Электрохимический метод анализа — это мощный инструмент для оценки содержания, чистоты лекарства и концентрации лекарственных средств, как в фармацевтических, так и в биологических жидкостях или тканях (моче, сыворотке, плазме, крови, клеточных лизатах). Несмотря на применение различных методов оценки лекарств (таких как спектрофотометрия, колориметрия, спектрофлуориметрия, газовая хроматография-массспектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография, титриметрия, капиллярный электрофорез, ВЭЖХтандемная масс-спектрометрия и термогравиметрический анализ, радиометрия, иммуноанализ) [1], электрохимические методы также востребованы вследствие их высокой чувствительности, уникальной электрохимической сигнатуры соответствующего соединения, умеренной стоимости, быстроты электрохимического метода анализа, небольшого объема пробы (2–60 мкл) и портативности оборудования. Электроанализ позволяет регистрировать несколько лекарств одновременно и исследовать их различными электрохимическими методами для повышения чувствительности анализа (циклическая и инверсионная вольтамперометрии, квадратно-волновая вольтамперометрия, дифференциально-импульсная вольтамперометрия, хроноамперометрия и спектроскопия электрохимического импеданса) [2–6].

Цитохромы Р450 — суперсемейство гем-тиолатных монооксигеназ, вовлеченных в метаболизм ксенобиотиков и эндогенных соединений [7]. Метод анализа каталитической активности этого класса гемопротеинов с помощью метода электроокисления лекарств-субстратов хорошо зарекомендовал себя в ранее опубликованной работе [4] по регистрации каталитической активности цитохрома Р450 3А4. Цитохром Р450 19A1 (CYP19A1, ароматаза) — ключевой фермент биосинтеза эстрогенов [8]. Для количественного определения продуктов CYP19A1зависимой электрокаталитической реакции ранее были разработаны методы электрохимического определения эстрона или β-эстрадиола с помощью электродов, модифицированных различными нанокомпозитными материалами [9–12]. Электрохимическое окисление эстрона или β-эстрадиола как метаболитов ароматазы может быть зарегистрировано и на коммерчески доступных трехконтактных ПГЭ [13].  Электроокисление (S)-7-гидроксиварфарина как метаболита цитохрома Р450 2С9 было применено для определения кинетических параметров этого гемопротеина [5].

Целью работы было разработать безреагентный электрохимический метод идентификации и количественного определения лекарственных средств в физиологических условиях для возможности анализировать препараты в сыворотке крови с помощью коммерчески доступных трехконтактных электродов, получаемых методом трафаретной печати с графитовым рабочим электродом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Электрохимические измерения проводили с использованием потенциостатов PGSTAT 12 Autolab и PGSTAT 312N Autolab, (Metrohm Autolab Ins.; Нидерланды) с программным обеспечением GPES и NOVA версии 4.9.7 и 2.0 соответственно (Нидерланды). Использовали трехконтактные печатные графитовые электроды (ПГЭ, «КолорЭлектроникс»; Россия); с графитовыми рабочим и вспомогательным электродами, хлорсеребряным электродом сравнения. Диаметр рабочего электрода составлял 0,2 см (площадь 0,0314 см²). Все потенциалы приведены относительно хлоридсеребряного электрода сравнения (Ag/AgCl).

В работе использовали следующие реактивы: однозамещенный фосфат калия («Реахим»; Россия), хлорид натрия («Реахим»; Россия), диклофенак натрия (субстанция, Sigma-Aldrich; Индия), ибупрофен натрия (субстанция, Sigma-Aldrich; Индия), ацетаминофен

(лекарственная форма, «Фармстандарт-Лекарства»; Россия), мексидол (лекарственная форма, «Фармасофт»; Россия), сыворотка крови (S 1005-14, UsBiological; США).

Растворы 10 мМ аналитов готовили в 0,1 М калийфосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 0,05 М NaCl, нужную концентрацию получали разведением в буфере и хранили при +4 °С.

Измерения проводили в режиме реального времени методами дифференциально-импульсной вольтамперометрии (ДИВА) в диапазоне потенциалов 0–1,6 В, с шагом потенциала 0,01 В, частотой 25 Гц и циклической вольтамперометрии (ЦВА). Эксперименты выполняли в аэробных условиях при комнатной температуре. В горизонтальном положении на поверхность одноразового ПГЭ, покрывая рабочий электрод, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60 мкл анализируемого раствора лекарства (объем, необходимый для равномерного распределения капли на электродах) [14]. Для оценки повторяемости результатов для каждой концентрации использовали не менее трех электродов.

Для расчета чувствительности и предела обнаружения строили зависимость тока пика окисления аналита от его концентрации. Полученные калибровочные зависимости использовали для расчета чувствительности (формула 1) и предела обнаружения (формула 2) [15]:

формула

где S — чувствительность, I — ток, C — концентрация лекарства, Сlim — предел обнаружения, σ — остаточное стандартное отклонение (стандартное отклонение коэффициента b уравнений регрессии).

Для освобождения сыворотки крови от белковых компонентов 2,5 мл сыворотки помещали в стеклянную пробирку на 10 мл и добавляли 2,5 мл 15% (масс./об.) раствора сульфата цинка в ацетонитриле (50/40, об./об.) или 10%-ю трихлоруксусную кислоту (1 : 10). Пробирку встряхивали в течение 20 мин и выдерживали при 4 °C в течение 15 мин, после чего центрифугировали при 13 500 об./мин в течение 5 мин. Затем супернатанты отбрасывали, и раствор использовали для последующих анализов [16]. После осаждения белков сыворотку развели в 10 раз 0,1 М калий-фосфатным буфером, содержащим 50 мМ NaCl, рН 7,4.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ключевым моментом электроанализа является обоснованный выбор типа электродов для наиболее эффективного процесса переноса электронов и регистрации молекулы, биохимического события, каталитического тока как индикатора электрокатализа [17]. Показано, что модификация рабочей поверхности электродов наноматериалами (углеродными нанотрубками, графеном, оксидом графена, наночастицами металлов) способствует повышению аналитической чувствительности сенсора [6]. Однако модифицированные ПГЭ могут приобретать фоновые характеристики, затрудняющие прямую регистрацию электроокисления/электровосстановления [18]. Для немодифицированных ПГЭ фоновые характеристики в электролитном буфере не содержат нежелательных дополнительных сигналов и имеют довольно низкие значения регистрируемого тока [5]. Кроме того, немодифицированные электроды коммерчески доступны, воспроизводимость электрохимического метода анализа высока, что является необходимой составляющей дальнейшего практического использования сенсоров для анализа лекарственных средств и оценки их чистоты, в том числе в клинико-диагностических лабораториях. В связи с этим нами разработаны методы регистрации лекарственных препаратов с использованием именно немодифицированных графитовых рабочих поверхностей электродов.

Электроаналитические характеристики лекарственных препаратов

N-ацетил-пара-аминофенол, или препарат А — жаропонижающее и обезболивающее средство, обычно используемое при слабой и умеренной боли или для снижения температуры, в том числе при вирусных и бактериальных инфекциях [3]. Было показано, что N-ацетил-п-бензохинонимин (NAPQI) является основным продуктом окисления препарата А [3]. Механизм его обезболивающего действия связан с ингибированием синтеза простагландинов в центральной нервной системе [2, 3, 19].   

На рис. 1 представлена дифференциально-импульсная вольтамперограмма 1 мМ препарата А, полученная в диапазоне потенциалов 0–1,2 В на немодифицированных ПГЭ. В аэробных условиях окисление препарата А происходит при потенциале Eок, равном 0,50 ± 0,03 В (отн. Ag/AgCl). На вставке рисунка показан линейный рост величины тока пика окисления препарата А с ростом концентрации от 0,05 мМ до 1,00 мМ. Потенциал окисления препарата А был стабилен в пределах погрешности определения.

В таблице (таблица) представлены электроаналитические характеристики (диапазон концентраций, потенциал окисления, уравнение зависимости тока пика окисления от концентрации, коэффициент достоверности аппроксимации R2, а также чувствительность электрохимической системы, рассчитанная по уравнению 1, и предел обнаружения препарата А, рассчитанный по уравнению 2. 

(RS)-2-(4-изобутилфенил)-пропионовая кислота, или препарат И — нестероидный противовоспалительный препарат из группы производных пропионовой кислоты, обладает болеутоляющим и жаропонижающим действием [12, 13]. На рис. 2 представлены дифференциальноимпульсные вольтамперограммы препарата И, полученные в диапазоне потенциалов 0,6–1,6 В и концентраций 0,5–10 мМ на ПГЭ. Реакция электроокисления 1 мМ препарата И происходит при высоких значениях потенциала (1,29 ± 0,02) В (таблица). 

(2-(2,6-дихлоранилин)-фенилуксусная кислота, или препарат Д — нестероидный противовоспалительный препарат из группы производных фенилуксусной кислоты, в лекарственных формах ее используют в виде натриевой соли. Имеет различные торговые названия, ее назначают при многих заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, остеоартрит, различные воспалительные процессы [20, 21]. Проявляет анальгетические, противовоспалительные, а также противораковые свойства [21]. Препарат Д подвергается активному метаболизму под воздействием глюкурозилтрансферазы с образованием ацилглюкуронида диклофенака. Под воздействием цитохромов Р450 подвергается окислительному метаболизму с образованием 4′-гидроксидиклофенака (катализируется цитохромом Р450 2С9) и 5-гидроксидиклофенака (катализируется цитохромом Р450 3А4) [22, 23].

В некоторых случаях этот препарат может вызывать нежелательные побочные реакции: желудочные кровотечения, повышение артериального давления у пациентов с синдромом Шая–Дрейджера и сахарным диабетом. При длительном приеме может развиться инфаркт или инсульт [20]. В связи с этим анализ препарата Д остается актуальной задачей биоаналитической и фармакологической химии.

На рис. 3 представлены дифференциально-импульсные вольтамперограммы препарата Д, полученные на ПГЭ в диапазоне потенциалов 0,2–1,0 В и концентраций 50 мкМ – 500 мкМ. Потенциал окисления, равный 0,57 ± 0,05 В, был стабилен в пределах погрешности определения в исследованном диапазоне концентраций. Наблюдается линейная зависимость величины пика окисления от концентрации препарата Д (см. таблица).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для характеристики процессов электроокисления лекарств были использованы ЦВА в диапазоне скоростей сканирования 0,05–0,18 В/с. Результаты ЦВА продемонстрировали линейную зависимость токов пика окисления 1 мМ препарата А, 100 мкМ препарата Д и 5 мМ препарата И от корня квадратного скорости сканирования ν1/2 (рис. 2 (а), 4 (а), 6 (а) приложения), что свидетельствует о диффузионно-контролируемом процессе электроокисления лекарственных препаратов на немодифицированных ПГЭ в изученном диапазоне скоростей сканирования потенциала [24]. Наблюдается также линейная зависимость потенциалов пика окисления от логарифма скорости сканирования log ν (рис. 2 (б), 4(б), 6(б) приложения), что характерно для необратимых электрохимических процессов. Это подтверждено методом ЦВА: наблюдается только пик окисления 1 мМ препарата А, 100 мкМ препарата Д и 5 мМ препарата И на немодифицированных ПГЭ (рис. 1, 3 и 5 приложения), что позволяет предположить необратимость электрохимических реакций. Эти результаты согласуются с механизмами электроокисления проанализированных препаратов [2, 3, 6, 19–22, 25–30].

В клинической фармакологии и терапии широко используют назначение больному одновременно несколько лекарственных препаратов (полипрагмазия). При полиморбидности (назначение двух и более препаратов) необходим контроль фармакокинетических и фармакодинамических параметров. Электроанализ на основе регистрации реакции электроокисления лекарственных средств позволяет одновременно детектировать несколько соединений. Такой подход применим для определения взаимного влияния лекарственных средств. Так, антиоксидантный метаболический препарат мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин сукцинат, или препарат М), назначаемый для улучшения мозгового кровообращения, часто используют для различных групп пациентов с наличием сопутствующих заболеваний. С помощью ПГЭ были проанализированы комбинации препаратов Д + М (рис. 4), Д + И (рис. 5). Электроокисление препарата М регистрируется при потенциале +0,67 ± 0,06 В (рис. 4). Однако препарат М (98 мкМ) практически не влияет на реакцию электроокисления препарата Д (100 мкМ). В смеси происходит незначительное смещение потенциала окисления препарата Д в анодную область на 5 ± 2 мВ, что свидетельствует о более затрудненной реакции электроокисления. Ток пика электроокисления снижается несущественно (± 6%), что позволяет количественно определять препарат Д в присутствии препарата М (рис. 4). На рис. 5 представлена ДИВА смеси 25 мкМ препарата Д и 200 мкМ препарата И на ПГЭ. Измерения проводили в диапазоне потенциалов 0–1,6 В. Четко регистрируется разделение пиков электроокисления препаратов Д (Е_ок = +0,54 ± 0,02 В) и И (Е_ок = +1,29 ± 0,02 В), при этом сохраняется концентрационная зависимость.

Препарат Д был определен методом электрохимического окисления и в образцах сыворотки крови. Концентрация препарата Д, добавленного в сыворотку крови, составляла 100 мкМ, зарегистрированная величина тока пика окисления — 7,5 × 10^–8 А (рис. 3). Как видно из вставки рис. 3 и калибровочной зависимости (см. таблица), найденная по уравнению регрессии концентрация препарата Д составила 95 ± 5 мкМ.

ВЫВОДЫ

Разработан метод анализа лекарств с использованием коммерчески доступных взаимозаменяемых немодифицированных электродов, получаемых методом трафаретной печати. Чувствительность метода соответствует терапевтически значимым диапазонам концентраций. Электроокисление лекарственных препаратов с использованием электрода как измерительного инструмента является эффективным аналитическим подходом для регистрации чистоты лекарственного средства, определения его концентрации, в том числе и в биологических жидкостях для терапевтического мониторинга. Методы количественного определения лекарственных препаратов на основе электроокисления могут быть применены для исследования каталитической активности ферментов, осуществляющих метаболические превращения I фазы, таких как цитохром Р450, флавинсодержащие монооксигеназы, альдегид оксидазы, альдегид дегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, карбоксилэстеразы, и для анализа активности ферментов II фазы метаболических превращений: глюкоронозилтрансферазы, сульфотрансферазы, глютатионтрансферазы. Метод применим также для регистрации сравнительных кинетических параметров полиморфных вариантов, а также генно-инженерных форм ферментов с целью разработки технологически важных изоформ биокатализаторов.