Митохондриальные дисфункции представляют собой группу разнообразных заболеваний, в том числе и наследственных, которые могут проявляться в любом возрасте и иметь широкий спектр клинических симптомов, что затрудняет их диагностику [1]. Часто развитие митохондриальных дисфункций обусловлено нарушениями в геноме митохондрий [2]. В ряде случаев мутации митохондриального генома вызваны экспрессией мутантной формы ядерного гена Polg, отвечающего за репликацию и репарацию мтДНК [3]. Известно, что мутация D257A гена Polg ведет к накоплению случайных мутаций в геноме митохондрий [4]. Митохондриальный геном в целом менее стабилен, чем ядерный, ввиду отсутствия гистонов, своеобразности репарационных механизмов и наличия свободных радикалов кислорода, которые являются побочными продуктами аэробного дыхания [5], поэтому в организме существуют механизмы поддержания гомеостаза митохондрий. Одним из них является митофагия [6] — процесс, направленный на элиминацию дисфункциональных митохондрий и являющийся частным случаем аутофагии [7].

Для исследования процессов развития митохондриальной дисфункции и патологических состояний, обусловленных ею, необходимо создание адекватных моделей. Один из наиболее простых способов моделирования развития митохондриальной дисфункции in vivo — создание трансгенных животных с экспрессией мутантной формы гена Polg, приводящей к нарушению процессов репарации митохондриального генома и накоплению мутаций. Для изучения развития процессов митохондриальной дисфункции в различных органах и тканях была создана универсальная модель — генетически модифицированные мыши с индуцируемой тканеспецифичной и системной экспрессией мутантного D257A варианта гена Polg [8]. Модель чрезвычайно удобна тем, что экспрессия мутантного варианта гена включается только после скрещивания трансгена с активаторной линией животных, что предотвращает спонтанное развитие дефектного фенотипа и передачу митондрий с мутантным геномом в ряду поколений. 

Целью данного исследования было оценить возможность использования культуры трансгенных эмбриональных фибробластов мыши (mouse embryonic fibroblasts, MEF) Polg*Cre-CMV (Polg*B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J, далее Polg*Cre-CMV) [https://www.jax.org/strain/006054]) в качестве in vitro модели развития митохондриальной дисфункции, вызванной накоплением мутаций в митохондриальном геноме вследствие экспрессии мутантной формы гена Polg, а также оценить влияние системной экспрессии трансгена на мышечную систему животных и на процессы формирования пула периферических Т-лимфоцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичные культуры MEF были получены на стадии E13.5 путем скрещивания самок линии Polg и самца линии Cre-CMV по протоколу, описанному ранее [9]. Все используемые в эксперименте культуры были прогенотипированы методом ПЦР с помощью праймеров P1 и P2 (STOP-кассета 292 п.н.), P3 и P4 (терминатор 417 п.н.), P5 и P6 (Internal control 324 п.н.), P7 и P8 (CMV 100 п.н.). Последовательности всех праймеров представлены в таблице (таблица).

Эмбриональные фибробласты культивировали 5 недель и провели 10 пассажей. Культуральная среда для MEF: DMEM с глутамином 450 мл (Панэко; Россия), эмбриональная телячья сыворотка 50 мл (BioSera; Франция), пенициллинстрептомицин, 100-кратный лиофилизированный (Панэко; Россия), аминокислоты, заменимые для МЕМ, 100-х раствор (Панэко; Россия) 5 мл. Для определения изменений функциональности митохондрий и уровня митофагии в исследуемых культурах MEF в зависимости от времени культивирования последовательно проводили серию измерений митохондриального мембранного потенциала (ММП) методом проточной цитометрии с использованием MitoTracker Orange (Thermo Fisher Scientific; США) и экспрессии маркеров митофагии методом ПЦР-РВ с интервалом в 7 дней. Для измерения ММП отбирали по 100 тыс. клеток каждой культуры, отмывали от среды в PBS (Панэко; Россия), инкубировали с 100 нм MitoTracker Orange (возбуждение/эмиссия — 550/580) при 37 °С в течение 30 мин. Далее клетки отмывали от красителя с помощью центрифугирования при 300 g в течение 5 мин, затем ресуспендировали в свежем PBS, после чего производили измерение на проточном цитофлуориметре CytoFLEX (Beckman Coulter; США). Полученные результаты наносили на гистограммы, а число событий нормировали.

Уровень экспрессии мутантного варианта гена Polg в культурах MEF был определен методом ПЦР в реальном времени с использованием qPCRmix-HS (Евроген; Россия) и с помощью праймеров P9 и P10, а также флуоресцентных зондов P11 и P12, комплементарных нативному и мутантному вариантам гена соответственно.

В ходе культивирования MEF часть клеток (около 200 тыс.) каждой культуры еженедельно отбирали для выделения РНК реагентом ExtractRNA (Евроген; Россия), проведения реакции обратной транскрипции набором для обратной транскрипции MMLV RT kit (Евроген; Россия) и последующего определения экспрессии маркеров митофагии с использованием набора qPCRmix-HS SYBR (Евроген; Россия). В качестве маркеров митофагии были выбраны Map1lc3a, Lamp2, Pink1, Parkin и Nix [10]. Измерение проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью праймеров на референсный ген Hprt (P13 и P14) и на гены каждого маркера митофагии: Map1lc3a (P15 и P16), Lamp2 (P17 и P18), Pink1 (P19 и P20), Parkin (P21 и P22) и Nix (P23 и P24) (см. таблица). Все манипуляции с клеточными лизатами, РНК и кДНК проводили в соответствии с протоколами фирмы-производителя (Евроген; Россия). Экспрессию генов в каждой отдельной экспериментальной точке сравнивали с экспрессией референсного гена Hprt. Величину экспрессии считали по формуле 2^ΔCt, где Ct (cycle threshold) — это цикл амплификации, на котором флюоресценция достигает порогового значения; ΔCt = Ct(референсного гена Hprt) — Ct(исследуемого гена). Величину экспрессии каждого гена интереса в контрольных клетках в каждой экспериментальной точке принимали за единицу, далее рассчитывали относительную экспрессию каждого гена интереса во всех образцах культур Polg*CreCMV [11].

Далее оценивали влияние экспрессии мутантной формы гена Polg на функциональное состояние мышечной системы животных с системной экспрессией трансгена. В работе использованы гибридные мыши (CBA X C57BL/6) линии Polg*Cre-CMV, полученные нами ранее [8], а также гибридные мыши (CBA X C57BL/6) дикого типа (питомник «Столбовая»), по 5 мышей на группу, возраст — 3 месяца. Вес мышей линии Polg*Cre-CMV в среднем составлял 19,9 ± 2,2 г, мышей дикого типа — 22,7 ± 2,5 г. В эксперименте участвовали только самки. В процессе экспериментальной работы мышей содержали в виварии ЦКП ИБГ РАН в условиях постоянного доступа к воде и корму. Световой цикл — 12/12, температура воздуха — 23 ± 1 °C, влажность — 42 ± 5%. С животными обеих групп проводили тест «Натянутая проволока» и тесты на силу хвата. Тест «Натянутая проволока» проводили согласно протоколу [12] с модификациями (общее время на 10 попыток было ограничено и составило 300 с). Тест на силу хвата — согласно протоколу [13] с модификациями (вместо перекладины использовали решетку). Все животные были выведены из данных экспериментов методом цервикальной дислокации, их селезенка и тимус были исследованы в следующих экспериментах.

Далее была проведена косвенная оценка функционального состояния периферических Т-лимфоцитов путем измерения уровня экспрессии генов субъединиц ε и δ комплекса CD3, локализованного на поверхности лимфоцитов и участвующего в проведении сигнала от Т-клеточного рецептора, и ɑ-цепи Т-клеточного рецептора в тотальной популяции спленоцитов мышей Polg*Cre-CMV по сравнению с животными дикого типа. Была также оценена субпопуляция двойных негативных, двойных позитивных и однопозитивных CD4⁺- и CD8⁺-клеток тимуса и его абсолютная клеточность. Экспериментальных и контрольных мышей умерщвляли цервикальной дислокацией, ножницами разрезали брюшную стенку. Аккуратно вырезали селезенку и тимус, тщательно гомогенизировали ткани. Клетки селезенки лизировали, затем выделяли РНК, проводили реакцию обратной транскрипции с использованием реактивов и протоколов, описанных выше. Измерение уровня экспрессии генов Cd3δ, Cd3ε и Tcr-α проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью праймеров на референсный ген Hprt (P13 и P14) и на каждый маркер митофагии: Cd3δ (P25 и P26), Cd3ε (P27 и P28) и Tcr-α (P29 и P30). Относительную экспрессию рассчитывали по методике, приведенной выше. Одиночные клетки тимуса анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии в соответствии с протоколом [14]. Подсчет клеток тимуса осуществляли в камере Горяева.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программных пакетов Excel (Microsoft; США) и Statistica (Statsoft; Россия). Полученные данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка. Значимость полученных результатов оценивали с применением непараметрического однофакторного двухвыборочного анализа. Для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали U-критерий Манна–Уитни. Результаты считали достоверными при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все полученные культуры эмбриональных фибробластов были прогенотипированы (рис. 1А, Б). В двойных трансгенах Polg*Cre-CMV благодаря системной активации Cre-рекомбиназы происходит вырезание кассеты

STOP. Благодаря этому двойные трансгены Polg*CreCMV, помимо контрольного фрагмента, имеют в геноме только терминатор и фрагмент CMV. По результатам генотипирования были сформированы экспериментальная группа культур с генотипом Polg*Cre-CMV (восемь вариантов) и контрольная группа, представленная культурами с генотипами Polg (три варианта), Cre-CMV (три варианта) и дикого типа (четыре варианта) (далее — MEF Cntls).

Во всех вариантах культур был определен уровень экспрессии мутантного варианта гена Polg (рис. 1В). Показано, что мутантный вариант гена Polg экспрессируется только в клеточных линиях Polg*Cre-CMV. Различия в экспрессии мутантного варианта гена Polg между культурами Polg*Cre-CMV и контрольными культурами достоверны (p ≤ 0,05).

Результаты определения ММП в культурах MEF представлены на рис. 1Г. Согласно графику, ММП Polg*Cre-CMV достоверно снижается, начиная с 3-й недели культивирования, по сравнению с контрольными клетками (p ≤ 0,05).

Исследование профилей экспрессии различных маркеров митофагии в контрольных и экспериментальных культурах MEF продемонстрировало значительные различия между ними (рис. 2А–Д).

1. Экспрессия генов Pink1/Parkin, хорошо известных маркеров митофагии, постепенно повышается с течением времени (рис. 2А, Б), что коррелирует с предположением о росте количества дисфункциональных митохондрий [15].
2. Накопление случайных мутаций в геноме митохондрий, а вместе с тем нарушение окислительного фосфорилирования сопровождается гипоксией, которая в свою очередь ведет к повышению экспрессии гена Nix [16]. Экспрессия гена Nix резко повышается на третьей неделе культивирования, что может соответствовать накоплению продуктов нарушения энергозависимых процессов (рис. 2В). В процессе митофагии продукт гена Map1lc3a связывается с белком Nix, заякоренным во внешней мембране митохондрий, тем самым связывая ее с аутофагосомой. Кроме этого, он тоже выступает инициатором аутофагии [17]. Этим можно объяснить его резкий подъем на второй неделе культивирования и дальнейшую корреляцию с экспрессией гена Nix (рис. 2Г). Не вполне понятно, однако, снижение экспрессии маркеров Nix и Map1lc3a на четвертой и пятой неделях культивирования трансгенных MEF. По всей видимости, это связано с невозможностью элиминации значительного процента митохондрий в клетке (несмотря на их дефектность) из-за потери жизнеспособности в этом случае.
3. Белок Lamp2 является структурным компонентом лизосомной мембраны [18]. Экспрессия гена Lamp2 в экспериментальных культурах Polg*Cre-CMV превосходит его экспрессию в контрольных культурах в 2 раза уже на первой неделе культивирования и остается повышенной на протяжении всех оставшихся недель, что может говорить о повышенном количестве лизосом, необходимых для эффективной аутофагии (рис. 2Д).

Для проверки гипотезы о влиянии развития митохондриальной дисфункции на мышечную систему трансгенных животных Polg*Cre-CMV были проведены эксперименты по определению мышечной выносливости и силы хвата трансгенных животных Polg*Cre-CMV в возрасте 3 месяцев по сравнению с животными дикого типа. Результаты теста «Натянутая проволока» представлены на рис. 3А. Мыши дикого типа удерживались на проволоке в течение всего времени эксперимента и потеряли максимум 4 балла. При этом у мышей линии Polg*CreCMV происходило снижение времени удерживания на проволоке, мыши выбывали из эксперимента в среднем за 199 с. В эксперименте на силу хвата показано, что мыши линии Polg*Cre-CMV демонстрируют худший результат по сравнению с мышами дикого типа (рис. 3Б) и эти различия достоверны (p ≤ 0,05).

Для определения влияния экспрессии трансгена на жизнедеятельность периферических Т-лимфоцитов был установлен уровень экспрессии субъединиц ε и δ комплекса CD3 и ɑ-цепи Т-клеточного рецептора в тотальной популяции спленоцитов трансгенных животных Polg*Cre-CMV по сравнению с животными дикого типа. Оказалось, что экспрессия субъединиц ε и δ комплекса CD3 и ɑ-цепи Т-клеточного рецептора снижены у трансгенов Polg*Cre-CMV по сравнению с животными дикого типа (p ≤ 0,05) (рис. 4). Цитофлуориметрический анализ живых одиночных клеток тимуса не выявил изменений в относительном количестве субпопуляций двойных негативных, двойных позитивных и однопозитивных CD4⁺- и CD8⁺-клеток тимуса (рис. 5А, Б), однако его абсолютная клеточность оказалась достоверно сниженной у трансгенных животных Polg*Cre-CMV по сравнению с животными дикого типа (p ≤ 0,05) (рис. 5В).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Процесс развития митохондриальной дисфункции вследствие возникновения и накопления мутаций в митохондриальном геноме затрагивает практически все ткани и органы. Изменения в тканях, вызванные митохондриальными мутациями, начинают происходить уже во время эмбриогенеза. Мы показали, что в первичной культуре трансгенных эмбриональных фибробластов с генотипом Polg*Cre-CMV происходит развитие митохондриальной дисфункции на фоне экспрессии мутантной формы гена Polg в течение первых трех недель культивирования in vitro. При этом клетки контрольных культур не демонстрируют признаков развития патологии. Таким образом, можно заключить, что культуры MEF Polg*Cre-CMV представляют собой удобную in vitro модель для изучения митохондриальной дисфункции, вызванной накоплением мутаций в митохондриальном геноме вследствие экспрессии мутантной формы гена Polg.

Для нормального функционирования тканей и систем органов необходима эффективная работа митохондрий. Это актуально для иммунной системы и в особенности для мышечной [19, 20]. В нашей работе показано, что экспрессия мутантной формы гена Polg оказывает крайне негативное влияние на функциональное состояние мышечной системы животных с системной экспрессией трансгена, животные Polg*Cre-CMV демонстрируют значительное снижение мышечной выносливости и силы хвата по сравнению с контролем. Кроме того, экспрессия трансгена оказывает негативное влияние и на иммунную систему животных Polg*Cre-CMV: снижение уровня экспрессии субъединиц ε и δ комплекса CD3 и ɑ-цепи Т-клеточного рецептора косвенно свидетельствует о сниженной функциональности Т-лимфоцитов трансгенных животных. Результаты, полученные при исследовании тимуса трансгенных животных, позволяют сделать вывод об ускоренной инволюции этого органа без нарушения его основных функций. Эти результаты соотносятся с представлениями о влиянии накопления мутаций в митохондриальном геноме на развитие ускоренного прогероидного фенотипа [4]. Исходя из вышесказанного, можно заключить, что трансгенные мыши линии Polg*CreCMV с экспрессией трансгена тоже являются релевантной моделью для изучения развития митохондриальной дисфункции и ее последствий in vivo.

ВЫВОДЫ

Экспрессия мутантного варианта гена Polg приводит к увеличению уровня экспрессии маркеров митофагии и снижению уровня митохондриального мембранного потенциала в культуре эмбриональных фибробластов мышей Polg*Cre-CMV по сравнению с культурой эмбриональных фибробластов контрольных мышей.

Мышечная выносливость при проведении тестов «Натянутая проволока» и «Сила хвата» значительно снижена у мышей Polg*Cre-CMV по сравнению с контрольными животными. Экспрессия мутантного варианта гена Polg приводит к сниженной функциональности Т-лимфоцитов трансгенных животных линии Polg*Cre-CMV, а также к уменьшению клеточности тимуса, однако не влияет на его субпопуляционный состав. Можно заключить, что цель данного исследования достигнута в полном объеме, однако дальнейшая работа по изучению влияния экспрессии мутантного варианта гена Polg на другие органы и их системы еще не закончена. Полученные модели in vitro и in vivo приблизят нас к лучшему пониманию патогенеза митохондриальных дисфункций и позволят разработать подходы к терапии данных патологий, что является предметом дальнейших исследований.