Инсульт является второй по распространенности причиной смерти [1], ввиду чего исследования в области поиска эффективных фармакофоров для его лечения приобретают особенную актуальность. Разработка и внедрения фармацевтических средств — сложный и длительный процесс, требующий проведения обширных доклинических и клинических исследований. Оптимизация таких сценариев средствами математического моделирования с использованием информационно-компьютерных технологий представляет собой отдельную задачу научнопрактического характера.

Так, трансляционные алгоритмы исследований в области современной фармакологии являются неотъемлемой частью протоколов доклинических или клинических испытаний нового инновационного лекарственного средства. Однако этот момент, без сомнения, трактуется по-разному в странах с разными социальными/культурными традициями и с различными экономико-правовыми системами.

Некоторые инновационные фармакофоры на основе наночастиц находятся в центре внимания долгосрочных программ доклинических исследований, принятых Шанхайской организацией сотрудничества (ШОС) на период 2020–2025 гг. [2, 3]. Примечательно, что это региональное политико-экономическое объединение девяти стран (Китай, Россия, Иран, Индия, Пакистан, Казахстан, Узбекистан, Таджикистан, Кыргызстан) с общим бюджетом почти в 26,8 млрд долларов США в настоящее время обеспечивает поддержку текущих разработок в области оптимизации доклинических исследований за счет повышения роли и значимости моделей нанофармакологии in silico [3, 4].

Некоторые этические и экономические несоответствия между «западными» и «восточными» точками зрения на разработку, исследование и регистрацию новых лекарств [2, 3] выглядят как сигнал к изменению нашего отношения к этой проблеме в пользу in silico, чтобы сократить как затраты, так и продолжительность процесса на трансляционные исследования фармакофоров. Очевидно, что финансовые проблемы, связанные со здравоохранением, и существующие трудности [4] диктуют принимать осторожную позицию по ряду деликатных вопросов, связанных с трансляционной медициной. В то же время есть заслуживающий внимания опыт усилий по оптимизации доклинических исследований, предпринятых в странах Евразийского региона за последние пять–семь лет.

Так, недавние трансляционные проекты, контролируемые ШОС, охватывают текущие исследования нейропротекторного потенциала порфирин-фуллереновых наночастиц, высвобождающих ²⁵Mg²⁺. Примечательным аспектом этого является активное использование платформ in silico, предназначенных для анализа аллометрических данных и данных in vitro для прогнозирования численных значений и уровней изменчивости наиболее важных фармакокинетических и фармакодинамических параметров [5–7].

Хотя история фармакологических исследований эффектов парамагнитных изотопов металлов насчитывает почти 15 лет [4–11], некоторые свойства трех изотопов: ²⁵Mg, ⁴³Ca, ⁶⁷Zn — были признаны фармакологически привлекательными для их адресной доставки с использованием наноносителей на основе порфирина-C60 [8–11]. Принимая во внимание все вышесказанное, целесообразно использовать платформу in silico с соответствующими трансляционными сценариями [4, 5, 11, 12].

Модифицированные алгоритмы немарковской популяционной динамики наряду с вычислительными моделями на основе систем обыковенных дифференциальных уравнений (ОДУ) эффективны для прогнозирования селективного накопления клетками головного мозга вышеупомянутых изотопов двухвалентных металлов (²⁵Mg, ⁴³Ca, ⁶⁰Co, ⁶⁷Zn), высвобождающихся из порфиринфуллереновых наночастиц (РМС16) [3].

Целью исследования была разработка препаратоориентированной математической модели в виде системы ОДУ, реалезация ее in silico в виде программного кода на языке MATLAB и адаптация к экспериментальным данным, полученным in vivo на крысах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

In silico исследование

Система обыкновенных дифференциальных уравнений (1), лежащая в основе математической модели, реализованной in silico была получена аналитическим путем на основе опубликованных данных биомедицинских исследований и собственных экспериментов in vivo по изучению влияния наночастиц (НЧ) порфирин-фуллерена, высвобождающих ²⁵Mg²⁺ на патогенез ишемического инсульта головного мозга, и смоделирована на языке MATLAB в среде MATLAB / SIMULINK версии 2021b. Для решения системы дифференциальных уравнений применяли метод Рунге–Кутта среднего порядка с использованием решателя ode45. T_1/2 = 9,0 ч, T_max = 25 ч, С₀ = 62 мкг/мл.

Для изучения поведения модели в пространстве параметров применяли теорию нелинейных динамических систем и использовали метод, известный как «параметрический анализ» (или «бифуркационный анализ» в синергетике) [14]. Метод эффективен для изучения сложных нелинейных процессов в неравновесных системах различного типа: физических, химических, социальных, биологических и др. по их математическим моделям в парадигме вычислительного эксперимента [14].

Для этого использовали адекватные экспериментальным данным in vivo параметры и по пятикомпартментному принципу построили математическую модель в виде системы ОДУ, которая после приведения к задаче Коши численным методом была переведена в машинный код и далее исследована методом параметрического анализа неравновесных процессов и систем на соответствие имеющимся экспериментальным данным.

Методом параметрического анализа [14] изучали поведение модели с различными динамическими комбинациями параметров для проверки степени валидности и адекватности предложенной in silico платформы и потенциала ее использования для решения фармакокинетических задач и перспективах применения для оптимизации алгоритмов доклинических исследований.

Эксперимент in vivo

Наночастицы

Водорастворимые образцы PMC16-RX были любезно предоставлены доктором Н. Амиршахи, Технологический университет имени Амира Кабира, Тегеран, Иран.

Животные

30 особей крыс-самцов Wistar Albino Glaxo (БиоПитомник СТЕЗАР; Владимир, Россия) весом 180–220 г содержали на стандартной витаминизированной диете. Животные голодали в течение 24 ч перед экспериментом. Использовали три крысы на экспериментальную точку, проводили 5–6 повторений для каждого измерения. Все манипуляции с животными (включая вывод из эксперимента) проводили в соответствии с arrive guidelines. Введение наночастиц

Наночастицы НЧ в концентрации 1,0 мг/кг и/или 20,0 мг/кг вводили крысам в виде однократной внутривенной инъекции. В качестве растворителя использовали 15 мм Трис-HCl (рН 7,80). Животных обезглавливали через 12 ч после инъекции, образцы ткани мозга гомогенизировали в 5–7 объемах 20 мM Трис–HCL (рН 8,0) / 10 мМ MgCl2 / 1,5 мМ NaCl / 2,0 мМ EDTA / 25 мМ сахароза/ 2,0% Triton X-100 (в/в). Использовали тефлон-стеклянный гомогенизатор Поттера 1800 об./мин (+4 °C).

Фракционирование гомогената ткани головного мозга

Для выделения фракции цитозоля (S125) тщательно промытые гомогенаты подвергали ультрацентрифугированию при 125 000 g, 4 ч, +4 °C, ультрацентрифуга Spinco L5-65B (Beckman; США), ротор SW 27.1. Супернатанты(S125) отбирали, измерения содержания белка проводили обычным колориметрическим методом Брэдфорда.

Образцы S125 смешивали с 10 объемами ледяного ацетона с последующей инкубацией в течение ночи при +4 °C. Осадки отделяли центрифугированием при 20 000 об./мин, 20 мин, +4 °C и отбрасывали. Супернатанты собирали для дальнейшего использования в УФ-спектрофотометрии и в исследованиях CZE.

Для оценки степени экстрагируемости НЧ из биоматериала ацетон-нерастворимые просушенные при 25 °C осадки растворяли в 15 мМ сульфата аммония (рН 8,80) / 0,1% SDS / 2,5 мМ ЭДТА-Na / 1,0%

2-меркаптоэтанол (20 : 1, v/w) с последующей ультразвуковой обработкой раствора при 60 KHz при 40 °C в течение 60 мин. Затем образцы анализировали с помощью нашей методики CZE (см. ниже).

Модель ишемического инсульта in vivo

Использовали рутинную модель окклюзии средней церебральной артерии крыс, которую достигли введением филамента, как описано ранее [15].

Оригинальная методика капиллярного зонального электрофореза (CZE)

Ацетон-растворимые экстракты S125 концентрировали в  роторном испарителе, доводя объем образцов до 0,2–0,3 мл, и затем добавляли к полученному концентрату 30 мМ фосфата аммония (рН 8,80), 25 : 1, v/v. 10 мкл этого образца инъецировали в приемник аналитической системы P/ACE MDQ Plus CZE (ALIGIMED; Республика Беларусь), снабженной онлайн-детектором фракций UV-VIS 770 KS с монохроматическим фильтром 440 нм (Prince Technologies; Нидерланды).

CZE-процесс инициировали и осуществляли в течение 10 мин при +6 °C в кварцевом капилляре с размерами 50 мкм (диаметр) × 75 мм (эффективная длина), содержащим UV-транспарентный силикагель, насыщенный электролитом SJX40 с pH 8,0 (SCLEX, BV; Нидерланды).

Режим фракционирования: 115 V / 60 Hz / 300 W / капилляр. Блок планиграфического/временного анализа данных DAX DATE 220 LK (SCIEX BV; Нидерланды). Данные калибровки, осуществленной конвенциальным способом с использованием внутреннего стандарта по алгоритму, рекомендованному производителем аналитической системы (ALGIMED; Республика Беларусь), представлены в табл. 1.

Фармакокинетические кривые распределения РМС16 по органам представлены ниже. Доверительные интервалы рассчитывались по методу Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу нашей модели положено распространенное представление, согласно которому наноагент с кровотоком распространяется по организму, попадая в сердце, печень и мозг, и далее выводится путем естественной элиминации. При этом в зоне воспаления, сопутствующей ишемическому инсульту, происходит интенсивное накопление наноагента вследствие увеличения «пористости» сосудистого русла в связи с увеличением расстояния между эпитэлиальными клетками, формирующими сосудистые стенки. Модель представлена системой обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ) (1) и схематично показана на рис. 1.

В системе ОДУ (1) C_b, Cl, C_h, C_is, C_br, — концентрации наноагента в крови, печени, сердце, межклеточном пространстве головного мозга, клетках мозга. Компартмент «межклеточное пространство» был добавлен в рассмотрение, поскольку молекулы наноагента проникают через гематоэнцефалический барьер, непроницаемый в здоровой области мозга. Константа K_is настраивается в зависимости от величины поражения мозга. Чем больше область воспаления, тем больше значение константы.

K_e — константа элиминации наноагента. Остальные константы отражают скорость перехода молекул наноагента из одного компартмента в другой. Несложно заметить, что в сумме система дает только член K_eC_b, т. е. наноагент полностью выводится из организма. Вывод наноагента через печень для упрощения тоже введен в K_e, однако на метаболизм требуется время, что и отражают соответствующие печени константы.  

формула

Зная время полувыведения T_1/2 [5], можно оценить константу элиминации K_e как ln2/T_1/2.

Нами смоделировано однократное в/в введение вещества в дозе 0,2 мг/мкг. Известно, что для равномерного распределения фармакофора из места ввода по организму требуется время, но для упрощения расчетов диффузия не включена в модель, т. е. считается, что сразу же после введения концентрация наноагента одинакова в каждой точке.     

Результаты расчета по модели в сопоставлении с данными наших экспериментов in vivo представлены на рис. 2.

In silico были промоделированы 24 ч пребывания фармакофора в организме, что представляет собой наиболее выраженный период развития ишемического инсульта. При увеличении параметра K_h+ пик концентрации фармакофора в миокарде сдвигается влево и увеличивается. Согласно некоторым данным [16], концентрация фармакофора в печени быстро образует пик (в первый час) и так же быстро снижается, т. е. константа вывода из печени больше, чем константа поглощения. Однако K_l+ меньше, чем K_h+. При уменьшении константы вывода K_l– сильно растет пик концентрации фармакофора. Константы, описывающие обмен фармакофора с мозгом, требуют дополнительных данных для своей оценки, однако из рис. 2 видно, что идет накопление фармакофора и концентрация его в тканях головного мозга количественно ниже, чем в печени и миокарде, что согласуется как с литературными данными [16], так и с данными, полученными нами in vivo в  экспериментах на лабораторных животных.

На рис. 2 представлены расчетные и экспериментальные фармакокинетические кривые распределения РМС16 в головном мозге, печени и сердце. Расчетные кривые (показаны черным) имеют классическую форму и численно укладываются в доверительные интервалы экспериментальных данных, полученных нами in vivo на крысах, что доказывает адекватность математической модели натурному эксперименту.

Таким образом, экспериментально показано, что РМС16 преодолевает гематоэнцефалический барьер и проникает в клетки головного мозга, подвергнувшиеся ишемии, доставляя туда ²⁵Mg²⁺, стимулирующий гиперсинтез АТФ и способный служить перспективным нейропротектором. При этом количественное содержание фармакофора в головном мозге, сердце и печени различается. Такие же результаты демонстрирует и наша in silico модель, что подтверждает ее прогностический потенциал и перспективы применения для оптимизации алгоритмов доклинических исследований порфирин-фуллереновых нанокатионитов как потенциальных нейропротекторов.

Распределение НЧ РМС16 по сегментам пораженной ишемией области головного мозга представлено в табл. 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Решение фармакокинетической задачи для порфиринфуллереновых наноагентов в целях оптимизации алоритмов доклинических исследований возможно in silico в парадигме вычислительного эксперимента [17, 18]. При этом следует моделировать не только фармакокинетику (ФК) (т. е. доставку фармакофора в выделенный орган), что сделано в настоящей работе для РМС16, но и фармакодинамику (ФД) или, иными словами, динамику достижения терапевтического эффекта воздействия фармакофора на развитие исследуемой патологии. А это значит, что помимо модели самого заболевания (в нашем случае ишемического инсульта) необходимо иметь модель фармакокинетики исследуемого фармакофора и модель его фармакодинамического воздействия. Речь идет о комплексной ФК/ФД модели как перспективе наших дальнейших исследований в направлении in silico.

Такие исследования осложняются не только недостатком в литературе релевантных описаний математических моделей ишемического инсульта, подходящих для этой цели, но и отсутствием фармакокинетических моделей, инновационных фармакофоров, фармакокинетика которых может иметь ярко выраженный препаратоспецифичный характер, особенно когда идет речь об их адресной доставке. Бурно развивающаяся отрасль нанофармакологии предлагает ряд таких наноагентов, фармакокинетика которых отличается от традиционных лекарств, но в то же время перспективы применения их в качестве нейропротекторов трудно переоценить [19].

Все вышесказанное непосредственно относится к линейке отечественных фармакофоров РМС16, перспективы применения которых к терапии ишемического инсульта оценены чрезвычайно высоко. В основе их действия лежит фундаментальное открытие магнитоизотопного эффекта ^[1]Mg²⁺. Доказано, что магнитный изотоп магния ²⁵Mg²⁺ является гиперактиватором большинства Mg-зависимых реакций синтеза АТФ в клетке, причем гиперактивация энергетического метаболизма ионами Mg²⁺ требует незначительного количества этих ионов и имеет место даже при отсутствии кислорода (глубокая тканевая гипоксия) [16], в связи с чем и был предложен РМС16 — фармацевтический наноагент, основанный на порфирин-содержащем фуллереновом «шаре» C60 (порфиллерен-MC16) [20, 21].

Основным ключевым моментом экспериментальной проверки такой парадигмы in silico, как наша, является доказательство как проницаемости ГЭБ, так и интрализации клеток головного мозга в отношении наночастиц PMC16. Эта задача была решена (рис. 2; табл. 1 и табл. 2). Примечательно, что участки тканей, поврежденные мозговым инсультом, тоже были доступны для PMC16 (табл. 2).

Таким образом, относительно низкий «уровень массового количества» интрализации NP в клетках мозга крыс (табл. 1) может не иметь ничего общего с ожидаемым фармакологическим воздействием агента, поскольку последнее в любом случае будет обусловлено чрезвычайным перепроизводством АТФ, т. е. прямым и неизбежным результатом феномена ²⁵Mg²⁺ — MIE. Излишне подчеркивать, что сама по себе интрализация фармакофора является истинным приоритетом в передовых исследованиях фармакокинетики.

Простое одноэтапное ультрацентрифугирование гомогенатов тканей млекопитающих, обычно предварительно обработанных Triton X-100 (105 000–150 000 г), обеспечивает надежное отделение цитозоля от клеточных органелл, а также от рибосом, рибосомных субъединиц и мембранных дебри. Таким образом, фракция S125, представляющая собой раствор соединений общей цитоплазмы, является идеальным материалом для использования в исследованиях по интрализации лекарственных фармакофоров в клетках [3, 4, 10].

Хотя представленные результаты выглядят вполне самодостаточными, следует отметить, что разрешение и чувствительность нашей процедуры CZE достаточно хороши, чтобы определить низкий, но определяемый уровень поглощения PMC16-RX мозгом крыс, оцениваемый в 4,0–8,0 нг на 1,0 мг общего белка S125. Это количество НЧ можно обнаружить через 12 ч после однократной внутривенной инъекции средства. A данные калибровки CZE/PMC16-RX находятся за пределами (табл. 1). Таким образом, проникновение через гематоэнцефалический барьер для тестируемых ксенобиотиков было четко показано (табл. 1, табл. 2).

ВЫВОДЫ

Представленная модель in silico описывает фармакокинетику наночастиц РМС16 как перспективных нейропротекторов применительно к терапии ишемического инсульта. Распределение РМС16 по органам и тканям описана математически в формате пятикомпартментной модели, представленной системой ОДУ и реализованной на РС. Настройку модели на особенности биологических объектов можно осуществить изменением численных значений констант в соответствии c данными экспериментов in vivo. Модель согласуется как с имеющимися литературными данными, так и с данными экспериментов на лабораторных животных и может быть использована для оптимизации сценариев доклинических исследований медицинских нанокатионитов РМС16 в качестве нейропротекторов при терапии ишемического инсульта.