Измерение специфичных к SARS-CoV-2 антител является общепризнанным способом оценки иммунитета после вакцинации или перенесенного заболевания. Эффективность антител и их способность предотвращать повторное инфицирование зависят не только от их количества (титра), но и от качественных характеристик антител, включающих нейтрализующую активность и авидность. Эти свойства антител, вырабатываемых после вакцинации «Спутником V» или перенесения COVID-19, в настоящее время охарактеризованы недостаточно. Показано, что авидность (% высокоаффинных антител в крови) к SARS-CoV-2 коррелировала с временем от момента заболевания и с ростом титра вирус-нейтрализации [1]. Благоприятные клинические исходы у пациентов с COVID-19 были ассоциированы с высокой авидностью антител, но не с их количеством [2]. В настоящее время отсутствуют научные публикации о динамике созревания аффинности антител после вакцинации «Спутником V» и перенесенного COVID-19, а также об изменении функциональной активности антител в течение длительного периода наблюдения. Целью исследования было изучить долгосрочную динамику выработки антител у пациентов, перенесших COVID-19 и у вакцинированных «Спутником V» добровольцев, часть из которых после вакцинации перенесла инфекцию, и охарактеризовать особенности формирования продолжительной иммунологической памяти.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Участники исследования

В исследовании приняли участие 41 человек, которые были разделены на три группы (табл. 1). Возраст участников исследования находился в диапазоне 18–80 лет. Группа госпитализированных в стационар была набрана с ноября по декабрь 2020 г. из числа пациентов Первой московской инфекционной больницы (Москва); вакцинированные пациенты, потребовавшие госпитализации (медианное время с момента прохождения полного курса вакцинации до госпитализации составило 56 дней), были набраны там же в период с марта по апрель 2021 г. Здоровые добровольцы, вакцинированные «Спутником V», были отобраны в период с сентября по декабрь 2020 г. У 23 пациентов, госпитализированных в стационар г. Москвы с различной степенью тяжести заболевания, сыворотку крови брали дважды: при поступлении в больницу (острая фаза) и через 4–6 месяцев после выписки; забор крови у девяти вакцинированных пациентов  был произведен во время госпитализации, а у девяти здоровых вакцинированных добровольцев — в различные сроки после полной вакцинации. Медиана времени от наступления симптомов до первого забора крови составила 14 дней у невакцинированных пациентов и 10 дней у ранее вакцинированных. У вакцинированных добровольцев отсутствие COVID-19 было подтверждено отсутствием специфичных антител к белку нуклеокапсида (Nc) SARS-CoV-2.

Критерии включения для всех пациентов: диагноз COVID-19 был подтвержден методом ОТ-ПЦР на РНК вируса в назофарингеальных мазках либо по результатам КТ легких; тяжесть заболевания госпитализированных пациентов определяли в соответствии со шкалой NEWS [3]. Критерии включения вакцинированных пациентов: госпитализация в стационар участников с подтвержденным диагнозом COVID-19, получивших вторую дозу вакцины не менее чем за две недели до появления симптомов заболевания. Критерии включения здоровых добровольцев: наличие вакцинации двумя дозами «Спутника V» и отсутствие симптомов COVID-19 в течение двух недель перед взятием образцов. Критерии исключения: отказ от участия в исследовании.

Сбор и хранение образцов крови

Венозную кровь собирали в вакутейнеры с активатором свертывания и разделительным гелем и доставляли в лабораторию при +4 °С. Сыворотку отделяли центрифугированием в течение 10 мин со скоростью 3000 об./мин, аликвотировали и хранили при –30  °С до дальнейшего использования.

Определение IgG к нуклеокапсидному белку (Nc) и рецептор-связывающему домену шиповидного белка (S1 RBD) SARS-CoV-2

Измерение IgG к Nc и RBD проводили с помощью лабораторных тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА), результат выражали в виде индекса позитивности (ИП) в signal/cut-off (S/CO). Для проведения ИФА использовали рекомбинантный фрагмент рецепторсвязывающего домена (RBD) S1 шиповидного белка SARSCoV-2 (RBD № 8COV1, Хайтест; Россия), экспрессированный в эукариотических клетках, и рекомбинантный белок нуклеокапсида (Nc), экспрессированный в Escherichia coli и очищенный в нашей лаборатории. Для сорбции в 96-луночные ИФА-планшеты (Costar 2592, Corning; США) вносили по 100 мкл раствора 1 мкг/мл рекомбинантного белка в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали ночь при 4 °С. На следующий день планшеты блокировали 2 ч при комнатной температуре буфером с 0,5% казеина S002X (ХЕМА; Россия). Образцы исследуемых сывороток разводили в соотношении 1:100 в ИФА-дилюэнте S011 (ХЕМА; Россия). В качестве положительного контроля использовали сыворотки реконвалесцентов с диагнозом COVID-19, подтвержденным ОТ-ПЦР, а в качестве отрицательного — архивные образцы сывороток, собранные до 2020 г. ИФА-планшеты инкубировали 1 ч при 37 °С и трижды отмывали фосфатным буфером с 0,1% Твин-20. После отмывки в лунки вносили по 100 мкл раствора поликлональных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (ПХ) (Novex A18823; США) и инкубировали 1 час при 37 °С. Затем планшеты отмывали 6 раз и добавляли в лунки по 100 мкл раствора субстрата 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) (R055, ХЕМА; Россия). Через 10 мин останавливали реакцию, внося в лунки по 100 мкл 10% HCl. Оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 450 нм с помощью Multiscan FC (Thermo Scientific; США).

ИФА-нейтрализация (конкурентный ИФА)

Выявление IgG, нейтрализующих связывание RBD вируса c рецептором ACE2, проводили с помощью коммерческой тест-системы «SARS-CoV-2-ИФА-анти-RBD» (МТ-И-С1-04.192, МедипалТех; Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Для этого образцы исследуемых сывороток смешивали с биотинилированным рекомбинантным человеческим рецептором ACE-2 и вносили смесь в лунки ИФА-планшет, сорбированных рекомбинантным RBD. После инкубации и отмывки в лунки добавляли ПХ, конъюгированную со стрептавидином. Для визуализации реакции использовали субстратный раствор ТМБ. Оптическая плотность в лунках была обратно пропорциональна концентрации в образце антител, способных блокировать связывание ACE-2 с RBD. Коэффициент ингибирования (КИ) вычисляли по формуле КИ = (1 – ОПобр/ОПотр) × 100%, где ОПобр — ОП исследуемого образца, а ОПотр — ОП отрицательного контроля, не содержащего антител. Нейтрализующую способность антител считали высокой, если образец сыворотки ингибировал связывание RBD с АСЕ-2 более чем на 30%; промежуточной, если КИ составлял 20–30% и низкой для образцов с КИ менее 20%.

Измерение авидности антител

Авидность IgG, специфичных к RBD SARS-CoV-2, измеряли с помощью набора «SARS-CoV-2-ИФАIgG плюс» (МТ-И-С1-03.192, МедипалТех; Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Для этого образцы положительных сывороток в дубликатах вносили в лунки планшет, сорбированных RBD. После инкубации и отмывки в лунки вносили либо ФСБ (нативные условия), либо раствор мочевины (денатурирующие условия). Далее проводили реакцию как обычный непрямой ИФА. Индекс авидности (ИА), пропорциональный устойчивости антител к денатурации, рассчитывали как соотношение ОП при 450 нм в лунках с денатурирующим агентом (4М мочевина) и в контрольных лунках, содержащих ФСБ. Антитела в образцах с ИА >50% считали высокоавидными, с ИА между 40 и 50% — с переходной авидностью, с ИА <40% — низкоавидными.

Статистический анализ данных

Результаты измерений представлены в виде медианных значений с указанием диапазона минимум– максимум. Сравнение групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни, сравнение результатов, полученных для различных временных точек, проводили с помощью рангового критерия Уилкоксона. Статистически значимыми считали значения при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы нами были охарактеризованы антитела у трех исследуемых групп. Во всех образцах сывороток определяли наличие IgG к RBD и Nc SARS-CoV-2, а также уровень авидности и нейтрализующей способности IgG к RBD. Образцы 23 госпитализированных пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 продемонстрировали сходную динамику изменения уровня антител. Спустя две недели после появления симптомов все образцы были IgG-положительными как для RBD (медианный S/CO — 10,5; мин-макс — 1,1–13,3), так и для Nc (медианный 9,4; мин-макс 3,2–11,7) (рис. 1; табл. 2). Из 23 образцов 22 (95,6%) продемонстрировали высокую нейтрализующую активность в тесте на ингибирование связывания ACE2 с RBD и низкую авидность с медианой 20% (7,5; 37,3%) антител IgG против RBD. Только один образец в этой когорте имел уровень авидности 64,7%, вероятно, из-за предыдущего незарегистрированного контакта с вирусом. Как и ожидалось, эти результаты свидетельствуют о наличии не прошедших процесс созревания аффинитета вирусспецифичных IgG [4]. Для анализа длительности персистенции антител к SARSCoV-2 у пациентов, перенесших COVID-19, образцы крови были повторно собраны через 4–6 месяцев после выздоровления. Все образцы оставались положительными на анти-RBD- и анти-Nc-IgG (рис. 2; табл. 2). Медианные значения ИП для анти-RBD-IgG снизились с 10,5 до 6,8 S/CO, а для анти-Nc IgG — с 9,4 до 7,4 S/CO. Образцы с низкими уровнями IgG к RBD (S/CO <5) в первой точке были собраны на 10–12-й дни болезни. Таким образом, пик концентрации антител не был достигнут, что может быть связано с вариабельностью инкубационного периода SARS-CoV-2 и индивидуальной динамикой выработки антител. Тем не менее четыре месяца спустя все пациенты, кроме одного, имели схожие уровни анти-RBD IgG (медиана ИП — 6,8, межквартильный диапазон — 6,3–8,9).

Несмотря на выявленное в данной группе 1,5-кратное снижение уровня IgG к RBD, нейтрализующая активность антител при этом оставалась высокой без значимых различий между первой и второй точками. Это позволяет предположить, что количество антител не является единственным фактором, определяющим нейтрализующую активность. С одной стороны, сохранение высокого уровня нейтрализации при снижении концентрации антител может быть обусловлено качественными изменениями антител, в том числе возрастанием их специфичности и аффинности за этот период, с другой стороны — особенностями тест-системы, используемой в исследовании, поскольку полученные значения близки к верхнему пределу количественного измерения данной тест-системы, что не позволяет надежно оценить изменения нейтрализующей активности. В течение того же периода авидность анти-RBD-IgG значительно возросла, достигнув высокого уровня (ИА > 50%) у 78% пациентов. Медианное значение авидности во второй точке составило 61,4% (мин-макс — 18,2–86,9%). Оставшиеся шесть пациентов (22%) имели среднюю (40–50%, «зона созревания») или низкую (< 40%) авидность анти-RBD-IgG. Важно отметить, что у пяти пациентов с низкой и средней степенью авидности заболевание проходило со средней степенью тяжести или носило тяжелый характер (рис. 3). У одного пациента (рис. 1А; оранжевые точки) низкие уровни анти-RBD-IgG и нейтрализующей активности сохранялись во всех точках исследования, однако авидность его анти-RBD-IgG увеличилась с 20,4 до 42,7%. К концу периода госпитализации большинство пациентов обладали высоким уровнем IgG к антигенам SARS-CoV-2, которые были эффективны в предотвращении связывания RBD происходило с человеческим ACE-2. В течение следующих месяцев созревание аффинности анти-RBD IgG и, хотя общая концентрация анти-RBD- и анти-Nc-IgG снижалась, нейтрализующая активность антител оставалась на высоком уровне.

В группе здоровых добровольцев, вакцинированных «Спутником V» (рис. 1Б), восемь из девяти образцов были положительными по анти-RBD-IgG в первой точке исследования (медиана составила 147 дней после первой вакцинации) с ИП, равным 4,9 S/CO (мин-макс — 1–7,9). Четыре месяца спустя (медиана — 261 день после первоначальной вакцинации) анти-RBD-IgG-ИП значительно снизился до медианного уровня 1,7 S/CO, хотя у семи из девяти добровольцев оставались положительными по анти-RBD-IgG. У всех вакцинированных добровольцев IgG к Nc у SARS-Cov-2 отсутствовали, что исключает заражение SARS-CoV-2 в данной группе. Нейтрализующая активность антител коррелировала с динамикой изменения общего количества IgG и достоверно снизилась во всех образцах с медианного значения КИ 57,4% в первой точке исследования до медианы 30,6% во второй точке. Авидность антител при этом оставалась высокой, из чего можно заключить, что уже в первой точке исследования (147 дней после вакцинации) созревание аффинитета завершилось у всех вакцинированных. Стоит отметить, что для трех образцов (33%) во второй точке исследования было невозможно оценить авидность из-за низкого уровня анти-RBD-IgG (рис. 1Б; показаны синим).

В группе вакцинированных «Спутником V» пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 (рис. 1В, табл. 1) медиана времени с момента получения первой дозы вакцины составила 62 дня (30–88), а среднее время забора проб с момента появления симптомов составило 10 дней (5–19). В это время шесть из девяти образцов были положительными на анти-RBD-IgG с медианой 4,3 S/CO и только два были положительными на анти-Nc-IgG. Все анти-RBD-положительные образцы и один отрицательный образец были положительными в ИФА нейтрализации (медиана — 71,6%, мин-макс — 7,4–98,6%). Большая часть образцов (66,7%) имела антитела с низкой авидностью: медианное значение ИА — 27,6% (мин-макс — 0–71,1%). Повторный забор сыворотки в этой группе осуществляли приблизительно на 16-й день после появления симптомов. Через неделю после первого анализа медиана S/CO анти-

RBD-IgG в целом существенно не изменилась (медиана — 7 S/CO, мин-макс — 0,8–11,2), однако семь из девяти пациентов были серопозитивными после инфекции и/или вакцинации. Нейтрализующая активность также существенно не изменилась (медиана — 92,9%, мин-макс — 23,2–99,2%), то же самое наблюдалось и для авидности антител. В двух образцах с низкими уровнями анти-RBD-IgG нейтрализующая активность значительно возросла до 85 и 89%, вероятно, из-за выработки анти-RBD-IgM (рис. 1, желтые точки).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

У переболевших COVID-19 титры вируснейтрализующих антител коррелируют с тяжестью заболевания [5, 6], и такие антитела могут вырабатываться даже при низком уровне соматической гипермутации [7, 8]. Рецепторсвязывающий домен (RBD) является иммунодоминантным и служит мишенью приблизительно для 90% нейтрализующих антител, обнаруживаемых в крови после перенесенной инфекции. Было показано, что титры анти-RBDIgG снижаются после выздоровления с периодом полувыведения 49 дней. В то же время авидность антител со временем возрастала за счет проходящего процесса «созревания аффинитета» (соматической гипермутации с последующей селекцией на связывание с антигеном). Количество IgG к S-белку и RBD было выше в сыворотках госпитализированных в стационар пациентов в сравнении с больными, перенесшими COVID-19 в легкой или бессимптомной форме [9]. Известно, что авидность антител возрастает в ходе инфекции и сохраняется высокой после выздоровления [1]. В донорских плазмах реконвалесцентов корреляция высокой нейтрализующей активности с авидностью анти-RBD-IgG была выше, чем с авидностью анти-Nc. Это позволяет предположить, что антитела к RBD являются основными вируснейтрализующими антителами после COVID-19.

В проведенном нами исследовании сравнение образцов от госпитализированных пациентов и вакцинированных добровольцев спустя 4–6 месяцев после заболевания или вакцинации показало, что у вакцинированных добровольцев наблюдается достоверно более низкий уровень анти-RBD-IgG и нейтрализующей активности, но при этом достоверно более высокая авидность антиRBD-IgG (рис. 4А, В). Все госпитализированные пациенты оставались положительными по анти-RBD-IgG, в то время как у одного из госпитализированных добровольцев уровень антител опустился ниже порога обнаружения (рис. 4В).

Сравнение образцов, полученных от невакцинированных и полностью вакцинированных «Спутником V» пациентов в острой фазе заболевания, показало, что у вакцинированных пациентов уровни антител к RBD и Nc были достоверно ниже, чем у невакцинированных (рис. 4Б). Тем не менее авидность анти-RBD-IgG в группе вакцинированных пациентов была достоверно выше, из чего можно заключить, что, несмотря на низкие уровни антител, вакцинация «Спутником V» приводила к развитию первичного иммунного ответа и формированию В-клеток памяти, а выработка антител в ходе инфицирования демонстрирует свойства вторичного иммунного ответа. В долгосрочном периоде степень созревания аффинности антител после вакцинации оказывается выше, чем после перенесенной инфекции. Хотя предполагается, что созревание антител повышает их нейтрализующую активность [10], в нашей работе корреляция между этими параметрами не выявлена.

Стоит отметить, что исследование имеет ряд ограничений, которые необходимо учитывать. Во-первых, выборка образцов, используемая для анализа, достаточно небольшая. Во-вторых, включенные группы пациентов имели ограниченный спектр клинических проявлений COVID-19. В частности, в исследовании не участвовали бессимптомные пациенты и пациенты с легким течением, доля которых наибольшая по сравнению с остальными клиническими формами. Кроме того, исследование лимитировано лишь двумя временными точками, в которых были проведены наблюдения, что не позволяет оценить, когда именно наступает пик ответа по исследуемым нами параметрам.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование позволяет оценить основные характеристики антительного ответа. Так, у переболевших мы наблюдали ожидаемую картину, где после острой фазы заболевания, достигнутый уровень антител к RBD неизбежно снижается, но по меньшей мере в течение полугода вируснейтрализующая активность сохраняется, что, вероятно, достигается повышением качества антител и ростом авидности. Нами показано, что вакцинация «Спутником V» также приводит к формированию высокоавидных антител, которые сохраняются на протяжении по меньшей мере 6 месяцев наблюдения. Это свидетельствуют о наличии маркеров защитной эффективности по крайней мере в течение 4–6 месяцев после вакцинации или ранее перенесенного заболевания и адекватности срока, выбранного для повторной иммунизации «Спутником V» на территории России. Наше исследование не позволяет оценить, для каких групп защитная эффективность может составлять меньший срок, чем 6 месяцев, однако исследование группы вакцинированных заболевших показывает наличие низкой авидности у вакцинированных заболевших и это резко контрастирует с группой здоровых вакцинированных, которые на заболели в течение полугода наблюдения. Мы предполагаем, что низкая авидность антиRBD-IgG, спустя два месяца после вакцинации, может служить не только прогностическим фактором тяжести заболевания, но и одним из потенциальных маркеров для ранней ревакцинации. Дальнейшие исследования на больших группах позволят подтвердить или опровергнуть данную гипотезу.