ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Однодоменное антитело для связывания консервативного эпитопа рецептор-связывающего домена белка Spike коронавируса SARS-CoV-2
Информация об авторах
1 Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, Россия
2 Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия
Для корреспонденции: Сергей Владимирович Тиллиб
ул. Вавилова, д. 34/5, г. Москва, 119334, Россия; ur.ygoloibeneg@billit moc.liamg@billit.iegres
Информация о статье
Финансирование: работа была поддержана Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (договор № 075-15-20211086, контракт № RF––193021X0015).
Благодарности: М. В. Рутовской из института Проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН за помощь в работе по иммунизации верблюда.
Вклад авторов: П. О. Воробьев — проведение молекулярного клонирования и последующей наработки рекомбинантных белков (антигенов для иммунизации); С. В. Тиллиб — разработка общей идеи и реализация этапов иммунизации, способа получения и первичного анализа полученных однодоменных антител, написание статьи.
Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом Института проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН (протокол № 17 от 11 февраля 2018 г.); работы с животными проводили в строгом соответствии с рекомендациями Национального стандарта Российской Федерации ГОСТ Р 53434–2009.
Статья получена: 19.12.2022
Статья принята к печати: 25.01.2023
Опубликовано online: 24.02.2023
|
Рис. 1. Схема выравненных аминокислотных последовательностей RBD трех мутантных вариантов S-белка коронавируса SARS-CoV-2 (исходный RBD Wuhan, RBD delta и наиболее мутировавший вариант — RBD omicron). Выделены серым места мутаций аминокислотных остатков. Жирной линией обозначено положение рецептор-связывающего мотива (RBM), который непосредственно взаимодействует с ACE2-рецептором
Рис. 2. Электрофореграмма SDS-полиакриламидного геля с наработанными (с помощью клонированной кодирующей последовательности) и затем очищенными рекомбинантными RBD трех штаммов (6 — RBD delta, 7 — RBD Wuhan, 8 — RBD omicron). Слева — дорожка с маркерными белками (Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, размером 10–250 кДа). Для определения количества наработанного белка в дорожках 2–5 нанесены разные количества маркерного белка BSA (в количестве 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мг соответственно)
Рис. 3. Электрофореграмма SDS-полиакриламидного геля с наработанным рекомбинантным S-белком (Spike) SARS-CoV-2 (Wuhan). Белок выявляли в цитоплазматической фракции (1) и во фракции осадка (2). Справа нанесен маркер молекулярного веса полипептидов
Рис. 4. Результат иммуноферментного анализа связывания девяти отобранных вариантов нанотел (aRBD-1 – aRBD-8 и aRBDce1) с иммобилизованными рекомбинантными белками, соответствующими (слева направо) Spike, RBD Wuhan (W-RBD), RBD delta (Δ-RBD) и Omicron RBD, и с контрольной лункой, без антигена, но блокированной с 1% БСА (как и все другие лунки). Величины оптической плотности отражают эффективность связывания нанотел. Даны средние значения трех независимых экспериментов с обозначением стандартного отклонения
Рис. 5. Результат иммуноферментного анализа для выявления конкуренции за связывание с иммобилизованым в лунке RBD Wuhan отобранных вариантов нанотел и вирус-нейтрализующего моноклонального антитела XR19 («Хема»; Россия). Величины оптической плотности отражают эффективность связывания нанотел. Даны средние значения трех независимых экспериментов с обозначением стандартного отклонения
Рис. 6. Нанотело аRBDсе1. А. Аминокислотная последовательность нанотела, выведенная из проклонированной адаптированной кодирующей последовательности ДНК. В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к C-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфичного узнавания нанотелом аRBDсе1 консервативного эпитопа RBD S-белка коронавируса. Серым цветом выделены присоединенные к С-концу нанотела линкерный линейный участок, HA-таг и Нis-таг. Б. Электрофореграмма 14%-го SDS-полиакриламидного геля с наработанным и затем очищенным адаптированным нанотелом аRBDсе1
Таблица 1. Олигонуклеотиды (праймеры) для точечного мутагенеза
