В связи с новой коронавирусной инфекцией, вызванной вирусом SARS-CoV-2 и получившей название COVID-19, Всемирной организацией здравоохранения была объявлена пандемия [1]. Тяжелые формы течения этого заболевания сопровождаются развитием прогрессирующей вирусной пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). В патофизиологии COVID-19 значимую роль играет нарастающее системное воспаление. С тяжестью заболевания тесно связано избыточное продуцирование цитокинов, вызванное вирусом SARS-CoV-2, известное как «цитокиновый шторм» [2]. У пациентов с COVID-19 обнаруживают высокие уровни интерлейкинов IL1β, IL1RA, IL6, IL8, IL9, IL10, IL17, С-рективного белка (СRP), фактора некроза опухоли (TNFα) [3–5].

Накопленные данные в исследованиях in vitro и in vivo свидетельствуют о том, что желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) тоже восприимчив к инфекции COVID-19. Например, на модели in vitro, имитирующей клеточные и пространственные структуры кишечника, была продемонстрирована способность вируса SARS-CoV-2 инфицировать энтероциты [6]. Частота возникновения гастроинтестинальных симптомов у пациентов с COVID-19 достигает 20% [7]. Причина этого в сбособности SARS-CoV-2 проникать в клетки путем связывания с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2), который активно экспрессируется на поверхности энтероцитов подвздошной и толстой кишки, что и приводит к гастроинтестинальным симптомам путем вызванного вирусом иммуноопосредованного повреждения [8]. Кроме того, вирусная РНК SARS-CoV-2 может быть обнаружена в образцах кала спустя более 30 дней после начала заболевания [9]. В данном аспекте в литературе активно обсуждают роль микробиоты кишечника. Как известно, микробиота кишечника является важной составляющей поддержания иммунного гомеостаза. В свою очередь дисбиотические нарушения микробиоты кишечника напрямую связаны с многочисленными воспалительными заболеваниями [10]. Представлены убедительные данные о качественных изменениях микробиоты кишечника у пациентов, инфицированных COVID-19 [11]. В целом, у пациентов с COVID-19 отмечена тенденция к уменьшению видового разнообразия бактерий, истощению полезных комменсалов и обогащению патобионтами [12], однако сведения о видовом составе микробиоты кишечника фрагментарны и противоречивы. Учитывая, что взаимодействия, реализуемые посредством оси «кишечник–легкие», потенциально могут повышать восприимчивость организма хозяина к вирусной инфекции и снижать функциональную активность иммунных клеток, что способствует развитию системного гипервоспаления с синдромом «цитокинового шторма», является актуальным дальнейшее изучение изменений микробиоты кишечника и характера их взаимосвязи с показателями цитокинового статуса у пациентов с COVID-19.

Цель исследования — изучение изменений таксономического состава микробиоты кишечника и характера их взаимосвязи с тяжестью заболевания, IL6, IL10, IL17 и TNFα у пациентов с COVID-19.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Методом сплошной выборки в сравнительное одномоментное исследование было включено 110 пациентов с COVID-19 (женщины — 66 (60,0%), мужчины — 44 (40,0%); средний возраст — 28,6 ± 8,4 лет), поступивших на стационарное лечение в больницы, работающие в системе обязательного медицинского страхования г. Симферополя (основная группа, ОГ) и 98 здоровых добровольцев, не инфицированных COVID-19 (женщины — 61 (62,2%), мужчины — 37 (37,8%); средний возраст — 29,2 ± 7,6 лет), проходивших ежегодный профилактический медицинский осмотр на базе медицинского центра «Гемокод» г. Симферополя (контрольная группа, КГ).

Критерии включения пациентов в ОГ: возраст 18–45 лет; подтвержденная COVID-19 на основании положительной полимеразой цепной реакции (ПЦР) на РНК вируса SARSCoV-2 и/или типичной картины вирусной пневмонии при мультиспиральной компьютерной томографии (КТ); легкое, среднетяжелое и тяжелое течение COVID-19.

Критерии невключения в ОГ: крайне тяжелое течение COVID-19; сахарный диабет I и II типа; ожирение; инфаркт миокарда, тяжелые нарушения ритма сердца, сердечная недостаточность; гипертоническая болезнь, инсульт, транзиторная ишемическая атака в анамнезе; острое нарушение мозгового кровообращения (за предшествующие шесть месяцев до начала исследования); тяжелые или декомпенсированные сопутствующие соматические заболевания, которые могут затруднять участие больного в исследовании и влиять на его результаты; синдром раздраженного кишечника; хронические заболевания ЖКТ, печени; гематологические и онкологические заболевания; психические расстройства, алкоголизм или наркомания в анамнезе; прием антибиотиков, пробиотиков, пребиотиков, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих препаратов в предшествующие три месяца до начала исследования; прием препаратов, влияющих на стул в предшествующий месяц до начала исследования; отказ от участия в исследовании.

Критерии включения здоровых добровольцев: возраст 18–45 лет; не подтвержденная COVID-19 на основании проведенной ПЦР на РНК вируса SARS-Co; отсутствие хронических заболеваний и аллергических реакций; отсутствие инфекционных и острых заболеваний в течение двух месяцев перед исследованием; отсутствие психических расстройств, алкоголизма или наркомании в анамнезе; отсутствие нарушений стула (запоров/диареи) в предшествующий месяц до начала исследования; не принимавшие антибиотики, пробиотики, пребиотики, противовирусные и симбиотические препараты в предшествующие три месяца до начала исследования; не принимавшие препараты, влияющие на стул в предшествующий месяц до начала исследования.

Критерии невключения здоровых добровольцев: температура тела выше 36,9 °С; отказ от участия в исследовании.

Характеристика пациентов с COVID-19 и здоровых добровольцев представлена в табл. 1. Группы были сопоставимы по полу (р = 0,96; χ²), возрасту (р = 0,92; χ²) и индексу массы тела (р = 0,054; χ²).

Клиническая характеристика пациентов с COVID-19 представлена в табл. 2. Среди пациентов преобладали лица со среднетяжелым течением COVID-19 — 80 (72,7 ± 0,68%). Наиболее частыми симптомами заболевания были лихорадка — 103 (94,2%) и кашель — 96 (86,9 ± 0,61%). По данным КТ вирусная пневмония диагностирована у 95 (67,1 ± 0,38%) пациентов.

Диагноз COVID-19 у всех пациентов был подтвержден с помощью ПЦР на вирус SARS-CoV-2 (материал получен с помощью мазка из носоглотки и ротоглотки) и/или типичной вирусной пневмонии при мультиспиральной КТ. Диагностику и степень тяжести COVID-19, распространенность пневмонии по результатам КТ оценивали согласно Временным методическим рекомендациям по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (COVID-19) Минздрава РФ 6–9-й версий.

С целью объективизации тяжести клинического состояния мы использовали оригинальную шкалу оценки клинического состояния больных с коронавирусной инфекцией (ШОКС-КОВИД) [13].

Для анализа таксономического состава микробиоты кишечника у пациентов в первый день госпитализации (в утреннее время с 8.00 до 10.00) были взяты образцы кала, которые замораживали и хранили в одноразовых пластиковых контейнерах при температуре –80 °C до проведения метагеномного анализа. Выделение тотальной ДНК проводили методом фенольной экстракции. Нуклеотидная последовательность выделенной ДНК была установлена методом шотган-секвенирования с использованием высокопроизводительного секвенатора SOLiD5500 Wildfire (AppliedBiosystems; США) [14].

Фильтрацию прочтений по качеству и их таксономическую классификацию проводили с помощью программного обеспечения QIIME версии 1.9.1 [15]. Для определения таксономической принадлежности прочтений применяли подход, включающий в себя использование двух таксономических баз данных. На первом этапе осуществляли подбор референсного набора операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 [16]. На втором этапе с использованием алгоритма RDP определение таксономической принадлежности данных ОТЕ проводили на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb [17].

Изучение качественного и количественного состава микробиоты кишечника осуществляли на основании определения видов, родов и фил микроорганизмов. Оценку α-разнообразия сообщества путем расчета индекса Chao1, показателя числа обнаруженных таксонов (Sobs), показателя, оценивающего реальное количество таксонов (ACE), проводили с помощью программы Mothur v.1.22.0 (http:// www.mothur.org).

В качестве маркеров цитокинового профиля нами выбраны IL6, IL10, IL17 и TNFα, что обусловлено их значимой ролью в патогенезе «цитокинового шторма» и ОРДС [3–5].

Забор крови из периферической вены выполняли в первый день госпитализации натощак в утренние часы (7.00–9.00) в состоянии покоя (не менее 15 мин). Пробирки с сывороткой крови хранили в замороженном состоянии при температуре –20 °С. Уровень IL6, IL10, IL17 и TNFα в сыворотке крови изучали с помощью тест-системы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (Вектор-Бест; Новосибирск, Россия) на автоматическом ИФА-анализаторе «Elisys Quattro» (Human GmbH; Германия).

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft. Inc.; США). При нормальном распределении показателей определяли среднее значение и стандартное отклонение, при распределении, отличном от нормального, — медиану, 25-й и 75-й процентили. Нормальность распределения проверяли при помощи распределения Гаусса. Для качественных признаков определяли долю и абсолютное число значений. Сравнительный анализ для нормально распределенных количественных признаков проводили c помощью параметрического t-критерия Стьюдента, при распределении, отличном от нормального, — с помощью U-критерия Манна–Уитни, для количественных признаков — с помощью критерия χ² (хи-квадрат). Для оценки взаимосвязи признаков рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Применяли также корреляционный анализ и множественную ранговую корреляцию, достоверность корреляционных связей проверяли при помощи таблиц сопряженности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При изучении таксономического состава микробиоты кишечника у пациентов с COVID-19 по сравнению с лицами КГ обнаружено статистически значимое снижение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1; p = 0,016). Индексы ACE и Sobs в группе пациентов с COVID-19 по сравнению с КГ также были несколько снижены, при этом статистически значимых различий не найдено (р = 0,054; р = 0,052 соответственно) (рис. 1).

При сравнении видового состава кишечной микробиоты в группах обследованных у пациентов с COVID-19 по сравнению с КГ установлено статистически значимое cнижение численности Bifidobacterium adolescentis SPM1005-A (p = 0,048), Eubacterium rectale ATCC 33656 (p = 0,036), Faecalibacterium prausnitzi A2-165 (p = 0,0002), Bacterioides dorei DSM 17855 (p = 0,001) и выявлено повышение численности Ruminococcus gnavus ATCC 29149 (p = 0,012), Сlostridium hathewayi DSM-13479 (p = 0,003) и Enterococcus faecium W54 (p = 0,0003) (рис. 2).

Показатели IL6, IL10, IL17 и TNFα в сыворотке крови у пациентов с COVID-19 по сравнению с показателями КГ статистически значимо выше (табл. 3).

В ходе уточнения взаимосвязи изменений микробиоты кишечника с некоторыми показателями цитокинового профиля у пациентов с COVID-19 получены статистически значимые корреляционные связи численности бактерий B. dorei с показателем IL6 (r = –0,49; p = 0,034), численности бактерий F. prausnitzi и показателей IL10, IL17 (r = –0,44; p = 0,001 и r = –0,52; p < 0,001 соответственно). Численность бактерий R. gnavus коррелировала с показателем TNFα (r = 0,51; p = 0,036), а численность E. faecium — с IL6 (r = 0,47; p = 0,002) и TNFα (r = 0,56; p = 0,001). В ходе корреляционного анализа выявлена также сопряженность численности бактерий B. dorei, F. prausnitzi и E. faecium с более высокими баллами по ШОКС-КОВИД (r = –0,54 и p = 0,001; r = –0,60 и p < 0,001; r = 0,67 и p = 0,005 соответственно).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ряде ранее выполненных работ сообщается об изменении состава микробиоты кишечника у пациентов с COVID-19 [7, 11, 12].  Результаты настоящего исследования тоже показали, что состав микробиоты кишечника у пациентов с COVID-19 значительно отличается от такового у лиц, не инфицированных COVID-19. По нашим данным, у пациентов с COVID-19 по сравнению с лицами, не инфицированными COVID-19, более низкое бактериальное α-разнообразие, что подтверждается статистически более низким индексом Chao1 и согласуется с результатами ранее выполненных исследований [11]. У пациентов с COVID-19 дисбиотические изменения кишечника характеризовались снижением численности бактерий с иммуномодулирующим потенциалом — представителей типа B. adolescentis, E. rectale, F. prausnitzi, B. dorei, которые, как известно, являются основными продуцентами бутирата (мощного противовоспалительного метаболита). В то же время мы обнаружили повышенную численность потенциальных патобионтов — бактерий R. gnavus, Сl. hathewayi и E. faecium. Среди них стоит отметить наличие E. faecium, которые ранее были обнаружены в образцах фекалий пациентов с COVID-19 итальянскими исследователями [18]. Высокое содержание E. faecium в микробиоте кишечника у пациентов в критическом состоянии может иметь клиническое значение, в связи с ее патогенным потенциалом, резистентностью ко многим широко используемым противомикробным препаратам и способностью к стремительному приобретению генетического материала или изменению генной экспрессии, позволяющей ей приобретать детерминанты устойчивости практически ко всем антибактериальным средствам [19, 20]. Независимо от штамма рода Enterococcus, кишечная микробиота у пациентов с COVID-19 способна, таким образом, действовать как резервуар условно-патогенных микроорганизмов, потенциально устойчивых к антибиотикам, с возможностью миграции через поврежденные эпителиальные барьеры в системный кровоток, как уже было продемонстрировано в контексте других заболеваний [20]. Полученные нами результаты частично соотносятся с данными ряда других ранее выполненных работ. Например, в одной из работ, для пациентов с COVID-19 были характерны снижение численности B. dorei и повышение численности E. faecium [18]. В другом исследовании для пациентов с COVID-19 были характерны снижение численности B. adolescentis, E. rectale, F. prausnitzi  и повышение численности бактерий R. gnavus [21]. Контрастирование полученных данных может быть обусловлено тем, что наблюдения выполняли в различных географических регионах и использовали различные критерии включения в исследование. Группы значительно различались по возрасту: 28,6 ± 8,4 года в нашем исследовании против 73,0 [59,0; 85,0] в ранее описанном [18] и 36,4 ± 18,7 года — в исследовании [21]. Кроме того, в отличие от вышеуказанных авторов мы не включали в наблюдение пациентов, имеющих коморбидные соматические заболевания и принимающих антибактериальные и/или противовирусные препараты с целью нивелирования их влияния на результаты исследования.

Несмотря на то что некоторые идентифицированные нами бактерии могут быть общими для ряда других заболеваний, как кишечных, так и системных, установленная в нашей работе сопряженность сниженного содержания бактерий B. dorei, F. prausnitzi и повышенного содержания бактерий E. faecium с более высокими баллами по ШОКС-КОВИД позволяет предположить, что изменения численности этих бактерий могут быть характерными для данной когорты пациентов с COVID-19. Обнаруженные ассоциации мы сопоставили с результатами ранее выполненных исследований. Так, у пациентов, поступивших в отделение интенсивной терапии, наблюдалось истощение представителей рода Bacteroides [18]. Интересно, что в дугой работе [7] представленность B. dorei обратно коррелировала с фекальной нагрузкой SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19. Авторы отметили, что с учетом ассоциированности этой бактерии с пониженной экспрессией рецепторов АПФ2 в ободочной кишке мышей, B. dorei может быть потенциально протективной в отношении вируса SARS-CoV-2. Представлены данные об обратной корреляции бактерий F. prausnitzii, известной своими противовоспалительными эффектами, и степенью тяжести инфекции COVID-19 [7]. В то же время у пациентов с COVID-19 из отделения интенсивной терапии по сравнению с пациентами из отделения общей терапии отмечена более высокая численность штаммов рода Enterococcus (p = 0,0001) [18]. Можно предположить, что терапевтическое повышение численности B. dorei, F. prausnitzii и снижение численности E. faecium эффективны в отношении смягчения тяжести заболевания, однако для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных исследований с соответствующим дизайном. Ряд авторов отмечает, что пребиотические и/ или пробиотические препараты могут быть использованы в качестве потенциального (дополнительного) вектора терапии COVID-19  с целью снижения тяжести инфекции и минимизации риска вторичных бактериальных осложнений [22, 23].

В ряде исследований доказано влияние микробиоты кишечника на восприимчивость к инфекционным и неинфекционным заболеваниям [24]. Отмечено, что иммуномодулирующее действие кишечной микрофлоры реализуется посредством активации генов ряда цитокинов в иммунных и эпителиальных клетках, что определяет гетерогенность их иммуномодулирующих свойств [25]. Сообщалось, что как для доминантных микросимбионтов, так и для ассоциантов характерна гетерогенность в проявлении иммунорегуляторных эффектов [26]. Так, суммарные эффекты воздействия представителей нормофлоры на секрецию цитокинов иммунными клетками человека в условиях эубиоза обеспечивают цитокиновый баланс, характеризующийся умеренным уровнем провоспалительных цитокинов (IL6, TNFα) и контролируемый супрессивным воздействием антифлогогенных цитокинов. В условиях нарастания антигенной нагрузки при дисбиозе через активацию toll-like-рецепторов усиливается продукция целого спектра провоспалительных цитокинов, которые способствуют развитию как локального воспаления, так и эффекторных иммунных реакций в лимфоидных образованиях кишечника, защищающих организм от патогенов [27]. 

Как указывалось ранее, при инфекции COVID-19 содержание цитокинов IL6, IL10, IL17 и TNFα повышается [4]. В настоящем исследовании у пациентов с COVID-19 по сравнению со здоровыми добровольцами также установлены статистически значимые различия в уровне IL6, IL10, IL17 и TNFβ.

Предполагается, что тяжесть COVID-19 является следствием «цитокинового шторма» [4]. Примечательно, что некоторые из вышеперечисленных цитокинов коррелируют с паттерном микробиоты кишечника, специфический профиль которой способен инициировать «цитокиновый шторм». В настоящем исследовании у пациентов с COVID-19 установлена корреляция между численностью бактерий B. dorei и уровнем IL6.

Выявлена сопряженность численности бактерий F. prausnitzi и показателей IL10, что может быть опосредовано снижением секреции метаболитов, блокирующих активацию транскрипционного фактора NF-kB и продуцирование IL8. Например, в исследовании in vivo показано, что активация мононуклеарных клеток периферической крови посредством F. prausnitzi вызывала значительное снижение секреции IL12 и TNFα и увеличение секреции IL10 [28]. Кроме того, численность бактерий F. prausnitzi обратно коррелировала с уровнем IL17. В ходе анализа литературных данных мы не встретили работ, посвященных изучению связи между микробиотой кишечника и  IL17 у пациентов с COVID-19. Вместе с тем, показано, что F. prausnitzi подавляет продукцию IL17 у крыс [29]. На модели экспериментального колита было продемонстрировано, что бактерии F. prausnitzi, проявляют свой противовоспалительный эффект за счет продукции бутирата, поддерживающего баланс между противовоспалительными Т-хелперными клетками 17 типа (Th17) и иммунорегуляторными (T_reg) Т-клетками посредством ингибирования гистондеацетилазы 1. В свою очередь, нарушение баланса между Th17 и T_reg способствует развитию аутоиммунного воспаления [30]. 

Нами также выявлена сопряженность численности бактерий Ruminococcus gnavus и показателей TNFα. Эти данные согласуются с результатами ранее опубликованной работы [31], в которой установлено, что более высокое содержание бактерий R. gnavus у пациентов с COVID-19 коррелирует с всплеском провоспалительных цитокинов IFNγ и TNFα, что обусловливает цитокиновый шторм и активацию Т-хелперных клеток 1-го типа.

Мы обнаружили, что численность бактерий E. faecium коррелировала с уровнем IL6 и TNFα. В литературе нами были найдены подобные корреляции у пациентов с язвенным колитом [32] и у пациентов со СПИДОМ/ВИЧ [33].

Таким образом, в условиях кишечного дисбиоза на фоне COVID-19 у представителей нормофлоры ограничивается направленность иммунорегуляторных эффектов на противовоспалительные цитокины, что способствует нарушению гомеостаза и развитию воспалительных и аутоиммунных реакций.

ВЫВОДЫ

У пациентов с COVID-19 установлена сопряженность сниженного содержания бактерий B. dorei, F. prausnitzi и повышенного содержания бактерий E. faecium с более высокими баллами по ШОКС-КОВИД, что свидетельствует о патогномоничности данных таксономических изменений микрофлоры кишечника для лиц, инфицированных SARS-CoV-2. У пациентов с SARS-CoV-2-инфекцией обнаружены статистически значимые корреляционные связи численности кишечных бактерий B. dorei, F. prausnitzi, R. gnavus, E. faecium с показателем IL6, IL10, IL17, TNFα, что подтверждает способность микробиоты кишечника участвовать в системных воспалительных реакциях и поддерживать толерантность иммунного ответа при COVID-19. Полученные данные в совокупности с имеющимися в мировой литературе указывают на значимую роль микробиоты в патогенезе COVID-19. Более системное и детальное исследование в этом направлении позволит разработать новые подходы, препараты селективных пробиотиков для коррекции микробиоты при протекании СOVID-19 и лечении постковидных последствий.