тел позвонков по типу Modic (70%) в основной группе, мы проанализировали взаимосвязь уровня экспрессии цитокинов с наличием Modic-изменений. Была выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость уровня IL6 в клетках крови со стадиями Modic-изменений I и II (r = –0,31; p < 0,05), что свидетельствует о повышенной экспрессии цитокина на стадии воспалительного отека костного мозга по сравнению со стадией жировой трансформации прилежащих тел позвонков. Было выявлено повышение уровня экспрессии IL17 в периферической крови у лиц с более тяжелым поражением позвонководвигательного сегмента — тройным сочетанием (грыжа + эрозия ЗП + Modic) (r = 0,401; p < 0,05) по сравнению с лицами при наличии только грыжи. Несмотря на низкий уровень представленности биомаркеров ангиогенеза в крови пациентов с БС, мы решили проследить, изменяется ли уровень экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (его изоформ 121, 165, 189) в зависимости от стадий дегенерации МПД: для всех трех изоформ была получена обратная, статистически значимая, корреляция (r = –0,44; –0,33 и –0,45  соответственно; p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение патофизиологии БС у молодых пациентов подтвердило наличие иммуновоспалительного звена в дегенерации диска. Высокие уровни экспрессии TNFα и рецепторов к TNFα, особенно в ткани ФК, были выявлены у пациентов с ДБД и в других работах [17, 18]. Именно этот цитокин описывается в экспериментах как выраженный индуктор деградации матрикса, особенно на ранних стадиях, по сравнению с другими медиаторами [19]. Выявленная нами  сопряженная экспрессия TNFα и IL17 обнаружена в двух работах китайских исследователей и подтверждена влиянием этанерцепта (ингибитор рецептора TNFα), которых способен блокировать весь воспалительный каскад в ткани ПЯ диска [20, 21]. Патогенетическая связь иммуного воспаления с васкуляризацией диска в нашей работе продемонстрирована в зарубежных работах на людях и на животных [22, 23].

Ассоциация повышенной экспрессии гена IL6 в периферической крови с изменениями Modic, а именно со стадией воспалительного отека костного мозга, продемонстрирована также в работе китайских исследователей, в которой уровень экспрессии  IL6 был значимо повышен  у пожилых пациентов с ДБД и Modic I в сравнении с Modic-изменениями II типа [24]. Выявленные изменения подтверждают факт развития реактивного асептического спондилита у пациентов с тяжелой ДБД. Выявление повышенной экспрессии IL17 у лиц с тройным вариантом поражения ПДС позволяет говорить о наличии неблагоприятного клинико-инструментального фенотипа БС с иммунологическим маркером на системном уровне.

Известно, что по классификации Pfirrmann 5-я стадия дегенерации МПД характеризуется резким снижением высоты МПД, низкоинтенсивным и неоднородным сигналом от ПЯ, что соответствует тяжелой, почти полной дегидратации ПЯ с дезинтеграцией межклеточного вещества и замещением центрального пространства диска коллагеном 1-го типа и стиранием границы между ПЯ и ФК [25]. Различая процесс естественной дегенерации диска, ассоциированной с возрастом, и патологической дегенерации, мы хотим подчеркнуть принципиальную роль воспалительных маркеров в развитии второго варианта, особенно ярко проявляющегося тяжелой степенью дегенерации у лиц молодого возраста [26]. К четвертому году жизни диск теряет кровеносные сосуды и капилляры и становится полностью аваскулярной структурой [27]. По мере развития «низкоиммунного» воспаления в ткани МПД неоваскуляризация является способом доставки иммуннокомпетентных клеток из системного кровотока в хрящевую ткань с последующей активацией катаболических процессов [28] и резорбции ткани выпавшего за пределы ФК фрагмента. Фактор роста эндотелия сосудов А (VEGF) является одним из основных регуляторов ангиогенеза. Он играет важную роль в процессе физиологической и патологической неоваскуляризации [29]. Стимуляцию экспрессии VEGF обеспечивает активность хондроцитов, находящихся в виде кластеров в ПЯ. При 5-й стадии ДБД диск полностью утрачивает ПЯ вместе со всем его клеточным содержимым, что, вероятнее всего, прерывает цепочку стимуляции ангиогенеза в этой ситуации. Эти данные не противоречат исследованию, показавшему, что уровни экспрессии ангиогенного фактора VEGF в слабодегенерированных образцах МПД были статистически значимо выше, чем на продвинутых стадиях дегенерации [12]. Учитывая низкие репаративные способности диска на 5-й стадии дегенерации, наиболее перспективно использование биоинженерной терапии с применением тканевой инженерии и восстановлением трехмерного каркаса МПД с последующим ведением клеточной терапии.

ВЫВОДЫ

Выполненное исследование помогает уточнить спектр активированных генов, экспрессирующих цитокины, и демонстрирует их воспалительный профиль в ткани МПД и периферической крови в зависимости от выраженности ДБД и распространенности поражения ПДС. Представленность мРНК изучаемых цитокинов и изоформ фактора роста эндотелия сосудов в ткани МПД (TNFα, IL17, VEGF121, VEGF165) была повышена для лиц с БС и ДБД. Уровень экспрессии фактора роста эндотелия сосудов, отражающий возможные процессы неоваскуляризации, показал резкий спад на последней стадии ДБД как в ткани МПД, так и в периферической крови, в то время как уровни цитокинов TNFα и IL1β в хрящевой ткани прямо коррелировали с тяжестью дегенерации МПД, что согласуется с теорией иммунного воспаления при ДБД. Уровни экспрессии гена IL6 в лейкоцитах крови оказались повышенными при Modic-изменениях и в большей степени ассоциировались с воспалительным отеком костного мозга прилежащих тел позвонков на уровне скомпрометированного сегмента, а уровни экспрессии IL17 —  повышенным при наличии грыжи в сочетании с эрозией ЗП и Modic-изменениями. Полученные результаты помогут определить молекулярные мишени и новые направления в противовоспалительной и репаративной терапии ДБД.