Циклин-зависимая киназа CDK8 и ее паралог CDK19 не регулируют напрямую смену фаз клеточного цикла и относятся к так называемым «транскрипционным киназам», регулирующим транскрипцию генов [1]. Механизмы такого регулирования, однако, разнообразны. С одной стороны, CDK8/19 в составе комплекса с циклином С, MED12 и MED13 напрямую фосфорилируют некоторые транскрипционные факторы, такие как внутриклеточный домен NOTCH [2] или STAT1 [3]. С другой стороны, вместе эти четыре белка образуют киназный модуль комплекса Mediator, регулирующего экспрессию генов путем связывания областей промотора и энхансера [1]. И, хотя in vitro было показано, что CDK8/19 могут, как транскрипционные киназы CDK7 и CDK9, фосфорилировать C-концевой участок РНК-полимеразы II, что является важным событием в процессе перехода к стадии элонгации, в клетке этот механизм, по-видимому, не играет значительной роли [4]. В то же время показано, что CDK8/19 играют важную роль в экспрессии определенных генов, особенно активации экспрессии ранее инактивированных генов [5–7], а также ключевых онкогенов, например c-Myc [8, 9] и генов Wnt/β- катенинового пути [10]. В некоторых случаях обнаружена корреляция уровня экспрессии с присутствием CDK8/19 в энхансерах и супер-энхансерах соответствующих генов [11]. Однако, несмотря на важную фундаментальную роль CDK8/19, а также их потенциал как терапевтических мишеней, конкретный молекулярный механизм, обусловливающий зависимость уровня экспрессии определенных генов от CDK8/19, остается неизвестным.

В последнее время появляются работы, в которых сравниваются эффекты химического ингибирования и генетической инактивации и показано, что в определенных моделях генетическая инактивация имеет намного более выраженные эффекты [7, 12, 13]. Из этого должно следовать существование у CDK8/19 киназа-независимых механизмов действия. Подобное сравнение, однако, не всегда точно даже in vitro ввиду ограниченной селективности и эффективности ингибиторов, и практически невозможно in vivo ввиду особенностей биораспределения и метаболизма химических ингибиторов, а также сложностей с проникновением веществ через гематоэнцефалический и гематотестикулярный барьеры.

Цель данной работы — получение трансгенных мышей с возможностью тканеспецифичной индуцируемой экспрессии мутантой киназнонегативной формы CDK8(D173A) для последующего выявления возможных киназа-независимых механизмов действия CDK8/19.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструкция

Для проведения трансгенеза использовали вектор pKB2, отличающийся от использованного ранее вектора pKB1 [14, 15] отсутствием репортерного гена. Открытую рамку считывания амплифицировали с помощью полимеразы KapaHiFi (Kapa Biosystems; США) и праймеров P1 и P2 (здесь и далее все олигонуклеотиды, последовательности которых приведены в табл. 1, синтезированы компанией «Евроген», Россия) c кДНК. кДНК получали путем обратной транскрипции с использованием ревертазы RevertAid (Thermo Scientific; США) на основе РНК, выделенной из головного мозга мыши с помощью ExtractRNA («Евроген»; Россия). При амплификации к открытой рамке считывания были добавлены рестриктные сайты AgeI на 5'-конце и MluI на 3'-конце для последующего переноса в финальный вектор, а также консенсусная последовательность Козак. Амплифицированную рамку считывания клонировали в вектор CloneJet (Thermo Scientific; США) и отсеквенировали. Мутацию c.A518C внесли методом сайт-направленного мутагенеза в процессе полимеразной цепной реакции с предварительно фосфорилированными праймерами P3 и P4. Наличие целевой мутации и отсутствие дополнительных были подтверждены с помощью секвенирования. Затем ОРС полученного варианта гена mCdk8kd (kinase-dead) переклонировали по сайтам AgeI и MluI (все эндонуклеазы рестрикции производства Thermo Scientific, США) в вектор pKB2. Конструкцию линеаризовали по сайтам SalI и NotI, разделили на электрофорезе, выделили из геля набором Cleanup Mini («Евроген»; Россия), дополнительно очистили на спин-колонке с нейлоновым фильтром 0,22 мкм Corning Costar Spin-X (Corning; США) и развели в буфере для микроинъекций (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА) до концентрации ДНК 2 нг/мкл.

Содержание мышей

Эмбрионы получали от 30 неполовозрелых (12–13 г веса) самок (F1 гибриды CBA × C57BL/6) и аналогичных самцов возрастом 6–8 недель (питомник «Столбовая»; Россия). В качестве реципиентов и кормилиц использовали аутбредных мышей CD1 (питомник «Столбовая»; Россия). Мышей содержали в виварии ЦКП ИБГ РАН в условиях постоянного доступа к воде и корму. Температуру воздуха поддерживали в диапазоне 22–24 °C, световой цикл (день/ ночь) — 14/10 ч.

Микроинъекции, пересадка эмбрионов

Микроинъекции и пересадку эмбрионов производили как описано ранее [16]. На 19-й день после пересадки эмбрионов реципиентам проводили операцию кесарева сечения, а новорожденных мышат подсаживали кормилицам.

Генотипирование, измерение копийности

Генотипирование животных производили по протоколу, использованному нами ранее [14]. У трансгенных животных методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) одновременно детектировали наличие STOP- кассеты (праймеры P5 и P6) и терминатора (праймеры P7 и P8), входящих в состав вектора pKB2. Копийность встраивания конструкции определяли путем сравнения с генами с известной различной копийностью (HPRT, HbA, H3C7) по результатам ПЦР в реальном времени [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения трансгенных мышей с возможностью индуцируемой и тканеспецифичной экспрессии киназнонегативного варианта CDK8 нами была создана на основе вектора pKB2 генетическая конструкция, содержащая открытую рамку считывания гена mCdk8 c заменой c.A518C в ДНК (соответственно в белке — D173A) [17]. Помимо инсулятора и терминаторов, предназначенных для защиты от эффекта положения при встраивании, использованный вектор содержит CAG-промотор и STOP- кассету, фланкированную LoxP-сайтами, разделяющую промотор и ОРС. Встроенная таким образом STOP- кассета значительно снижает уровень транскрипции трансгена и делает невозможным дальнейшую трансляцию транскрипта [14].

Линеаризованная конструкция была микроинъецирована в зиготы, из которых 487 выжило и было пересажено реципиентам. В результате родилось 14 мышат, шесть из которых оказались трансгенными. Наличие трансгена подтверждалось у всех рожденных животных ПЦР (рис. 1). Численное описание результатов работ по получению трансгенных животных представлено в табл. 2.

Из шести первичных трансгенных животных два умерли, не достигнув половозрелости, а четыре дали потомство в результате скрещивания с мышами линии C57BL/6J. В настоящий момент получено четыре независимых сублинии: 369, 372, 375, 376. При случайном встраивании в геном возможно образование и последующее включение в хромосомы мультимеров конструкции, а от количества мономеров, в свою очередь, может зависеть уровень экспрессии. Более того, поскольку встраивание может происходить независимо в отдельных бластомерах, животные F0 могут быть мозаичными, неся различное число копий конструкции в разных клетках. Мы определили среднюю копийность встраивания для F0 и копийность для полученных сублиний (рис. 2). Полученные значения могут быть нецелочисленными ввиду использования экспоненциальной аппроксимации при определении копийности и усреднении их между клетками, однако в действительности это связано с погрешностью измерений и, начиная с поколения F1, копийность принимает постоянные целые значения. Для дальнейшего размножения на уровне F1 были выбраны две сублинии с копийностью, приблизительно равной 2, что соответствует копийности большинства генов в геноме с диплоидным набором хромосом.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нами получена линия мышей, способная к индуцируемой и тканеспецифичной экспрессии киназнонегативной формы mCDK8: шесть животных F0, четыре из которых оставили потомство, а два к настоящему моменту стали основателями сублиний. Эффективность получения трансгенов составила при этом 50% (6 из 12), и в полученных животных F1 обнаружены дальнейшее расщепление по сравнению с F1, связанный с мозаичностью F0, и большой разброс копийности встраивания конструкции от 1 до 17. Это позволило нам выбрать для дальнейших исследований линии с копийностью, наиболее приближенной к естественной.

Ряд исследований рассматривают последствия генетического нокаута CDK8 и/или CDK19 [18–20], однако используемые в них модели не позволяют сделать окончательный вывод о том, какую роль в наблюдаемых фенотипах играет отсутствие белков CDK8/19 и невозможность сборки киназного модуля комплекса Mediator, а какую прекращение соответствующего фосфорилирования. Более того, применение ингибиторов CDK8/19 у животных привело к эффектам, отличающимся от описанных у нокаутных животных [21]. Полученная нами линия животных — подходящий инструмент для разделения киназа-зависимых и киназа-независимых функций CDK8/19.

ВЫВОДЫ

В исследовании были получены трансгенные мыши, предоставляющие возможность тканеспецифичной и индуцируемой экспрессии киназнонегативной формы циклин-зависимой киназы CDK8. Впоследствии, после скрещивания с мышами CDK19^–/–, CDK8^fl/fl, а также различными активаторами, будут получены животные, в которых CDK8 и CDK19 дикого типа можно будет убиквитарно или тканеспецифично заменить на киназнонегативный вариант. В экспериментах с такими животными могут быть обнаружены киназа-независимые механизмы действия CDK8/19.