ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Экспрессия фактора ATOH1 индуцирует быструю дифференцировку иПСК в нейронном направлении
Информация об авторах
1 Сколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологии, Москва, Россия
2 Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, Москва, Россия
3 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва, Россия
4 Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия
Для корреспонденции: Надежда Георгиевна Гурская
ул. Островитянова, д. 1, стр. 1, г. Москва, 117997, Россия; ur.liam@ayaksrugn
Информация о статье
Финансирование: работа была поддержана грантом РНФ № 22-14-00141.
Вклад авторов: А. И. Степанов — проведение эксперимента; Л. В. Путляева — планирование эксперимента, написание статьи; Д. А. Дидыч — дизайн и молекулярное клонирование элементов лентивирусной плазмиды, обработка рисунков; А. А. Галиакберова — культивирование клеток; Н. Г. Гурская — концепция и дизайн работы с ИПСК; К. А. Лукьянов — общее руководство исследованием.
Статья получена: 01.08.2023
Статья принята к печати: 09.09.2023
Опубликовано online: 22.09.2023
|
Рис. 1. Схема лентивирусной плазмиды TetOne-ATOH1-t2a-TagBFP2, использованной для получения стабильной клеточной линии иПСК с индуцируемой экспрессией слитого гена ATOH1-T2A-TagBFP2. Ген ATOH1-T2A-TagBFP2 находится под контролем индуцибельного доксициклин-зависимого промотора TRE3GS, содержащего семь повторов последовательности оператора tetO. Дополнительно плазмида содержит гены Tet-On 3G (трансактиватор промотора TRE3GS) и PuroR (ген устойчивости к пуромицину) под контролем конститутивных промоторов hPGK (промотор гена PGK1 человека) и SV40 соответственно. Серым обозначены стандартные элементы лентивирусных плазмид, необходимые для правильной и эффективной сборки функциональных вирусных частиц в пакующих клетках, а также обеспечивающие высокую экспрессию трансгенов (5′LTR/3′LTR — длинные концевые повторы (long terminal repeat), RRE — участок связывания вирусного белка Rev (Rev response element); cPPT/CTS — центральный полипуриновый тракт/центральная терминирующая последовательность (central polypurine tract/central termination sequence); WPRE — посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (Woodchuck hepatitis virus post–transcriptional regulatory element); SV40p(A) — терминатор транскрипции SV40 c поли(А)-сигналом; AmpR — ген устойчивости к ампициллину
Рис. 2. Экспрессия конструкции TetOne-ATOH1-TagBFP2 в иПСК. А. Схема создания стабильной клеточной линии иПСК, несущей ген ATOH1 под индуцируемым промотором TRE3G. F — флуоресцентный белок TagBFP. Б. Клетки через 24 ч после индукции экспрессии доксициклином. В. После замораживания и размораживания клеточной линии большинство клеток теряют способность к доксициклин-зависимой экспрессии (стрелкой показана единственная клетка в поле зрения, экспрессирующая яркий сигнал TagBFP2 после добавления доксициклина)
Рис. 3. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии βIII-тубулина (TUBB3) и одновременно TagBFP2 в клетках на 4-й день дифференцировки после индукции TetOne-ATOH1-t2a-TagBFP2. А. Красный сигнал — использовали антитела к TUBB3 Rabbit anti-TUBB3 (Affinity), вторичные антитела Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 (ThermoFisher). Б. Синий сигнал — флуоресценция TagBFP2
