Проксимальная спинальная мышечная атрофия 5q (5q-СМА) — одно самых распространенных аутосомнорецессивных нервно-мышечных заболеваний у детей, которое характеризуется утратой двигательных нейронов в передних рогах спинного мозга, что приводит к прогрессирующему поражению проксимальных отделов скелетной мускулатуры. Этиология заболевания связана с аберрациями гена выживаемости мотонейронов SMN1 (от англ. survival motor neuron 1 gene), локализованного в 5q13-регионе 5-й хромосомы. Встречаемость заболевания составляет один случай на 6000–10 000 новорожденных [1]. Быстрая и необратимая потеря двигательных нейронов при тяжелых формах 5q-СМА начинается в течение первых 3 месяцев жизни [2]. Отложенная молекулярно-генетическая диагностика 5q-СМА приводит к несвоевременному лечению и повышенному риску тяжелой инвалидизации пациента.

В 95% случаев 5q-СМА возникает в результате гомозиготной потери гена SMN1 и последующего снижения синтеза белка выживаемости мотонейронов. Оставшиеся случаи заболевания приходятся на компаунд-гетерозиготы, когда потеря гена SMN1 на одном аллеле сочетается с точечными мутациями гена SMN1 другого аллеля [3]. К настоящему времени спинальная мышечная атрофия у компаунд-гетерозигот не диагностируется ни в одной неонатальной программе мира [4]. Распространенность носительства гетерозиготной потери гена SMN1 в российской популяции составляет 1 : 36 [5]. Помимо вышеперечисленных аберраций, часто в общей популяции встречается дупликация гена SMN1, однако данный генотип не приводит  к 5q-СМА [1]. Высокая частота встречаемости изменения копийности SMN1 обусловлена генетической нестабильностью данного региона вследствие наличия инвертированной последовательности функциональных генов SMN1, SERF1A, NAIP, GTF2H2A и соответствующих им центромерных копий  SMN2, SERF1B, NAIP∆5, GTF2H2B [1]. Гомолог гена SMN1, ген SMN2, тоже состоит из девяти экзонов и кодирует белок выживаемости мотонейронов. Гены различаются между собой по пяти нуклеотидам в диапазоне с 6-го интрона до 8-го экзона. Однако ключевая замена цитозина на тимин в 7-м экзоне гена SMN2 (c.840C > Т) приводит к разрыву сайта связывания с экзонным энхансером сплайсинга и образованию сайта связывания с экзонным сайленсером. В результате вышеуказанных изменений происходит исключение 7-го экзона у 90% транскриптов SMN2, а синтезированный белок SMN∆7 становится функционально неполноценным и нестабильным, что и обусловливает его быструю деградацию убиквитин-протеасомной системой [1]. Стоит отметить, что основным источником белка выживаемости мотонейронов является ген SMN1, а ген SMN2 служит модификатором течения заболевания 5q-СМА вследствие сохранения 10% неизмененных транскриптов SMN2 и увеличения числа копий гена SMN2 [6]. Различают несколько клинических форм 5q-СМА. СМА типа 0 характеризуют отсутствие гена SMN1 и наличие одной копии гена SMN2. Как правило, данная форма приводит к дебюту заболевания во внутриутробном периоде. Болезнь Верднига–Гоффмана (СМА типа I) развивается у пациентов в возрасте до 6 месяцев, имеющих чаще всего 2–3 копии гена SMN2, и является наиболее частой разновидностью, на которую приходится приблизительно половина случаев заболевания 5q-СМА [3, 7]. У младенцев с данной формой 5q-СМА отсутствуют симптомы заболевания при рождении, но впоследствии у них наблюдается задержка развития двигательных функций, и возникают трудности с кормлением в течение первого полугода жизни. Пациенты со СМА I типа не способны сидеть самостоятельно. При СМА II типа (болезнь Дубовица), которая является менее тяжелой формой заболевания, чаще всего можно наблюдать от 2 до 4 копий гена SMN2. Такие дети в возрасте от 6 до 18 месяцев могут самостоятельно сидеть, однако никогда не ходят, но большинство этих пациентов доживают до зрелого возраста.  При СМА III типа (болезнь Кугельберга–Веландер) число копий гена SMN2 чаще всего варьирует от 3 до 5. При данной форме дебют СМА происходит у пациентов в возрасте с 18 месяцев, и такие пациенты способны самостоятельно сидеть и стоять и в какой-то момент жизни достигают возможности самостоятельно ходить. СМА IV типа считают самой легкой и наименее распространенной формой 5q-СМА с дебютом во взрослом возрасте [3, 7].

Как уже было сказано, в патогенезе заболевания основную роль играет утрата гена SMN1, однако различают несколько форм его потери в виде истинной делеции, конверсии гена, формировании гибридных (химерных) SMN1/SMN2-структур, а также потери только нескольких экзонов гена SMN1 (частичная делеция). Под классической делецией понимают делецию, включающую 7-й и 8-й экзоны гена SMN1 без реципрокного увеличения числа копий гена SMN2. Частичная делеция характеризуется изолированной потерей 7-го или 8-го экзона на одном из аллелей гена SMN1 при сохранении числа копий данных экзонов в гене SMN2 [8]. При конверсии осуществляется реципрокное увеличение количества копий гена SMN2 [9].  Образование химерных генов SMN1/SMN2, в которых имеются участки, принадлежащие как гену SMN1, так и псевдогену SMN2, и для которых характерно неравное соотношение 7-го и 8-го экзонов, тоже является одним из механизмов потери гена SMN1 [10]. Следует отметить, что у пациентов с 5q-СМА можно наблюдать как отдельные формы гомозиготной потери гена SMN1, так и комбинированные случаи.

С точки зрения молекулярного патогенеза заболевания восстановление уровня белка SMN у пациентов с 5q-СМА является наиболее обоснованным подходом лечения. На экспериментальных моделях было показано, что выключение синтеза белка выживаемости мотонейронов по-разному влияет на  их продолжительность жизни: чем раньше происходит выключение, тем хуже выживаемость [11]. Более того, раннее восполнение белка SMN приводит к значительному увеличению выживаемости в исследованиях на экспериментальных мышиных моделях [12].  Упомянутые исследования позволили предположить возможную высокую клиническую эффективность пресимптоматической терапии у новорожденных, у которых обнаружена патологическая аберрация в гене SMN1. У новорожденных с двумя или тремя копиями гена SMN2, у которых начало лечения нусинерсеном во II фазе исследования NURTURE было начато на доклиническом этапе, были продемонстрированы более высокие показатели двигательных функций по сравнению с пациентами, у которых лечение было инициировано на симптоматической стадии 5q-СМА [13]. Другое многоцентровое клиническое исследование III фазы SPR1NT (онасемногеном абепарвовеком) было посвящено изучению эффективности и безопасности применения препарата также до появления клинических симптомов у детей с биаллельной потерей гена SMN1 и тремя копиями гена SMN2. Результаты исследования были однозначны: все участники исследования достигли этапов моторного развития, характерных для здоровых детей, не имеющих патологической аберрации SMN1 [14]. Имеющаяся терапия и возможность применения пресимптоматического лечения в настоящее время оправдывают проведение скрининга новорожденных на 5q-СМА. Такие страны, как Австралия, Бельгия, Канада, Германия, Италия, Япония, Норвегия, Нидерланды, Польша и Тайвань, а также 46 штатов в США ввели обязательный скрининг новорожденных на 5q-СМА. В Российской Федерации обязательный скрининг на 5q-СМА для всех новорожденных был запущен в 2023 г. [15].

«Золотым стандартом» диагностики 5q-СМА является мультиплексная лигазная цепная реакция (MLPA), однако данный метод неприменим в качестве скринингового в связи с трудоемкостью и высокой стоимостью [16, 17]. Наиболее приемлемы для скрининга различные модификации метода полимеразной цепной реакции с детекцией сигнала в режиме реального времени (ПЦР-РВ), выявляющие гомозиготную потерю 7-го экзона гена SMN1. Это подтверждено в ряде больших работ и метаанализов [18–20]. В связи с высокой клинической актуальностью ранней диагностики 5q-СМА, а также началом с 2023 г. обязательного неонатального скрининга в РФ на данное заболевание существует потребность в диагностических молекулярно-генетических тестах, которые позволяли бы с высокой точностью выявлять все возможные формы гомозиготной потери гена SMN1. Следует также отметить, что одним из наиболее важных требований к неонатальному скрининговому тесту на СМА является возможность выявления гомозиготной потери гена SMN1 в образцах сухих пятен крови (DBS, от англ. dried blood spot).

Российская компания «ДНК-технология» выпустила новый набор, основанный на методе ПЦР-РВ, для молекулярного скрининга на СМА у новорожденных. Однако крайне необходима его расширенная апробация для определения возможности выявления всех форм потери гена SMN1, которые ранее определяли с помощью метода MLPA.

Целью работы была сравнительная оценка возможности определения гомозиготной потери экзона 7 гена SMN1 с помощью теста на основе ПЦР-РВ с методом MLPA у пациентов с 5q-СМА, а также c различными изменениями числа копий гена SMN1. 

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов, методика и выделение ДНК

Образцы ДНК, выделенные из цельной крови (группа 1)

Для оценки возможности детекции различных типов гомозиготной потери гена SMN1 была собрана когорта, которая состояла из 206 образцов из Биобанка НМЦ Минздрава России по молекулярной медицине Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И. П. Павлова (Санкт-Петербург, Россия). Пациенты с клиническим подозрением на 5q-СМА были направлены в лабораторию ПСПбГМУ им. И. П. Павлова с 2019 по 2021 г. Геномную ДНК выделяли из периферической крови с помощью набора ExtractDNA Blood & Cells (Evrogen; Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию полученной ДНК доводили до конечной концентрации 50 нг/мкл. Количество копий генов SMN1 и SMN2 оценивали с помощью набора MLPA (P060, MRC-Holland; Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя.

Все образцы были разделены на семь подгрупп в соответствии с количеством копий генов SMN1 и SMN2. Подгруппа 1 «Норма» (54 образца): две копии генов SMN1 и SMN2 — так называемый «эталонный генотип». Подгруппа 2 «Делеция» (девять образцов): отсутствие гена SMN1 без увеличения числа копий SMN2. Подгруппа 3 «Конверсия» (47 образцов): отсутствие гена SMN1 при увеличении числа копий SMN2. Подгруппа 4 «Гибрид» (девять образцов): гомозиготная делеция экзона 7 и гетерозиготная делеция экзона 8 гена SMN1 с увеличением числа копий экзона 7 SMN2. Подгруппа 5 «Носитель» (51 образец): одна копия гена SMN1. Подгруппа 6 «Дупликация» (23 образца): 3 копии гена SMN1. Подгруппа 7 «Другое» (13 образцов) содержала различные комбинации количества копий генов SMN1 и SMN2, которые не соответствовали критериям других подгрупп (рисунок).

Образцы ДНК, выделенные из DBS (группа 2)

Для подтверждения возможности обнаружения гомозиготной потери гена SMN1 в ДНК, выделенной из образцов сухих пятен крови, группа из 135 пациентов, кровь которых транспортировалась в высушенном состоянии на мембране, была взята из Биобанка НМЦ Минздрава России по молекулярной медицине Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И. П. Павлова (Санкт-Петербург, Россия). Пациенты с клиническим подозрением на 5q-СМА были направлены в лабораторию ПСПбГМУ им. И. П. Павлова с 2019 по 2021 г. Геномная ДНК была выделена из сухих пятен крови с использованием PREP-CITO DBS (ДНК-Технология; Россия) в соответствии с инструкциями производителя. У всех пациентов количество копий генов SMN1 и SMN2 оценивали с помощью метода MLPA (P060, MRC-Holland; Нидерланды) в соответствии с протоколом для сухих пятен крови.

Все образцы были разделены на шесть подгрупп: «Норма», «Делеция», «Конверсия», «Гибрид», «Носитель», «Другое» (табл. 1).

Анализ мультиплексной лигазной цепной реакции (MLPA)

Исследование MLPA проводили с использованием набора P060 (MRC-Holland; Нидерланды)  в соответствии с инструкциями производителя для ДНК, выделенной и очищенной из цельной крови (группа 1) и из сухих пятен крови (группа 2). Набор содержит 17 эталонных зондов и четыре специфичных зонда, связывающихся с последовательностями в экзонах 7 и 8 генов SMN1 и SMN2. Полученные продукты реакции MLPA анализировали с помощью генетического анализатора ABI 3500 (Thermo Fisher Scientific; США). Относительную высоту пика каждого образца рассчитывали и сравнивали с нормальным контролем с помощью приложения для анализа MLPA GeneMarker (SoftGenetics; США). Наличие изменения количества копий генов SMN1/SMN2 оценивали в соответствии с инструкцией к набору MLPA.

НеоСкрин SMA/TREC/KREC

Тест НеоСкрин SMA/TREC/KREC был проведен для всех образцов из групп 1 и 2. Набор НеоСкрин SMA/TREC/KREC (ДНК-Технология; Россия) предназначен для выявления гомозиготной потери экзона 7 гена SMN1 и оценки уровней Т-рецепторных эксцизионных колец рецепторов (TREC) и каппа-делеционных рекомбинационных эксцизионных колец (KREC) в сухих пятнах крови и цельной крови. Метод основан на амплификации TREC, KREC, экзона 7 гена SMN1 и фрагмента нормализующего гена LTC4S (или эндогенного внутреннего контроля (IC), однокопийного геномного локуса гена лейкотриенсинтазы C4) методом мультиплексной ПЦР. Использование нескольких флуоресцентных красителей позволяет одновременно регистрировать результаты различных реакций амплификации, протекающих в одной и той же пробирке. В табл. 2 показаны каналы обнаружения продуктов ПЦР-реакции.

Анализ результатов теста НеоСкрин SMA/TREC/ KREC проводили с использованием термоциклера для детекции в реальном времени DTprime (ДНК-Технология; Россия) в соответствии с инструкциями производителя (табл. 3). Для оценки эффективности анализа в каждый цикл ПЦР включали положительный контроль (входит в набор для определения ПЦР) и отрицательный контроль.

Положительный контроль C+ № 1, содержащий ДНК– плазмиды с указанными мишенями — TREC, KREC, SMN1, IC в равной концентрации, предназначен для оценки эффективности ПЦР. Положительный контроль C+ № 2 с плазмидным эквивалентом экзона 7 гена SMN2 позволяет оценить блокирование амплификации SMN2 (контроль специфичности амплификации SMN1).

Анализ потери экзона 7 гена SMN1 основан на оценке разности циклов (∆ Cp) между Cp SMN1 (канал Hex) и IC (канал Су5) (∆Sr = Sr (Hex) – Cp (Cy5)).

Оценку гомозиготной потери экзона 7 гена SMN1 проводили в соответствии с инструкцией набора для ПЦР-детекции (выполняется автоматически программным обеспечением ПЦР-амплификатора).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основанный на ПЦР скрининговый тест был использован для оценки наличия у 341 образца гомозиготной потери гена SMN1. Во всех образцах количество копий генов SMN1 и SMN2 было определено с использованием эталонного метода MLPA. Результаты теста считали истинно положительными, если гомозиготную потерю экзона 7 гена SMN1 обнаруживали в образцах с 0 копиями экзона 7 гена SMN1. Наличие по меньшей мере одного экзона 7 гена SMN1, идентифицированного методом MLPA, и обнаружение сигнала SMN1 экзона 7 с помощью теста НеоСкрин SMA/TREC/KREC считали истинно отрицательными.

Результаты в группе 1 были следующими. В подгруппе 1 «Норма» 54 участника (26%) имели 2 копии экзона 7 гена SMN1, и все образцы были истинно отрицательными при скрининге набором на основе ПЦР-РВ. В подгруппе 2 «Делеция», подгруппе 3 «Конверсия», подгруппе 4 «Гибрид» все образцы были истинно положительными (n = 65; 32%). В подгруппе 5 «Носитель», состоящей из 51 участника (25%), у всех имелась единственная копия экзона 7 гена SMN1, и все участники были истинно отрицательными. В подгруппе 6 «Дупликация» все 23 образца (11%), содержащие 3 копии экзона 7 гена SMN1, были истинно отрицательными. Подгруппа 7 «Другое» состояла из 13 образцов с различным количеством экзонов генов SMN1 и SMN2. Истинно отрицательными были шесть образцов (3%), содержащие более одной копии экзона 7 гена SMN1. Одну копию гена SMN1 в подгруппе 7 содержали пять образцов, которые тоже были истинно отрицательными (2%).  И два участника не имели ни одного из экзонов 7 гена SMN1 и были, соответственно, истинно положительными (1%).  Результаты представлены в табл. 4.

В группе 2 результаты теста были следующими. В подгруппе «Норма» 99 образцов (73%) имели две копии экзона 7 гена SMN1, и все образцы были истинно

отрицательными. В подгруппе «Делеция», подгруппе «Конверсия», подгруппе «Гибрид» все образцы были истинно положительными при скрининге с помощью ПЦР-РВ (n = 18; 13,3%). Группа 2 не содержала образцов с дупликацией гена SMN1 согласно результатам анализа MLPA. В подгруппе «Носитель» все девять проб (7%) были истинно отрицательными. В подгруппе «Другие» один образец (0,7%) был истинно положительным на наличие гомозиготной потери экзона 7 гена SMN1. И восемь образцов (6%) содержали одну копию гена SMN1, и все участники были истинно отрицательными при скрининге с помощью ПЦР-РВ. Все результаты представлены в табл. 5.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Спинальная мышечная атрофия — аутосомно-рецессивное нейродегенеративное заболевание, основным клиническим проявлением которого является прогрессирующее тяжелое поражение проксимальной скелетной мускулатуры. Основная характеристика теста для выявления 5q-СМА при неонатальном скрининге — возможность детектирования всех форм потери гена SMN1 как в образцах ДНК, выделенных из цельной крови, так и образцах ДНК, полученных из сухих пятен крови.

Существуют различные методологические подходы к детекции гомозиготной потери гена SMN1, однако для неонатального скрининга на СМА лучше всего зарекомендовали себя различные модификации метода ПЦР в реальном времени [16, 21]. Это связано с их высокой эффективностью, характеризующейся крайне низким количеством ложноположительных и ложноотрицательных результатов, относительно низкой трудоемкостью и себестоимостью, а также возможностью проведения исследований по ДНК из сухих пятен крови [2, 22]. Тест основан на технологии ПЦР и детектирует гомозиготную потерю экзона 7 гена SMN1 [6].

Ген SMN1 расположен в очень нестабильном регионе генома, насыщенном повторяющимися инвертированными генами и богатым Alu-последовательностями, что обусловливает появление широкого спектра генетических изменений гена SMN1. Для подтверждения специфичности выявления гомозиготной потери гена SMN1 с помощью ПЦР-РВ в группе 1, состоящей из образцов ДНК, выделенных и очищенных из цельной крови, была отобрана гетерогенная подгруппа из 139 образцов с количеством копий гена SMN1, равным 1–3 копии (подгруппы «Норма», «Носитель», «Дупликация», 11 участников из подгруппы «Другое»). По итогам молекулярно-генетического тестирования во всех 139 образцах были получены отрицательные результаты на гомозиготную потерю гена SMN1. Это подчеркивает, что доброкачественное изменение копийности гена SMN1 не влияет на эффективность выявления гомозиготной потери гена SMN1 при скрининге.

Главной задачей неонатального скрининга на 5q-СМА является детекция случаев гомозиготной потери гена SMN1. В группе 1 все участники исследования с делецией гена SMN1, конверсией, гибридными генами, а также иными формами генотипа в количестве двух пациентов (общее количество 67) дали положительный результат в ходе скрининга на гомозиготную потерю гена SMN1. Набор продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность выявления гомозиготной потери гена SMN1. Это согласуется с рядом исследований, посвященных методологической проблеме скрининга 5q-СМА [2, 23].

Для подтверждения эффективности теста для выявления гомозиготной потери гена SMN1 в образцах ДНК, выделенных из сухих пятен крови, были отобраны образцы в группу 2. Во всех образцах из данной группы с 1–3 копиями гена SMN1 (n = 116) результаты применения теста были отрицательными на гомозиготную потерю гена SMN1. Это подчеркивает, что изменение числа копий генов SMN1 не влияет на специфичность обнаружения гомозиготной потери гена SMN1 в ДНК, выделенной из образцов сухих пятен крови. Результаты скрининга на гомозиготную потерю гена SMN1 набором, основанным на ПЦР-РВ, были положительными у всех пациентов в образцах сухих пятен крови, у которых была обнаружена гомозиготная потеря гена SMN1 с помощью метода MLPA.

Ограничением данного набора является отсутствие возможности выявления редких форм 5q-СМА, ассоциированных с гетерозиготной потерей гена SMN1 и точечными патогенными вариантами на сохранившейся копии гена (сложные или компаунд гетерозиготы). По результатам исследований, распространенность данной формы 5q-СМА составляет до 5% от всех случаев [3]. Однако нужно отметить, что на данный момент ни в одной стране мира не проводится скрининг на данный подтип заболевания [4]. При выявлении клинических признаков 5q-СМА и отрицательном результате скрининга на гомозиготную потерю гена SMN1 требуется расширенное исследование на обнаружение потери гена SMN1 на одном аллеле в сочетании с точечными мутациями гена SMN1 другого аллеля.

ВЫВОДЫ

Пилотное исследование показало, что набор на основе ПЦР-РВ способен обнаруживать гомозиготную потерю гена SMN1 в образцах ДНК, выделенных как из цельной крови, так и из сухих пятен крови. Согласно результатам настоящего исследования, набор обнаруживает также все возможные молекулярные формы гомозиготной потери гена SMN1.