Pseudomonas aeruginosa является одним из ключевых оппортунистических патогенов [1]. Особую угрозу для пациентов несут карбапенемрезистентные штаммы P. aeruginosa, именно поэтому они были включены в Лист приоритета ВОЗ («WHO priority list for R&D of new antibiotics for antibiotic-resistant bacteria») в качестве критически опасных патогенов первого уровня приоритета [2]. Карбапенемрезистентность может формироваться двумя путями. Первый путь реализуется за счет приобретения генов резистентности из внешних источников путем горизонтального переноса. Этот механизм устойчивости, часто называемый «plasmid-borne resistance», обеспечивает высокие уровни резистентности, и его изучение более популярно среди исследователей. Главной молекулярной основой карбапенемрезистентности, передаваемой горизонтально, являются энзимы — разнородные бета-лактамазы разных Ambler классов, объединенные по функциональному принципу в группу карбапенемаз. Однако существует и второй тип формирования карбапенемрезистентности, не связанный с горизонтальной передачей генов. Он базируется на уникальном адаптационном потенциале P. aeruginosa и реализуется за счет мутационной изменчивости хромосомных генов [3]. Среди клинических изолятов наиболее яркие примеры мутационной антибиотикорезистентности демонстрируют штаммы P. aeruginosa, выделенные у пациентов с муковисцидозом. Описаны высокорезистентные штаммы, имеющие более 60 поврежденных мутациями генов, которые могут быть причиной формирования устойчивости к разным классам антибиотиков [4]. Из них 26 мутировавших генов могли быть причиной карбапенемрезистентности.

Исследование разнообразия мутаций, возникающих в процессе адаптации P. aeruginosa к карбапенемам, представляет интерес для прогнозирования эволюции карбапенемрезистентности среди клинических изолятов. Механизмы мутационной карбапенемрезистентности анализируют при помощи двух методологических подходов: 1) изучения генетических и фенотипических свойств клинических карбапенемрезистентных изолятов; 2) направленного моделирования карбапенемрезистентности in vitro при контакте P. aeruginosa с антибиотиком.

Цель настоящей работы — описать разнообразие и закрепление мутаций, ассоциированных с формированием карбапенемрезистентности в процессе адаптации P. aeruginosa к повышающимся концентрациям меропенема.

Чаще направленное получение резистентных штаммов P. aeruginosa моделируют при помощи серии последовательных трансферов бактерий в жидких питательных средах, содержащих антибиотик в восходящей концентрации от 0 мкг/мл до концентраций, превосходящих минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в десятки и сотни раз [5]. Мы использовали другую модель [6], которая базировалась на эволюции подвижных бактерий в градиенте повышающихся концентраций антибиотика. Такой подход позволяет изолировать большее количество клонов с различными генотипами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служил референсный штамм P. aeruginosa ATCC 27853, который используют в качестве стандарта чувствительности к карбапенемам (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). EUCAST Clinical Breakpoint Tables v. 12.0. Available at: www. eucast.org).

Исследование проводили на основе пространственно- временной модели формирования резистентности подвижных бактерий к антибиотикам, методика которой подробно описана ранее [7]. В емкости размером 20,0 × 40,0 см создавали пять разделенных перегородками отсеков глубиной 2,0 см и заполняли их плотной питательной средой на основе бульона Луреа–Бертани (LB Miller, Becton Dickinson and Co.; США). Среда в отсеках содержала меропенем (Supelco® Analytical Products, Merck & Co. Inc.; США) в последовательных концентрациях 0, 0,2, 20, 200, 2000 мкг/мл. Поверх отсеков наслаивали единый слой не содержавшей меропенема плотной питательной среды (высота примерно 0,6 см) на основе бульона Луреа–Бертани. Сверху наслаивали слой полужидкого агара (содержание агара 0,28%) на основе бульона Луреа–Бертани без меропенема, высота слоя составляла примерно 0,8 см. Перед началом эксперимента культуру P. aeruginosa адаптировали к полужидкой питательной среде по ранее описанной методике [7].

Для посева использовали суспензию бактерий, стандартизованную по оптической плотности до 0,5 ед. по МакФарланду. Посев производили путем укола в полужидкий агар на глубину примерно 1–2 мм в секторе А (рис. 1).

Каждые 24 ч с фронта распространения P. aeruginosa отбирали образцы и пересевали на агар Мюллера–Хинтона (Becton Dickinson and Co., США.) для накопления биоматериала с целью последующего изучения фенотипических свойств (профиль антибиотикорезистентности) и изменений бактериального генома.
Оценку чувствительности изолятов к меропенему выполняли путем определения МИК двумя способами:
1) при помощи е-тестов (эпсилометрический метод) с меропенемом согласно рекомендациям фирмы- изготовителя (BioMerieux SA; Франция);
2) при помощи метода дилюции антибиотика в агаре [8]. Значения МИК не интерпретировали с клинических позиций и проанализировали исключительно с позиций их динамики.

Через 240 ч после начала эксперимента оценивали остаточную концентрацию меропенема в полужидком агаре методом ВЭЖХ по известной методике [9].

Бактериальную ДНК выделяли из суточных культур изолятов P. aeruginosa, выращенных на агаре Мюллера–Хинтона (Becton Dickinson and Co., США), с использованием наборов QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen; Германия) по протоколу фирмы-производителя. Образцы ДНК хранили при –20 °C. Для подготовки библиотек геномной ДНК применяли ультразвуковую фрагментацию (Covaris; США) бактериальной ДНК (400 нг) с последующей репарацией концевых последовательностей и лигированием адаптеров MGI Tech, Китай). Для очистки ДНК-библиотек использовали магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, CШA). Концентрацию бактериальной ДНК и ДНК- библиотек измеряли при помощи прибора Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific; США). Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе MGISEQ-2000 (MGI Tech, Китай). Длина прочтений составляла 250 пар оснований. Оценку качества проводили с использованием программ FASTQC (Babraham Institute; Великобритания) и Trimmomatic v.0.38 (Usadel Lab; США). Сборку геномов de novo осуществляли с использованием программы SPAdes 3.14 [10]. Для контроля полноты сборки и исключения возможности контаминации использовали веб-сервер Contest16S. Качество сборки оценивали при помощи QUAST 5.0 [11]. Геномы аннотировали с помощью сервера RAST [12] и программы Prokka [13].

Для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) осуществляли картирование коротких ридов на референс при помощи программы Snippy [14]. В качестве референсного генома использовали геном «нулевого» изолята, т. е. изолята, который был получен после адаптации штамма P. aeruginosa ATCC 27853 к полужидкому агару и который использовали для старта эксперимента. Для аннотации выявленных вариантов и предсказания их влияния на гены применяли программу SnpEff [15].

При помощи инструментов BLASTn (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi) в геномах всех полученных изолятов были проанализированы гены и последовательности аминокислот в их продуктах. Для анализа детерминант резистентности использовали также сервисы ResFinder и алгоритм AMRFinderPlus, входящий в NCBI Pathogen Detection pipeline [16, 17].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Динамика продвижения P. aeruginosa по поверхности полужидкого агара в направлении повышения концентрации меропенема показана на рис. 1. За 168 ч (7 суток) граница роста P. aeruginosa достигла зоны с максимальной концентрацией меропенема, в течение 240 ч (10 суток) был получен рост на всей площади питательной среды. Концентрация меропенема в секторе E полужидкого агара (рис. 1) в конце эксперимента составляла 56 мкг/мл.

В ходе эксперимента с фронта распространения P. aeruginosa было отобрано 92 изолята. Уровни резистентности к меропенему изолятов росли по мере продвижения бактерий в направлении увеличения концентрации меропенема (рис. 2). Повышение МИК от 0,5 мкг/мл до 2, 4 и 8 мкг/мл наблюдалось уже через 72 ч от начала эксперимента. Изоляты с МИК = 16 мкг/мл и МИК = 32 мкг/мл появлялись через 144 ч, МИК = 64 мкг/мл — через 216 ч. МИК меропенема > 8 мкг/мл был зарегистрирован у 61 изолята, МИК ≥ 32 — у 45 изолятов.

Несинонимичные мутации были выявлены в 11 генах, включая oprD, pbuE, nalD, nalC, spoT, mlaA, mexD, mexR, oprM, mraY, pbp3. В четырех из 92 (4,3%) геномов мутации в этих генах не были обнаружены, данные геномы принадлежали изолятам, полученным в первые 48 ч роста. В остальных 88 из 92 (95,7%) геномов были обнаружены различные комбинации поврежденных мутациями генов (табл. 1). Наиболее часто повреждались гены oprD, pbuE, nalD (табл. 2). Мутации в генах nalD, spoT, mlaA, mexR, mraY, pbp3 ассоциировались с высокими уровнями резистентности несущих их изолятов, МИК меропенема которых был >8 мкг/мл (табл. 2). Мутации в гене oprM, напротив, были обнаружены лишь у четырех из 92 (4,3%) штаммов с МИК меропенема < 8 мкг/мл. Среди 84 штаммов с мутациями oprD было найдено четыре высоко чувствительных изолята с МИК меропенема от 0,5 до 2 мкг/мл. У этих изолятов oprD-мутации в трех случаях приводили к заменам L292Q, L252P, G307D и в одном случае — к преждевременному обрыву синтеза белка (W138stop). Наиболее распространенным был генотип с сочетанием мутаций в генах oprD, pbuE, nalD (табл. 1).

Динамика появления мутаций на разных сроках отбора материала представлена в табл. 2. Самыми первыми стойкие мутационные изменения возникали в генах oprD и pbuE через 72 ч от начала эксперимента. Мутация в гене pbuE, приводящая к замене A261D, была представлена единственным вариантом и равномерно сочеталась с различными вариантами других мутаций у 77 из 92 (83,7%) изолятов. Мутации в гене oprD были представлены девятью вариантами. Однако у большинства изолятов с мутациями в oprD (73 из 84; 86,9%) были найдены только два варианта мутаций, приводящих к заменам G307D (oprD-G307D) и L238P (oprD-L238P). Другие семь вариантов oprD-мутаций были относительно редкими и обнаружены у 11 из 84 (13,1%) изолятов с мутированными oprD-генами. Таким образом, первоначальный штамм разделился на два клона — oprD-G307D и oprD-L238P (рис. 2). Штамм, являющийся прямым родоначальником клона oprD-G307D, появился через 96 ч эксперимента и имел МИК = 2 мкг/мл меропенема. Штамм, являющийся прямым родоначальником клона oprD-L238P, не был изолирован в ходе эксперимента, гипотетически он появился на сроках до 120 ч от начала эксперимента. Эволюция главных клонов oprD-G307D и oprD-L238P была связана с уменьшением их чувствительности к меропенему (рис. 2) и накоплением мутаций в других генах, значимых для развития карбапенемрезистентности.

Начиная с 144 ч эксперимента среди штаммов клона oprD-G307D появились изоляты с мутацией в гене nalD, приводящей к замене G172D. К концу эксперимента 14 из 34 штаммов клона oprD-G307D являлись носителями этой мутации.

Клон oprD-L238P был связан с другими мутациями в гене nalD, приводящими к заменам T11N (24 из 39 изолятов клона) и H56P (4 из 39 изолятов клона). Делеция в гене mlaA (5 п.о. del (423–427 нуклеотиды)), приводящая к сдвигу рамки считывания, тоже присутствовала только у изолятов (11 из 39) из клона oprD-L238P. Во всех случаях делеция в гене mlaA сочеталась с наличием T11N-мутации в гене nalD.

Мутации в генах mexR, oprM, mraY, pbp3, nalC были обнаружены у единичных изолятов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Обсуждая фенотипические признаки адаптации P. aeruginosa к меропенему, следует акцентировать внимание на скорости формирования резистентности. Уже через шесть суток уровни резистентности отдельных изолятов, полученных на этом сроке, достигали МИК = 32 мкг/мл меропенема. Максимальные значения МИК меропенема составляли 64 мкг/мл и в 128 раз превышали значения МИК, которые регистрировали у изолятов, полученных в первые 48 ч эксперимента. Факт обнаружения изолятов с МИК = 32 мкг/мл в зоне с фактическим содержанием меропенема 56 мкг/мл можно объяснить различием между условиями определения МИК референсными способами (эпсилометрический метод и методом дилюции в агаре) и условиями эксперимента (питательная среда, время культивирования).

Возникновение мутаций в генах было зарегистрировано одновременно с ростом МИК меропенема у отдельных штаммов на сроке 72 ч. На всем протяжении эксперимента было найдено 11 подвергшихся мутациям генов. Из них только для генов oprD, nalC, nalD, mexD, mexR и pbp3 ранее были доказаны связи с карбапенемрезистентностью [18–21]. О роли генов oprM, pbuE, spoT, mraY, mlaA в формировании антибиотикорезистентности ранее не сообщалось, что не исключает их косвенного влияния на процесс адаптации к карбапенемам.

Рассматривая мутационную картину в целом, следует обратить внимание на феномен клонирования. На сроках 72–96 ч возникли две главные клональные линии. Все представители одной из них несли мутацию в гене oprD, приводящую к замене G307D. У всех представителей другой линии мутация в oprD приводила к замене L238P. Внутри сформировавшихся клонов возникали и частично закреплялись новые мутации, которые вели к росту фенотипического уровня устойчивости к меропенему. Наряду с этими линиями возникали единичные клоны с другими мутациями oprD, которые не демонстрировали прогрессивного распространения, хотя у некоторых из них МИК меропенема был выше, чем у окружающих представителей oprD-G307D и oprD-L238P клонов (рис. 2). Вероятно, мутации у неуспешных, но высокорезистентных клонов были фактором, негативно влияющим на итоги внутривидовой конкуренции. Следует отметить, что повреждение oprD у меропенемрезистентных изолятов P. aeruginosa наблюдается не только в эксперименте. Так, пять из шести высокорезистентных (МИК > 32 мкг/мл) к меропенему штаммов P. aeruginosa, обнаруженных при муковисцидозе и не продуцирующих карбапенемазы, несли мутации в генах oprD [4]. Вместе с тем, поломки одного гена oprD недостаточно для формирования резистентности к меропенему. Даже штамм с нонсенс-мутацией (стоп-кодон W138stop) в гене oprD сохранял высокую чувствительность к меропенему. Для формирования устойчивости необходима аккумуляция хромосомных мутаций во многих хромосомных генах, прямо или косвенно влияющих на чувствительность к антибиотикам.

Мы не исключаем того, что некоторые изоляты с уникальным генотипом не были отобраны в ходе эксперимента и информация о них была утрачена. Примером этого служит неясность в отношении родоначальника клона oprD-L238P, являющегося промежуточным звеном между высокочувствительными и высокорезистентными штаммами. Однако в отличие от эволюции в жидкой среде пространственно-временное моделирование резистентности позволяет изолировать большее число клонов и избежать потери информации о возможных мутациях, приводящих к резистентности.

ВЫВОДЫ

Формирование высоких уровней резистентности к меропенему у P. aeruginosa в эксперименте происходит в короткие сроки (6 суток). Эволюция резистентности сопряжена с процессом клонирования, при котором происходит возникновение множества клонов с различными генотипами. Основой клонирования является мутагенез, в который вовлечены 11 генов, включая oprD, pbuE, nalD, nalC, spoT, mlaA, mexD, mexR, oprM, mraY, pbp3. Часть образовавшихся клонов, независимо от уровня их резистентности к меропенему, не получают прогрессивного развития и вытесняются более успешными клонами. Использованная в эксперименте модель является удобным инструментом для получения набора вариантов с разными генотипами резистентности.