Линия HaCaT (спонтанно иммортализованные неканцерогенные кератиноциты человека) получила широкое распространение в качестве модели для изучения функций нормальных кератиноцитов человека [1, 2]. Однако в кератиноцитах линии HaCaT нарушены программа стратификации и экспрессия маркеров дифференцировки [3].
Известно, что в геноме кератиноцитов HaCaT присутствуют два аллеля гена TP53 (H179Y и R282Q), которые содержат две gain-of-function (GOV) мутации, приобретенные в результате спонтанной иммортализации (mutTP53) [4]. MutTP53 в клетках линии HaCaT обладает выраженной активностью в отношении увеличения скорости пролиферации и роста клеток и имеет более 7000 сайтов связывания с ДНК. При этом связанные с запуском апоптоза функции белка сохранены [5]. Известно, что мутантный р53 действует как минимум двумя путями: влияет на функцию p63/p73, ингибируя их связывание с ДНК [6], или сам связывается с новыми сайтами ДНК, взаимодействуя с другими транскрипционными факторами (NF-Y, E2F1, NF-KB, VDR, p63) [7, 8].
Среди базовых физиологических характеристик клеток линии HaCaT наибольший интерес представляют: пролиферация, миграция, стратификация и образование трехмерных органотипических структур.
Ранее нами показано, что изменение активности mutp53 в клетках HaCaT приводит к изменению экспрессии маркеров дифференцировки (в частности, каспазы 14, инволюкрина и трансглутаминазы-1) и сопровождается изменением экспрессии p63 [9].
Понимание особенностей физиологии клеток НaCaT и лежащих в их основе молекулярных механизмов необходимо для оценки ограничений при использовании таких клеток в качестве модельных. Кроме того, изучение клеток с mutTP53 позволяет получить новые данные для исследования канцерогенеза [10, 11].
Целью исследования было изучить особенности изменения миграционной способности клеток HaCaT при нокауте гена mutTP53.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и условия культивирования

Клеточная линия HaCaT была приобретена в коллекции клеточных культур German Cancer Research Center (DKFZ, Heidelberg; Германия). Клеточная культура кератиноцитов HaCaT с нокаутом mutTP53 (dp53) была получена ранее [13]. Клетки культивировали при 37 ^оС и 5% СО₂ в среде DMEM/F12 (1:1, Gibco; США) с добавлением 1% GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific; США), раствора пенициллина/стрептомицина в объёме 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно (Gibco; США) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Диа-М»; Россия).
Клеточная культура нормальных кератиноцитов человека (NHK, пул из пяти доноров) приобретена в ООО НПО Перспектива (Новосибирск, Россия). Клетки культивировали при  37 ^оС и 5% СО₂ в среде Keratinocyte SFM (Gibco; США), содержащей 1% GlutaMAX (Gibco; США), 1% антибиотика/антимикотика (Gibco; США), 50 мкг/мл BPE (Gibco; США), 10 нг/мл EGF (Gibco; США).
Клетки выращивали в культуральных флаконах площадью 25 см² или в чашках Петри диаметром 60 мм (Corning; США). Среду заменяли на свежую каждый второй день культивирования.

Анализ клеточного цикла

Клеточный цикл исследовали по включению Edu (Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488; ThermoFisher, США) и количеству ДНК по окраске Propidium Iodide (PI) (Sigma; США). Клетки рассаживали в лунки шестилуночного планшета и культивировали до достижения 50% конфлюента. Затем клетками добавляли Edu и производили окраску согласно рекомендациям производителя. Инкубировали с раствором РНКазы 100 мкг/мл и PI 1 мкг/мл в течение 30 мин. Детекцию производили с помощью проточного цитофлуориметра ZE5 (Bio-Rad; США) и программного обеспечения Everest 2.4.0.1365 (Bio-Rad; США).
Высоко позитивное окрашивание по Edu характерно для клеток, находящихся в S-фазе. Высоко позитивное окрашивание по PI характерно для клеток с удвоенным количеством ДНК, находящихся в G₂/M-фазе клеточного цикла.

Сравнение скорости пролиферации клеток

Сравнения скорости пролиферации клеток линии HaCaT дикого типа (WT) и с нокаутом mutTP53 (dp53) проводили с помощью CytoTrace Red CMTPX (AAT Bioquest; США).  Клетки рассаживали в лунки шестилуночного планшета и культивировали до достижения 50% конфлюента. Затем клетки окрашивали CellTracer (согласно рекомендациям производителя), культивировали в течение 24 ч. Детекцию производили с помощью проточного цитофлуориметра ZE5 (Bio-Rad; США) и программного обеспечения Everest 2.4.0.1365 (Bio-Rad; США). Уменьшение интенсивности флуоресценции (разбавление метки) отражает количество клеточных делений.

Scratch-тест: оценка скорости зарастания дефекта монослоя клеток

Для проведения scratch-теста в лунки 24-луночного планшета вносили по 50 тыс. клеток HaCat дикого типа (WT), с нокаутом mutTP53 (dp53) или нормальные кератиноциты человека (NHK) и преинкубировали в полной культуральной среде при 37 °С и 5% СО₂ до образования монослоя в лунке. Затем наносили стандартизованное повреждение монослоя с помощью пластмассового скребка, промывали клетки раствором DPBS и культивировали далее в полной культуральной среде в течение трех суток. Каждую лунку фотографировали по всей длине повреждения ежедневно. Обработку фотографий проводили с использованием библиотеки skimage [12]. Вычисляли площадь, не занятую клетками (площадь дефекта) через 0, 24, 48 и 72 ч после нанесения дефекта и находили соотношение по сравнению с начальной площадью дефекта (относительная площадь дефекта). Эксперимент проводили в трех повторах.

Протеомные данные

Анализ полученных нами ранее протеомных данных [13], депонированных в ProteomeXchange Consortium (адрес доступа http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=PXD030700), производили с помощью ПО  MaxQuant (v1.6.3.4). Было проанализировано по три биологических повтора для каждой линии (клетки линии HaCaT дикого типа и с нокаутом гена mutTP53) в трех технических повторах.

Определение уровня экспрессии генов

РНК выделяли с помощью набора RNeasy Kit (QIAGEN; США) согласно протоколу производителя. Количество полученной РНК измеряли на приборе NanoDrop 2000c (Thermo Scientific; США). Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор MMLV RT kit («Евроген»; Россия) по стандартному протоколу, добавляя в реакцию по 1 мкг РНК. qPCR проводили, используя qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген»; Россия). Для каждого гена и каждого образца реакцию проводили в трех повторах. В качестве референсного гена использовали GAPDH. Используемые праймеры представлены в таблица.

Формирование многослойного кожного эквивалента

Для формирования органотипической модели клетки HaCaT дикого типа (WT), с нокаутом mutTP53 или нормальные кератиноциты человека (NHK) (выращивали в поликарбонатных мембранных вставках Millipore PIHP01250 с диаметром пор 0,4 мкм в формате 24-луночного планшета. Мембранные вставки помещали в лунки планшета, после чего вносили в апикальный отдел по 700 тыс. клеток линии HaCaT (дикого типа или клеток с нокаутом mutTP53) и 700 мкл среды Submerse (EpiLife (Gibco; США), содержащей 1% GlutaMAX (Gibco; США), 1% антибиотика/антимикотика (Gibco; США), 1% HKGS (Gibco; США), 10 нг/мл EGF (Gibco; США) и 1,5 мМ CaCl₂ (Sigma; США)) в базолатеральный отдел. Клетки инкубировали в течение 24 ч (37 °C, 5% СО₂) для прикрепления клеток и активации пролиферации. Спустя 24 ч полностью удаляли среду из апикального отдела и заменяли среду в базолатеральном отделе на 450 мкл среды для культивирования на границе раздела фаз (ALI-medium: Submerse + 10 нг/мл KGF (Gibco; США) и 1 мМ L-аскорбиновой кислоты (Sigma; США)). Клетки культивировали в течение 10 суток, ежедневно заменяя среду на свежую.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Полученные клеточные модели фиксировали в 4%-м формалине. Подвергали стандартной гистологической обработке: дегидратировали в серии спиртов с возрастающей концентрацией, заключали в парафиновые блоки, срезы изготавливали с помощью микротома.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки инкубировали с первичными антителами к KRT5 (ab52635; Abcam, США), CK10 (ab9025; Abcam, США) и вторичными Alexa Fluor 488-конъюгированными (ab150105; Abcam, США) или Texas Red-конъюгированными (ab6793; Abcam, США) антителами. Все препараты подвергали окрашиванию одновременно с использованием единого набора реактивов (разведений антител и буферов).

Определение величины электрического сопротивления

Для определения величины электрического сопротивления (TEER) моделей кожи, полученных на основе разных клеток, использовали вольтметр EVOM (World Precision Instruments, Inc.; США). Для этого заменяли питательную среду в базальном отсеке на 0,9% NaCl, и в апикальный отсек мембранной вставки добавляли 300 мкл 0,9% NaCl. Затем помещали электроды в апикальный и базолатеральный отсеки мембранной вставки и измеряли уровень сопротивления (TEER) мембранной вставки с культивируемыми клетками (кожного эквивалента).

Анализ данных

Полученные результаты обрабатывали с помощью языка программирования для статистической обработки данных R [14]. Различие величин анализируемого параметра между группами определяли с помощью t-критерия с поправкой Бенджамини‒Хохберга на множественное сравнение. Статистически значимыми различия считали при p <0,05. Данные представлены в виде M ± m.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании пула активно пролиферирующих клеток по включению Edu (аналога Brdu) в ДНК было определено, что HaCaT дикого типа пролиферируют активнее, чем клетки с нокаутом mutTP53. В S-фазе у клеток дикого типа (HaCaT WT) наблюдалось в среднем 45,6 ± 3,2% клеток, в то время как у клеток с нокаутом mutTP53 (HaCaT dp53) 34,1 ± 2,9% (рис. 1). Эти данные также подтверждаются результатами разбавления метки CellTracer после 24 ч культивирования.

В Scratch-тесте закрытие дефекта линиями NHK и WT HaCaT происходило практически с одинаковой скоростью. На третьи сутки осталось 54% ± 9% и 66% ± 5% от первоначальной площади дефекта для NHK и WT HaCaT соответственно. В то время как для HaCaT с нокаутом mutTP53 наблюдалось значительное увеличение скорости закрытия дефекта и на третьи сутки осталось 12% ± 3% (p<0,05 по сравнению с соответствующей группой WT HaCaT) от его первоначальной площади (рис. 2А,Б).
Ранее было проведено сравнительное панорамное протеомное исследование клеток HaCaT дикого типа и с нокаутом гена mutp53 [13]. При анализе данных было идентифицировано 2080 белков по двум или более пептидам (исключены потенциальные контаминанты, белки, идентифицированные по одному сайту, ложноположительные определения). Из идентифицированных белков 27 имели достоверно различную экспрессию между анализируемыми линиями (FDR<0,05). Наибольший интерес представляет изменение экспрессии белков LAMC2, LAMB3: она была значительно выше в клетках с нокаутом mutTP53 (в 4,95 и 4,58 раз соответственно).
Данные протеомного исследования в отношении LAMC2 подтверждают результаты ПЦР-РВ (рис. 2): экспрессия LAMC2 была значительно выше в клетках с нокаутом mutp53 (9,96 ± 1,92, p<0,05). В то время как достоверных различий в экспрессии гена LAMB3 в анализируемых линиях не зафиксировано.

При культивировании 3D-культур все три линии образовывали многослойный кожный эквивалент (рис. 3А). Однако стратификация, типичная для клеток нормального эпидермиса человека, и образование рогового слоя выявлены только для нормальных кератиноцитов (NHK).
В органотипической модели эпидермиса из нормальных кератиноцитов человека (NHK) присутствовал хорошо выраженный роговой слой.
В органотипической модели эпидермиса из кератиноцитов HaCaT дикого типа (WT) и HaCaT с нокаутом mutTP53 четкой стратификации клеток и образования рогового слоя не наблюдалось. Экспрессию KRT5 наблюдали во всех слоях, она была сопоставимой (рис. 3А).
При измерении трансэпителиального электрического сопротивления в органотипической модели эпидермиса из нормальных кератиноцитов наблюдалось его возрастание на протяжении всего периода наблюдения.
Органотипические модели эпидермиса из разных типов клеток различались как по максимальным значениям трансэпителиального сопротивления, так и по его динамике в течение пяти дней (рис. 3Б).
Наибольшее значение трансэпителиального сопротивления (TEER) обнаружено у моделей эпидермиса из нормальных кератиноцитов (NHK) — 5712 ± 146 Ом·см². У моделей из кератиноцитов линии HaCaT дикого типа и с нокаутом mutTP53 значение TEER было ниже почти в 5 раз: 964 ± 82 и 1088 ± 91 соответственно (p<0,05 по сравнению с клетками NHK).
Быстрее всего трансэпителиальное сопротивление возрастало в органотипической модели эпидермиса из нормальных кератиноцитов человека со второго по четвертый день, с дальнейшим выходом на плато. Величина данного показателя в моделях эпидермиса из кератиноцитов линии HaCaT дикого типа или с нокаутом mutTP53, по сравнению с моделью из NHK, имело меньшее значение и выходило на плато уже на вторые сутки.
Увеличение трансэпителиального потенциала связывают с образованием межклеточных контактов и стратификацией эпителия с образованием рогового слоя [15], который наблюдался в модели эпидермиса из нормальных кератиноцитов и отсутствовал в моделях из кератиноцитов HaCaT вне зависимости от наличия нокаута mutTP53 (рис. 3А).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что мутантная форма p53 в клетках HaCaT ассоциирована с повышенной скоростью роста и пролиферации клеток, что было подтверждено экспериментально более ранними исследованиями [5], а также неспособностью клеток к нормальной дифференцировке с образованием полноценного рогового слоя.
Согласно данным сравнительного протеомного исследования первичных кератиноцитов человека и кератиноцитов линии HaCaT, одним из наиболее заметных отличий клеток является значительно сниженная в клетках HaCaT экспрессия субъединиц комплекса ламинина-5: цепей α3, β3 и γ2 (LAMA3, LAMB3, LAMC2) [16]. Обсуждая полученные результаты, авторы указанной работы сделали предположение, что эта особенность определяет дефектность программы дифференцировки клеток HaCaT.
Ламинины представляют собой основной компонент внеклеточного матрикса и играют важную роль в клеточной адгезии, дифференцировке, передаче сигнала [17]. Комплекс ламинин-5 необходим для стабилизации контактов между эпидермисом и дермой за счет связывания с интегринами α3β1, α6β4 и коллагеном VII типа. Также ламинин-5 играет важную роль при миграции клеток. Показано, что снижение экспрессии гена ламинина-5 в кератиноцитах приводят к снижению их адгезии и нарушению регенерации эпидермиса [18]. Однако повышение экспрессии субъединиц LAMB3 и LAMC2 часто отмечают при онкологических процессах. В результате, опухолевые клетки характеризуются более высокой скоростью миграции и инвазивностью [19].

Согласно полученным нами данным, нокаут гена mutТР53 в клетках HaCaT действительно приводил к увеличению экспрессии LAMB3 и LAMC2 (данные протеомного исследования клеток). Стоит, однако, отметить, что скорость восстановления дефекта в скрэтч-тесте у нормальных кератиноцитов и клеток HaCaT дикого типа на третий день после повреждения не имела достоверных различий, в то время как у клеток с нокаутированным mutTP53 данный показатель был значительно выше. Высокую скорость заполнения дефекта в скрэтч-тесте клетками HaCaT с нокаутом mutТР53 следует связывать именно с их повышенной миграционной активностью, а не интенсивностью пролиферации, которая в данных клетках была существенно ниже, чем в клетках HaCaT дикого типа.
По-видимому, наличие мутаций в гене ТР53 не влияет значительно на его способность регулировать процессы миграции, в то время как при его инактивации (нокауте), миграционная способность клеток значительно возрастает, в том числе, в сравнении с нормальными кератиноцитами человека, в результате чего клетки HaCaT с нокаутированным mutTP53 приобретают черты клеток с «проканцерогенным фенотипом».
Отметим также, что увеличение экспрессии ламинина-5 в результате нокаута гена mutTP53 никак не сказалось на способности кератиноцитов линии HaCaT образовывать полноценный стратифицированный эпителий в органотипической модели эпидермиса. Это выражалось в отсутствии сформированного рогового слоя и низком уровне трансэпителиального сопротивления (TEER), сопоставимыми с таковыми у клеток дикого типа.
Таким образом, полученные нами данные подтверждают регулирующую роль мутантного p53 в клетках HaCaT в отношении экспрессии ламинина 5, но не позволяют связать низкий уровень его экспрессии с нарушением программы дифференцировки данных клеток.

ВЫВОДЫ

Мутантный TP53 в клетках HaCaT является негативным регулятором экспрессии ламинина 5. Нокаут гена mutTP53 приводит к увеличению миграционной активности клеток HaCaT, но не способствует нормализации программы дифференцировки. Полученные данные дополняют сведения о функциональных особенностях мутантного TP53 в клетках НaСaТ.